海马神经细胞培养
实验材料：
1、所有用于细胞培养的器械、器皿剂溶液必须灭菌消毒。
2、多聚赖氨酸铺板 以磷酸盐缓冲液(PBS)或蒸馏水荣分解多聚赖氨酸（分子量为30-70KD）至1mg/ml。分装储存。临用前稀释至终浓度为20-60mg/ml过滤备用。在培养板或皿中加少量多聚赖氨酸溶液，以覆盖底部为宜，在37℃、CO2孵箱中过夜。次日，用移液管吸取多聚赖氨酸，并用水洗2-3遍，晾干备用，如果培养目的适用于电生理的单细胞记录或者免疫组化和荧光染色，则在培养皿的底部加上盖玻片，多聚赖氨酸铺于盖玻片上，则更易得到强烈的荧光信号。
3解剖液（HEPES平衡盐溶液） 取 100ml 10x 平衡盐溶液（Hank’s balance salt
solution,HBSS）
HEPES 3.9g,
NaHCO3 0.84g，
青霉素 104 U,
链霉素 100mg，
H2O 800ml。
以1mol/LHCl调节PH至7.2，再加H2O之后总体积为1L，以0.2μm直径的滤菌器过滤，4℃保存。
4、DMEM 培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）DMEM 培养基500ml，加小牛血清和或马血清各10%（血清需经56℃，30min 灭活）1% 的青/链霉素.
5、无血清培养基 最常用的一种无血清培养基为，Neurobasal+2%的b27+1%抗生素
6、2.5%胰蛋白酶（typsin） 溶液 临用前以解剖液稀释至终浓度0.125%。
7、台盼蓝(typan blue )溶液 终浓度为0.2%-0.4%。
8、阿糖胞苷 终浓度为8-10 μmol/L。
9、动物妊娠天数的选择 通常选择出生24h之内的乳鼠。
实验步骤：
1、脱臼处死乳鼠，75%的酒精浸泡3-5min，将清洗完的乳鼠放入含预冷解剖液的培养皿中。
2、用两把尖镊逐个去除鼠的头部皮肤和颅骨，取出全脑，置于另一含预冷解剖液的（PBS？）培养皿中，小心剥离并去除脑膜及脉络丛。
3、在中线处用尖镊分离大脑半球，在解剖显微镜下小心去除嗅球、中隔、丘脑及下丘脑，剥离脑膜及脉络丛，在大脑皮层下方小心取出海马，置于含冰冷解剖液的6cm培养皿中。
4、用弯头尖镊把海马剪成小碎片，收集全部海马碎片，置于一含有0.25%胰蛋白酶溶液的培养皿中（该溶液必须在37℃孵箱中预暖），在孵箱中消化5-7min。
5、收集全部海马碎片，置于10ml预暖的DMEM培养基的试管中（培养基中含有10%的胎牛血清和或马血清各，1%抗生素，以及谷氨酰胺）。最好用培养基洗2-3遍，以中止消化反应。
6、加少量培养基于试管中，以中空塑料管反复吹打10-15次，直成细胞悬液。加培养基于同一试管中至约10ml，静置约10min。取1-2μl细胞悬液于99μl0.2%-0.4%台盼蓝溶液中，用细胞计数板计算存活和死亡的细胞数，从而测定细胞密度(细胞计数：活体细胞具有排斥台盼蓝的能力，而死亡细胞则能吸收台盼蓝变成蓝色)。
7、根据实验需要，以培养基稀释细胞悬液至所需的细胞密度，接种细胞至经多聚赖氨酸铺板过夜处理的培养皿或培养板中。通常细胞密度为（2-2.5）x105细胞/cm2.
