小鼠海马神经元的培养
雌二醇对Aβ1-42诱导小鼠海马神经元细胞的影响
１ ｃ ｏｌｏ ａ ｏｏｙ ｉｉａ ｄｃｌＵ ｉｅｓｔ，Ｈ ｉ ｎｊ ｎ ｒｖ ｃ ， ｑｈ ｒ １ １０ ，Ｃ ｉａ ．ｏ ｅｅ ｏ ａｉ ． ｈ ｏ ｆＰ ｔ ｌｇ ，Ｑｑｈ ｒＭｅ ｉａ ｎｖｒｉ Ｓ ｈ ｙ ｅｌ ｇ ａ ｇ Ｐｏ ｉ ｅ Ｑｉｉａ ６ ０ ０ ｈｎ ；２Ｃ ｌ ｇ ｆＢ ｓ ｏ ｉ ｎ ｌ ｃ Ｍｅ ｉａ， ｉｉａｒＭｅ ｉａ Ｕ ｉｅｓ ｙ Ｈ ｉ ｎ ｊ ｎ ｒｖｎｅ Ｑｉｉａ １ １０ ， ｈｎ ｄｃｌ Ｑｑｈ ｅ ｄｃｌ ｎｖ ｒｉ ， ｅｌ ｇｉ ｇＰ ｏｉｃ ， ｑｈ ｒ ６ ０ ０ Ｃ ｉａ ｔ ｏ ａ 【 ｓｒ ｃ】Ｏｂｅ ｔ ｅＴ ｔｄ ｈ ｃ ａ ｉ ｏ ４ ｎｈｐ ｏａ ｐ ｌ ｅ ｒｎ ｎｍｉ ｐ ｐｏｉ． ｔｏ ｓＡ ｔｒｔｅ Ａｂ ｔａ ｔ ｊｃｉ ｏｓ ｙｔｅｍｅｈ ｎｓ ｆ １ ２ｏ ｉｐ ｃ ｍ ａ ｎ ｕｏ ｓｉ ｃ ａ ｏ ｔｓ Ｍｅｈ ｄ ｆ ｖ ｕ ｍ Ａｐ － ｅ ｓ ｅ ｈ
【 金 项 目】黑 龙 江 省 教 育 厅科 学 技 术 研 究项 目（ 目编 号 ：１２ ３ ３ 。 基 项 １５ １２ ） 【 者 简 介】帅智 峰 （９ １ ） 男 ， 师 ， 事抗 肿 瘤研 究 。 作 １８ 一 ， 讲 从
待 细 胞 生 长 良好 加 入 含 不 同 浓 度 Ａ［ — ２ＤＭＥ 培 养 液 ， ３ ４ １ Ｍ １０Ｌ孔 。 培 养 细 胞 加 人 ＡＩ 一 ２浓 度 为 ４ ｍ ｌ 建 立 小 ０ ／ Ｍ ４ ０Ｉ ｏ／ ｘ Ｌ， 鼠海 马神 经元 实验模 型 。
海马神经干细胞的分离、培养与鉴定
显 示 神 经 元 、 状 胶 质 细胞 、 星 寡树 突 细胞 抗 原 阳性 。 结论 ： 海 马 分 离 出 的 细 胞 具 有 自我 更 新 、 殖 和 分 化 能 从 增
力 ， 神经 干细胞。 是
关 键 词 神 经 干 细 胞 海 马 大 鼠 细 胞 培 养
分类 号 Ｒ７ １ ０ ４ ．５
维普资讯
第 １ ２卷 第 １ ９期 ２０ ０ ２年 ｌ Ｏ月
中 国 现 代 医学 杂 志 Ｃｈｎ ｏ ｍ ￣ ｏ ｏ ｅｎ Ｍ ｅ ｉｉ ｉａＪ ｕ ｆＭ ｄ Ｆ ｄｃｎｅ
Ｖｏ ． ２ Ｎｏ． ９ １１ １ ０Ｃ ．２ ０ ｔ ０２
Ｉ ＯＬＡＴＩ Ｎ ． Ｓ Ｏ ＣＵＬＴＵＲＥ ＡＮ Ｄ ＤＥＮＴＩ ＣＡＴＩ Ｎ Ｆ ＮＥＵＲＡ Ｌ Ｉ ＦＩ Ｏ Ｏ Ｓ ＴＥＭ ＣＥＬＬＳ Ｉ ＲＡ ＴＳ’ Ｈ Ｉ Ｎ ＰＰＯ ＣＡＬＭ ＰＵＳ
Ｌｉ ｕ Ｂａｉａｎ ， ｉ ｇｑ ｙ ＬｉＸ ｎ ｕｎ ， ａｎ Ｚｈ ｇｈｕ ｘｉ ， ｅ ． ａ ａｎ ｔａ１
个 克 隆 进 行 连 续 传 代 培 养 ， 免 疫 组 化 检 测 ｎｓｉ 原 和 分 化 后 神 经 细 胞 特 异 性 抗 原 。 结 果 ： 海 马 获 得 的 用 ｅｔ ｎ抗 从
细胞 群 能 够 连 续 传 代 ， 离后 的 单 个 细 胞 能 形成 事 迹 球 ， 疫 检 测 为 ｎｓｉ 性 ； 外 、 内分 化 的细 胞 分 别 分 免 ｅｔ ｎ阳 体 体
［ ｂｔａｔ Ｏｂｅｔ ｅＴｏｉ ｌｔ ｎａ ｄｉｅｔｉ ｔ ｎｏ ｅ ｒｌｔｍ ｅｓｉ ｒｔ’ ｉｐｃｌ ｕ ． ｔｏ ｓＣ ｌ Ａ ｓ ｃ］ ｊｃｉ ： ｏａｉ ｎ ｎｉｃ ｉ ｆ ｕａ ｓ ｃｌ ａｓ ｈｐｏａｍｐｓ Ｍｅｈｄ ： ｅ ｓ ｒ ｖ ｓ ｏ ｄ ｆａｏ ｎ ｅ ｌｎ ｌ
虫草素改善脑缺血小鼠学习记忆及对海马神经元数量的影响
ｃｒｙｅ ｉ ａｔ ｃｅ ｉ ｉ ｕｙ（ ８ ｏ ｃｐｎｆ ｅ ｉ ｈｍ ｃ ｎ ｒ ｎ＝ ） ｄ ｒｓ ｊ