8、待6-8h细胞贴壁后，换培养基为含2%B27的Neurobasal，含有B27 和0.5mM的谷氨酰胺。
9、培养2-3d培养基中加入8-10μmol的阿糖胞苷，以抑制或阻止非神经细胞和原代胶质增
殖。
10、每三天用Neuronbasal使用液半量换液
三、形态学观察
细胞接种6-12h，开始贴壁，细胞成圆形或椭圆形，两周后神经元最为丰满，胞体圆形或多角形，四周晕光明显，胞核及核仁清晰可见，位于细胞中央或一边，神经多而粗大，分支成网络。培养一月后，细胞开始退化。一般认为，培养2-4周开始实验比较适宜。
附：
血细胞计数法及台盼蓝测细胞活度
（一）
实验材料和实验前准备
1、 显微镜， 血细胞计数器， 盖玻片
2、 毛细移液管，1 ml血清移液管，5ml试管，擦镜纸或软布
3、 0.4%的台盼蓝溶液，0.3%苯胺黑（nigrosin）溶液，95%， 乙醇
4、 用擦镜纸或者软布将血细胞计数板的计数池擦干净。再用酒精95%血细胞技术板和盖玻片，晾干备用。
5、 讲清洁干净的盖玻片覆盖于血细胞技术板的计数池上。
6、 胞浓度=4大格细胞数/4×稀释倍数×104/m
（二）实验步骤
1、制备制备细胞悬液 取一试管，分别加入0.4%台盼蓝溶液 0.2ml (或0.3%苯胺黑溶液)及混合均匀的细胞悬液0.8 ml，用手轻柔振荡试管，以混合悬液和染料。
2、以中空移液管轻柔混匀细胞悬液后，立即用毛细移液管吸取少量细胞悬液，置移液管尖头于细胞计数板计数池的边缘（小心不要移动盖玻片），缓缓释放细胞悬液。通常一侧计数池可以容纳20 ul细胞悬液。
3、细胞计数 每个正方形的边侧都有三根线，在左侧和上方，应将接触到三根线的中线的内侧线的细胞计算在内，技术两侧计数池，共八个正方形。
四、注意事项
1、 L-多聚赖氨酸（0.1mg/ml） 包被培养板后，要待其干后才能接种，因为其对神经元有毒性。L-多聚赖氨酸（0.1mg/ml）能回收再利用。
2 、取脑组织时动作尽量要快，并且尽量低温操作。
3 、分离皮层和海马时，要尽量分离脑膜和血管，否则有大量的成纤维细胞。
4 、用吸管轻轻吹打细胞时，尽量不起泡沫，以免损伤神经元。
5 、接种细胞的过程，动作要快，以免细胞聚集。
6 、接种细胞后，24h勿移动，以免影响细胞贴壁。
五、结果、
大多数神经元在接种1h内贴壁，3-5h开始变平，并长出1-2个突起。3天后，许多细胞从胞体长出数个突起。神经元在7-10天开始成熟，胞体逐渐长至30-40um,晕光明显，胞核和核仁清晰可见，突起变粗，变长并且有分支，边缘清楚，发亮，形成明显的神经网络。神经元可存活1-2月
海马细胞实验记录方案
实验记录
一、 实验名称：
海马细胞培养
二、 实验目的：
在细胞水平评估给药后是否能够提高突触可塑性
三、 实验时间：
年 月 日
四、 实验地点：
五、 实验人：
六、 实验试剂：
1. 完全DMEM培养基：
2. 1×PBS：厂家：HyClone；
3. 0.25%胰酶消化液：
4. 硼酸盐缓冲液（poly-L-lysine)： 5. Neurobasal全培+双抗：
6. HBSS缓冲液：
七、 实验仪器：
1. 湘仪TD5A-WS台式低速离心机，转子号为853590，水平转子，容量为32×15 ml。
2. 培养箱：Thermo SCIENTIFIC培养箱，HERACELL 150i CO2 Incubator。
3. 倒置显微镜
4. 解剖镜
八、 实验过程：
1. 准备24孔板，每孔放入一个处理好的玻片，共24孔。分别加poly-L-lysine
Buffer 500μl/孔，放入37℃培养箱中包被2小时以上。
2. 4小时后，准备3个10-cm无菌培养皿，分别加20ml的HBSS-buffer，放在冰袋上预冷。
3. 用75% 乙醇喷洗剪刀一把、尖头镊子两把、称量勺一把、手术刀片一个；将新生E19小鼠的头和身体分离，把头放在其中一个预冷的平皿中。