２ １１ 造模后给予 虫草素对脑缺血小鼠学习能力 ．． 的影响 模型组第 ２ 第 ３和第 ５天的脑缺 血小 鼠 、 正 确 反 应 率 分 别 为 ５ ． ％ ４８５ ７． ％ ４ ５ ０ － ． ％、 １３ － １． ％和 ８ ．％ － ． ％（ １ ， ３６ ６ ３ １ ９ 表 ）显著低于假手术组 － ９
虫 草 素 （ｏｄｃｐｎ ， 称 ３ ｃｒｙｅｉ） 又 一脱 氧 腺 苷 （ 一 ３ ｄｏｙｄｎｓ ｅ ， 天然 中 药 材 冬 虫 夏 草 的 活性 成 ｅｘａｅｏｉ ） 为 ｎ 分 之一 ， 子式 为 Ｃ。 Ｎ Ｏ ， 构 式 见 图 １ ． 分 Ｈ， ３结 … 研
பைடு நூலகம்
海马各区神经元数量的影响， 为虫草素在神经 系统 的开发和应用提供实验依据．
的 ６ ． ％ ±１ ． ％ 、 ２ ２ ±９ ７ 和 ９ ． ％ ± ９４ ０４ ８． ％ ．％ ５６
２ １２ 造模 前给 予 虫草 素 对 脑缺 血 小 鼠迷 宫 学 习 ．．
的影响 表 ２ 和图 ３ 所示 ， 型组每天正确反应率 模 均低 于 假 手 术 组 ， 标 所 需 训 练 次 数 （ ３． ± 达 １２５ ２． ） 显 著 高 于假 手 术 组 （ ２ ５±２． ） Ｐ＜ ６０ 也 ９． １２ （ ００ ）药物组每天正确反应率从第 ２天开始均高于 ．１．
Ｃ １Ｃ Ｄ Ａ 、 Ａ 和 Ｇ区 ， 取各 区 中部 ５００ ｍ 围 ， 选 ０ 范
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统计神经元数量．
１ ７ 统 计 学方法 ．
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各组数据以均值 ± 标准差 （ ｓ 表示 ， ± ） 组间 比 较 采用 单 因 素 方 差 分 析 ． 据 处 理 采 用 ＳＳ ３０ 数 Ｐ Ｓ１． 统 计软 件进 行分 析处理 ．
Hes1与小鼠海马齿状回神经再生
Hes1与小鼠海马齿状回神经再生目的：观察幼年小鼠与成年小鼠海马齿状回中Hes1的表达差异，初步分析其对成年神经再生的影响。
方法：将C57BL/6雄性小鼠分为幼年组（10 d，N组）和成年组（4个月，A组），每组8只。
分别对Hes1、BrdU、Doublecortin（DCX）、NeuN采用免疫荧光技术染色并进行相应的细胞计数，初步分析BrdU、Hes1双阳性细胞的细胞类型及表达水平。
在显微镜下分离海马齿状回，采用Western blot 检测Hes1的蛋白水平，观察对比两组间Hes1蛋白表达的差异。
结果：（1）Western blot检测中A组中的Hes1蛋白的表达水平明显高于N组，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。
（2）Hes1（+）细胞主要分布于齿状回颗粒细胞下层，并且大部分Hes1阳性细胞同时表达Brdu；（3）A组Hes1（+）细胞数量明显多于N 组，而BrdU（+）细胞明显少于N组，且差异均有统计学意义（P＜0.05）。
结论：Hes1在幼年小鼠与成年小鼠齿状回颗粒细胞下层中的表达差异，导致了神经细胞增殖水平的不同，表明Hes1的高表达可能抑制了神经再生。
1 资料与方法1.1 一般资料选取16只C57BL/6雄性小鼠，分为以下两组：（10 d，N组）幼年组和（4个月，A组）成年组，每组8只小鼠，并且成年组小鼠在动物室饲养10 d以适应环境。
1.2 BrdU给药方法与标本制备两组小鼠均以BrdU 50 mg/kg腹腔注射给药3 d，2次/d，每次间隔12 h，最后一次注射2 h后予戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，经升主动脉灌注生理盐水100 mL，4%多聚甲醛液（pH 7.4）500 mL后，断头取脑，将脑组织置入4%多聚甲醛固定过夜，20%蔗糖4 ℃沉底。
选择海马部位应用冰冻切片机冠状位连续切片，脑片厚度为35 μm，每隔140 μm取一张脑片，将脑片放入防冻液中保存以备用。
1.3 免疫荧光染色通过免疫荧光染色方法对Hes1、BrdU、Doublecortin （DCX）、NeuN染色并进行细胞计数。
Hes1在成年神经再生修复海马损伤中作用的研究的开题报告
Hes1在成年神经再生修复海马损伤中作用的研究的开题报告题目：Hes1在成年神经再生修复海马损伤中作用的研究一、研究背景海马是大脑中与学习和记忆有关的区域，其损伤常常导致认知和行为的障碍。
虽然成年神经系统对损伤的修复能力受到限制，但近年来研究表明，成年神经干细胞具有巨大的修复潜能并能导向海马神经元和神经胶质细胞的再生。
因此，研究成年神经干细胞在海马损伤修复中的作用机制具有重要意义。
Hes1是一种调控干细胞增殖、分化和自我更新的重要转录因子。
以往研究发现，Hes1在成年神经系统的发生和发育中扮演着重要角色。
但其在成年神经干细胞向神经元和神经胶质细胞分化过程中的作用仍然不清楚。
因此，本研究将针对Hes1在海马损伤修复中的作用进行深入研究。
二、研究目的本研究旨在探究Hes1在成年神经干细胞向神经元和神经胶质细胞分化过程中的作用，进一步阐明其在海马损伤修复中的作用机制，并为海马神经干细胞治疗提供理论依据。
三、研究内容与方法（1）搭建海马损伤模型：借助慢病毒介导的Vgat-CreER T2、Ai9基因突变技术来得到WG垂体前叶基因（nestin）启动子驱动的tdTomato标记基因的小鼠模型。
在小鼠的海马神经元中进行基因突变和荧光标记，模拟海马神经元的损伤。
（2）成年神经干细胞分离、培养和定向诱导分化：从小鼠的成年海马中分离出神经干细胞，通过体外培养和定向诱导分化成神经元和神经胶质细胞。
针对不同时间点的神经干细胞进行RNA-Seq。
（3）统计学分析：基于RNA-Seq数据，采用差异表达基因分析技术来筛选出不同分化时间点下的Hes1关键基因；采用GO、KEGG通路分析等来挖掘Hes1的生物学功能和作用机制。
四、研究预期成果通过本研究，预期可以深入了解Hes1在成年神经干细胞向神经元和神经胶质细胞分化和海马损伤修复中的作用机制，从而为开发海马神经干细胞治疗提供新的理论和实践基础。
TSA对不同糖浓度下小鼠海马神经元HT-22细胞凋亡的影响
细胞与分子生物学TSA对不同糖浓度下小鼠海马神经元HT-22细胞凋亡的影响许雯1，2，许永劼3，刘歆蕾2，沈婕2，朱科静2，林海容2，李兴4，潘卫1，2，3△摘要:目的探究曲古抑菌素A（TSA）对不同糖浓度下小鼠海马神经元细胞系HT-22细胞凋亡的影响。
方法分别用高糖培养基（葡萄糖浓度55mmol/L）及普通培养基（葡萄糖浓度25mmol/L）培养小鼠海马神经元HT-22细胞，高糖培养基及普通培养基各分为对照组（NC组）和抑制剂组（TSA组）。
用1mmol/L的TSA作用细胞1、4、8h，同时用0.4mmol/L的TSA作用细胞1、4、8、12、14、16、20、24h，CCK8法检测细胞存活率，确定抑制剂最佳作用浓度和作用时间；酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测组蛋白去乙酰化酶（HDAC）和组蛋白乙酰转移酶（HAT）活性；流式细胞术检测细胞凋亡情况；蛋白免疫印迹法检测B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的表达情况。