4. 取大脑：左手用一把尖头镊子压住小鼠头部的眼睛处，右手用手术刀片将头顶处划开，再用另一把尖头镊子扒开头部的皮和脑壳，（注意不要弄坏大脑）右手拿称量勺尾端轻轻插入需出的大脑的底部，轻挑出大脑，放入到另一个干净的平皿中。
5. 用上述取大脑的方法将剩余的小鼠大脑取出。 6. 取海马体：在解剖镜下，左手用尖头镊子压住小脑处，右手翻开大脑的半球，去除血网，分离血网下的海马体（带状深色，半透明，靠近大脑半球的边缘），将海马体移入最后一个干净的平皿中。
7. 用上述取海马体的方法将剩余的海马体取出。
8. 全部海马体取出出后，用1ml 枪把海马体轻吸到1个无菌的1.5 ml EP管中，等海马体沉淀后，吸出上清，用PBS清洗10次，1ml/次。最后一次清洗后尽可能把上清吸净（注意不要把海马体吸出）。
胎鼠海马神经元培养及其鉴定
昆明医学院学报２０１１，（５）：１７ １９
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｋｕｍｎｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
胎鼠海马神经元培养及其鉴定 ＣＮ ５３—１０４９／Ｒ
李玉”，王波”，但齐琴∞
（１）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明 ６５００３１；２）昆明医学院神经科学研究所，云南昆
明 ６５００３１）
［摘要］目的建立胎鼠海马神经元体外培养方法，观察细胞生长情况，免疫组织化学染色鉴定神经元特 异性．方法取胎鼠海马，分裂获得细胞悬液，接种于２４孔板，经２ ｈ差速帖壁去除成纤维细胞，将细胞液转 移并继续培养，以获娶纯度较高的海马神经元．培养第５、１ １、１５天观察细胞和突起生长情况，用ＮｅｕＮ抗体 以免疫组化ｓＰ二步法染色鉴立神经细胞．结果培养头３ ｄ．细胞生长缓慢，５ ｄ时细胞开始生长，可见突起， １ １ ｄ时突起连成网状．经Ｎｅｕｎ染色培养细胞呈阳性反应．证明是神经元．结论本方法获取生长良好，纯度 较高的海马神经元． ［关键词］胎鼠；海马神经元；Ｎｅｕｎ；培养 ［中图分类号］Ｑ８３１．１＋１［文献标识码］Ａ［文章编号］１００３—４７０６（２０１ １）０５—００１７—０３
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ Ｆｅｔａｌ
Ｒａｔｓ
ＬＩ Ｙｕ”．ＷＡＮＧ Ｂｏ”，ＤＡＮ Ｑｉ—ｑｉｎ
（１）Ｄｅａｒ．ｏｆＮｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ；２）Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｋｕｎｍｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｋｕｎｍｉｎｇ Ｙｕｎｎａｎ ６５００３ １，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｈｉｐｐｏｅａｍｐｕｓ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ
ｎｅｕｒｏｎａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｉｓｔｉｃｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ ｆｒｏｍ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｏｆ ｆａｔａｌ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ，ｔｈｅｎ
海马细胞培养
细胞培养 （普通混合培养）
一、 常规必备：
1. 溶液
1) PDL: Sigma, Cat. No.: P-0899 避光
用超纯水配制好后过滤，200ul或400ul/tube分装, -20度储存。 母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml
(或PLL：Sigma, Cat. No.: P-9404)
2) HBSS: 1L
NaCl 8.4g
KCl 0.224g
HEPES 2.38g
青霉素钠 50万单位
硫酸卡那霉素 50万单位
用1M NaOH将PH值调至7.1-7.2左右,再用超纯水将渗透压调至290±10，过滤，-4度储存。
3）Trypsin Solution
0.125% Trypsin (Gibco BRL (1:250), Cat. No.: 27250-042)
0.02% EDTA
先用尽可能少量HBSS溶解EDTA（用1M NaOH调PH偏碱，EDTA溶解）。再加适量HBSS，用1M HCl还原PH，溶解Trypsin，最后定容。过滤，0.8ml/tube分装，-20度储存。
4）DMEM （Dulbecco’s Modified Eagle Medium）
GIBCO
Cat. No.: 12100-046 (Powder, 10 x 1L)
11952-092 (Liquid, 500ml)
5）FBS
Gibco, Cat. No.: 16000044, 500ml
分装：4ml/tube, -20度储存
6）F12 (F-12 Nutrient Mixture)
Gibco
Cat. No.: 21700-075 (Powder, 10 x 1L)
海马神经元细胞免疫荧光检验
海马神经元细胞免疫荧光检验
神经元鉴定：
一、烯醇化酶鉴定：
培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，
80%，90%，100%I，100%II 梯度酒精透水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明2次，每次30min---中性树胶灯片---镜下观察。
二、β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）荧光显示：
培养细胞用预冷PBS液轻柔漂洗3次，4%多聚甲醛固定，1h，4℃---吸去多余甲醛---PBS漂洗5min×3次---0.25%triton，室温，15min---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------弃血清，加入β-tubulinⅢ抗体（1:100稀释），4℃，过夜---PBS漂洗5min×3次---滴加FITC标记的山羊抗小鼠lgG（体积比1:200稀释），37℃，1h---DAPI复染10min---抗荧光猝灭封片液封片---荧光显微镜观察---选择10个视野，统计学处理。
一、烯醇化酶鉴定：
培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，
胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定文档资料
胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定
在神经生物学及相关学科领域中，原代培养的神经元因其排除机体生理病理状态干扰的影响而成为较为理想的实验模型，是研究神经元形态、物质代谢、分子机制及电活动的主要前提。海马是大脑边缘系统重要的组成部分，在学习、记忆、情绪反应及中枢神经系统疾病的病理生理变化方面发挥着重要作用。对于原代海马神经元的培养，主要供体主要有胎鼠与新生鼠两种，培养方法有含血清培养和不含血清培养两种。我们通过实验摸索，取得一种较稳定且简便实用的方法，能获得较高存活率的海马神经元。
1 材料与方法
1.1 实验动物来源 清洁级孕17-19天SD大鼠上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002。
1.2 主要仪器与试剂 CO2培养箱（Thermo公司），倒置相差显微镜为（Olympus公司），激光共聚焦显微镜型号为ZEISS
LSM710，小鼠抗大鼠classⅢβ-Tubulin单抗（Beyotime公司），NSE免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程XX公司），B27添加剂、Neuralbasal、Hoechst 33342Sigma公司），DMEM（高糖型）培养基、胎牛血清（Gibco公司）。
1.3 培养方法与鉴定 取孕17-19天大鼠，水合氯醛麻醉后70%酒精浸泡20min，颈椎脱臼法处死孕鼠，将子宫立即放入冰
浴含DMEM的大平皿中，在解剖显微镜下取下海马组织，剪成约1mm×1mm×1mm大小，用0.125%胰蛋白酶于37℃、5%CO2培养箱中消化15min，中间每隔5min振荡一次，加入含10%FBS的DMEM液终止消化，巴氏管轻柔吹打，200目筛网过滤。1000r/min离心5min，弃上清，并加入适量的含2%B27无血清Neuralbasal培养基，用巴氏管吹打成细胞混悬液。吹打后以0.4%台盼蓝染色计数活细胞并调整细胞悬液的细胞密度，以5×105个/ml的细胞密度接种于预先经0.05%多聚赖氨酸包被的6孔板（1.5ml/孔），置于37℃、5%CO2培养箱培养，24h后换培养基继续培养，以后每周更换维持培养基2次，每次半量换液。每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况并拍照。培养7d后用4%多聚甲醛固定，以β-tublinⅢ单克隆抗体荧光染色显示海马神经元，用Hoechst33342复染显示细胞核（具体操作按说明书进行），激光共聚焦显微镜下观察，同一视野用不同的激发光激发并分别摄取细胞和细胞核的荧光图片，利用显微镜自带NIS成像软件将所得图片进行组合。同时，采用传统的NSE细胞免疫化学染色方法，DAB显色，HE复染显示细胞核，倒置相差显微镜下观察拍照。神经元纯度计算方法：在高倍显微镜下随机选取5个视野，计算阳性细胞的个数除以总细胞数，换算成百分率，重复5次，取其均值±标准差作为神经元的纯度。
小鼠大脑皮层和海马神经元的分离与培养20110110
小鼠大脑皮层和海马神经元的分离与培养
一、玻片的准备
A．玻片的清洗
1. 第一天，将玻片(12mm，633009，Carolina) 逐片置于装有浓硝酸 (HNO3) 或者洗液的平皿中，混匀，然后浸泡过夜。
2. 第二天，将玻片放在有单蒸水的陶瓷盘中，搁在摇床上晃动，速度为200rpm，将玻片上的硝酸残液清洗干净。每10min换水一次，要换20次以上。晚上置于双蒸水中浸泡过夜。
3. 第三天，换双蒸水，重洗两次，每次速度为200rpm ，时间为60min，去除玻片上的离子和其它杂质，最后再换用无水乙醇，清洗三次以上。洗完后置于小烧杯中，拿到细胞房超净台将玻片浸泡在无水乙醇中室温保存。
4. 解剖小鼠取细胞前两天将玻片从无水乙醇中取出，在酒精灯焰上烘干，稍微在空气中停一下，再放到灭菌的parafilm膜上。玻片高温易碎，速度要快。完成后在紫外下照射1h。
B. 玻片的包被（PDL包被）
用0.1M的硼酸钠溶液将PDL配成0.01mg/ml PDL的溶液(pH 8.4)。
1. 准备500ml 0.1M的硼酸钠（Na2B4O7·10H2O, B3545-500G，Sigma）溶液。
2. 在超净台中，往一整瓶Poly-D-Lysine（PDL，5mg/ml，Sigma, P6407-5MG）中加入25ml的该硼酸钠溶液。盖上瓶盖，溶解5min，可以轻轻晃动。然后将该溶液加到剩下的硼酸钠溶液中。即为所配溶液，0.22μm过滤，用锡纸包好，4℃避光保存。
3. 使用的时候，6/12/24孔板每孔加1ml/500μl/250ul的PDL溶液，12mm盖玻片每片加50μl的PDL溶液，放在超净台中，室温包被4hrs或者过夜。
4. 第二天，紫外照射超净台1-2hrs，再将PDL吸干。将板和玻片盖揭开，室温晾过夜。
5. 第三天，将每个孔/玻片用灭菌水洗两遍，吸干，盖上盖，避光待用。
二. 大脑皮层与海马的解剖
海马鉴定
神经元鉴定
采用神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学方法(LSAB法-标记式链霉亲和素-生物素免疫组织化学方法)对原代培养的神经元进行鉴定。
取出培养8天的神经细胞，吸掉培养液用温(37 ℃)0.1mol/LPBS(pH7.4)洗2遍，4%多聚甲醛固定30分钟，再用PBS轻洗两遍，风干备染。固定后的细胞用0.01
mol/LPBST(pH 7.4)浸洗5分钟，3次;用0.3%H2O2的80%甲醇溶液氧化10分钟;流水洗5分钟;PBST洗5分钟，3次;滴加阻断液正常山羊血清30分钟;滴加一抗(神经元特异性希醇化酶，NSE鼠抗人单抗)125，4 ℃过夜，阴性对照用PBS代替一抗;PBST洗5分钟，3次;滴加二抗(羊抗小鼠)室温90分钟;PBST洗5分钟3次;滴加链霉卵白素HRP复合物室温90分钟;PBST洗5分钟3次;0.05%DAB-0.03%H2O2显色液，显色5～10分钟;流水洗，甘油明胶封片，光镜下观察。
NSE免疫组化染色结果
NSE免疫组织化学染色显示：NSE免疫反应物呈棕黄色，颗粒状，阳性反应颗粒主要分布于神经细胞的胞浆及较粗大的突起中，神经胶质细胞不着色，阴性对照未见细胞着色。培养8天的神经细胞均匀地分散于胶质细胞上面，胞体呈圆形或者多边形，伸出较长的突起，神经细胞生长良好，发育成熟，可以进行实验研究
培养结 果
倒置相差显微镜观察原代培养大鼠海马神经细胞形态结构
大鼠海马神经细胞于倒置相差显微镜下观察：接种的神经细胞最初呈圆形;接种1～2小时几乎全部帖附于多聚赖氨酸处理过的小盖玻片和培养板壁。此时细胞分散，呈现强折光的胞体，核不可见。培养第二天大部分细胞已经伸出突起，胞体饱满，光晕明显，胶质细胞很少见。第三天神经细胞突起更长，胞体逐渐变大，并可见少量胶质细胞;第4～6天神经细胞突起均已连接成神经网络，呈丝带状。培养7～8天，细胞胞体饱满，呈圆形、梭形、三角形或者多边形，细胞核大而圆，位于胞体中央或者偏于一侧，核仁清晰可见，经胞体伸出大量突起并相互连接成神经网络，此时神经细胞已经发育成熟
原代海马神经细胞体外培养的纯化与鉴定
３２２ 第４４卷第４期 ２０１０年８月 哈尔滨医科大学学报 Ｊ０ＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＡＲＢＩＮ ＭＥＤＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩ ＩＹ Ｖｏ１．４４，Ｎｏ．４ Ａｕｇ．，２０１０
原代海马神经细胞体外培养的纯化与鉴定
刘歆，张一娜 ，张云鹤，姜礼红 （哈尔滨医科大学第二临床医学院老年病科，黑龙江哈尔滨１５００８１）
［摘要］ 目的建立原代海马神经细胞体外培养纯化及鉴定的优选方法。方法取新生Ｗｉｓｔａｒ乳鼠，分离海马后 在体外采用含血清结合无血清法进行培养，并用ＮＳＥ、ＧＡＰ－４３、ＭＡＰ２等海马神经细胞特异抗体经免疫细胞化学方 法鉴定细胞性质及纯度。结果接种２４ ｈ后细胞全部贴壁，并长出突起，随时间增加，突起延长并交错形成网络， 至第７・８天神经元形态最为成熟饱满，随后逐渐出现细胞老化，神经元最长可生存４周。经鉴定，海马神经元纯 度达９６％以上。结论体外采用含血清和无血清法相结合进行原代海马神经细胞培养，细胞纯度高，杂细胞少，可 为神经疾病体外研究提供必要细胞基础。 ［关键词］海马神经元；原代培养；细胞纯化；免疫细胞化学 ［中图分类号］Ｒ３３１ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１０００—１９０５（２０１０）０４—０３２２—０４
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＬＩＵ Ｘｉｎ，ＺＨＡＮＧ Ｙｉ—ｎａ，ＺＨＡＮＧ Ｙｕｎ—ｈｅ，ｅｔ ａｌ
（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ，Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈａｒｂｉｎ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５００８１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａｎ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｐｐｏｃａｍ－
乳鼠海马神经细胞的原代培养以及冻存复苏方法
丞 堡 医 堂 堂 堡 Ｊ０ＵＲＮＡＬ ０Ｆ ＣＨＥＮＧＤＥ ＭＥＤＩＣＡＬ Ｃ０ＬＬＥＧＥ 及ＩｔＳ床确诊，将其随机分为观察组和对照组。观察组３ ０ 例，男ｌ７例、女ｌ３例，年龄４０－７０岁，脑梗塞２２例、脑出血 ８例，瘫痪肢体为左侧者ｌ ５例、右侧者ｌ ３例、双侧者２例。 对照组３０例，男２０例、女ｌ０Ｎ，年龄４２－７４岁，脑梗塞２ｌ 例、脑出血９例，瘫痪肢体为左侧者ｌ２例、右侧者ｌ６例、双 侧者２例。两组均除外有意识障碍及明显智力障碍者， 且均为首次发病，两组在肢体瘫痪情况方面无明显差 异，有可比性。 １．２ 方法 两组均接受神经内科常规药物治疗，同 时，观察组给予４周的康复护理。康复护理从发病ｌ周后 开始，主要为使患者保持正确的卧床姿势及肢体功能 位置，各关节被动运动及坐位训练。ｌ周后（稳定期）指导 患者在床上进行主动训练，￣ｕＢｏｂａｒｔｈ握手、起坐训练； ２周后（恢复期）床椅转移、站立、行走、上下楼梯及进食、 脱衣、洗漱等训练。观察指标：日常生活能力（ＡＤＬ）的评 价采用Ｂａｒｔｈｅｌ￣数，以了解康复护理对ＡＤＬ的作用。肢 体运动功能则采用Ｆｕｇｌ—Ｍｅｙｅｒ运动功能积分法，评定 患者治疗前后肢体运动功能的变化。 １．３ 统计分析 采用ＳＰＳＳｌ１．０统计软件，以凇验进 行统计处理。 ２结果 治疗前两组患者的Ｂａｒｔｈｅｌ指数和Ｆｕｇｌ－Ｍｅｙｅｒ运动 功能积分相近，无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。治疗后两组患 者的Ｂａｒｔｈｅｌ指数和Ｆｕｇｌ—Ｍｅｙｅｒ运动功能积分均有所改 善，其中观察组治疗后明显高于治疗前（Ｐ＜０．０１），对照 组治疗后与治疗前比较无明显差异（见附表）。 组别 塾 坌 治疗前治疗后 Ｖｏ１．２４．Ｎｏ．４ ２００７ ｛与对照组比较：尸＞０．０５，｛ 与本组治疗前比较：尸＜０．０１ ３讨论 现代脑损伤恢复理论认为瘫痪肢体反复进行随意 运动训练可以引起与这个运动有关的神经回路的变化， 接受训练的身体部位在皮层的支配区域也会扩大。传导 兴奋的神经回路的传递效率明显提高，反之，随意运动 训练减少，运动功能恢复的可能性降低…。因此，康复训 练有利于新的神经回路和正常运动程序的建立。也就是 说，采取积极的康复护理，可促进相关神经细胞的轴突 发芽，形成新的突触，通过反复训练，使这些突触建立起 接近正常功能的新的神经网络，实现中枢神经功能重新 组合，同时抑制异常的低位中枢控制的运动，使其突触 链处于受抑制的多阂值状态，从而改善患侧肢体的功能 】，对急性脑血管病病人的康复有积极的意义。 但对于还没有度过脑血管病急性期（约发病１周内．） 的病人康复护理应十分慎重，因为处在急性期的脑血管 壁脆性高，发病部位尚未形成牢固而稳定的血栓栓塞， 盲目的超早康复护理可能引起梗死后再灌 损伤及出 血后的再出血等。 【参考文献】 ［１】津本中治．学习与记忆形成的过程【Ｍ】．东京：朝仓 书店，１９９４．２５１－２６７． 【２Ｊ魏玉兰．脑卒中的康复治疗【Ｊ】．中国康复医学杂志， １９９５，１０（２）：６５． （收稿日期：２００７－０５－ｌ６） ２２７６－０５．５２±＋９７－５１．３８’７２１．．２１３＋±７．４３Ｉ＿２．２１±＋１３．２０ ６９．．４１＋±１１８．６７＇３ ５ ５３ ２ ５８ ３３ ７８ ９ ９ （护理医学栏目编辑：苏桂兰） ２７．０５±９．５１ １．１±１１．２１ ２３．±１． ．±１ 。 ‘ ’’ 。 乳鼠海马神经细胞的原代培养以及冻存复苏方法 张雅丽，高维娟 （承德医学院，河北承德０６７０００） 【关键词】海马神经元；冻存；复苏；原代培养；胰蛋白酶；ＮＴ一３ 【中图分类号１Ｒ３６１ ．３ 【文献标识码ＩＢ 【文章编号】１００４—６８７９（２００７）０４—０４０６－０３ 海马神经元作为边缘系统的重要组成部分，在结构 的海马较胎鼠好定位，易取材，故多采用乳鼠海马作为 上具有高度序化板层结构和神经元相对独立分布等特 实验研究对象＿２】。出生１－２ｄ的大鼠数量很难掌握，做实验 点，因而成为理想的神经科学研究模型…。鼠类出生时的 时有时得到的细胞会多于计划量有时会少于计划量，这 神经元和神经胶质细胞均未分化成熟，最好的脑细胞培 时就会造成浪费或不足，但是如果海马细胞能冻存复苏 养物都来自于临产（２ｌ ｃ１）的胚胎和新生动物。由于乳鼠 就可以多时存储少时补充。所以，我们在传统实验的基 ￥教育部新世纪优秀人才支持计划（ＮＣＥＴ－－０６－－０２５８）；河北省科技领军人才创新基金（０６５４７００９Ｄ－－ＩＩ） 河北省自然科学基金资助项目（Ｃ２００６０００８６５）；河北省教育厅科学研究计划课题（２００５２２４） ・４０６・
神经细胞实验报告
一、实验目的
本研究旨在通过体外培养神经细胞，探讨CA1重组蛋白在神经细胞生存以及学习记忆过程中的生物学功能，并深入了解其调控机制，为神经科学领域的研究提供实验基础。
二、实验材料
1. 细胞：大鼠胚胎海马神经元
2. 试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、神经生长因子、抗凋亡因子、CA1重组蛋白、学习记忆相关基因的抗体、荧光标记抗体等
3. 仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、荧光显微镜、酶标仪、离心机、凝胶成像系统等
三、实验方法
1. 细胞培养：将大鼠胚胎海马神经元接种于细胞培养皿中，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于细胞培养箱中培养。
2. CA1重组蛋白表达和纯化：通过基因工程方法表达CA1重组蛋白，并进行纯化。
3. 神经元培养和CA1处理：将培养至一定时期的神经元分为实验组和对照组，实验组加入一定浓度的CA1重组蛋白，对照组加入等体积的DMEM培养基。
4. CA1对神经元细胞凋亡的影响：通过流式细胞术检测CA1处理组与对照组神经元细胞凋亡率的差异。
5. CA1与学习记忆相关基因的表达关系研究：通过RT-qPCR检测CA1处理组与对照组神经元中学习记忆相关基因的表达水平。
6. 穿透式电子显微镜观察CA1对突触结构的影响：通过透射电子显微镜观察CA1处理组与对照组神经元突触结构的差异。
7. CA1对学习记忆行为的影响：通过Morris水迷宫实验检测CA1处理组与对照组小鼠的学习记忆能力。
8. 数据分析与统计：采用SPSS软件对实验数据进行统计分析，包括t检验、方差分析等。
四、实验结果 1. CA1处理组神经元细胞凋亡率显著低于对照组（P<0.05），表明CA1重组蛋白具有抑制神经元细胞凋亡的作用。
2. CA1处理组神经元中学习记忆相关基因的表达水平显著高于对照组（P<0.05），表明CA1重组蛋白可能通过调控学习记忆相关基因的表达来影响神经元的学习记忆功能。