结果以0.4mmol/L、20h为TSA处理HT-22细胞的最适条件；ELISA结果显示，TSA作用后，HDAC显著减少，HAT显著增加（P＜0.05）；流式细胞术结果显示，在TSA抑制20h后，细胞凋亡率显著增加，高糖环境下加入TSA，细胞凋亡情况更加严重；TSA作用20h后，Bcl-2表达显著下调，Caspase-3显著上调（P＜0.05）。
结论TSA可能通过抑制HDAC增加组蛋白乙酰化水平，导致小鼠神经元HT-22细胞的凋亡。
关键词：葡萄糖；糖尿病；脑疾病；海马；细胞凋亡；组蛋白脱乙酰基酶类；曲古抑菌素A中图分类号：R587.2文献标志码：A DOI：10.11958/20202807Effects of TSA on the apoptosis of HT-22cells in mouse hippocampal neurons under differentconcentrations of glucoseXU Wen1,2,XU Yong-jie3,LIU Xin-lei2,SHEN Jie2,ZHU Ke-jing2,LIN Hai-rong2,LI Xing4,PAN Wei1,2,3△1The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guizhou Prenatal Diagnosis Center,Guiyang550004,China;2School of Clinical Laboratory Science,Guizhou Medical University;3School of Public Health,Guizhou Medical University;4Guizhou University of Traditional Chinese Medicine△Corresponding Author E-mail:****************Abstract:Objective To explore the effect of trichostatin A(TSA)on the apoptosis of mouse hippocampal neuron cell line HT-22cells under different sugar concentrations.Methods The mouse hippocampal neuron HT-22cells in high glucose medium(glucose concentration55mmol/L)and normal medium(grape concentration25mmol/L)were cultured.The cells in high glucose medium and normal medium were divided into control group(NC group)and inhibitor group(TSA group).Cells were treated with1mmol/L TSA for1,4and8h,or0.4mmol/L TSA for1,4,8,12,14,16,20and24h.The cell viability was detected by the CCK8method after treatment.Histone deacetylase(HDAC)and histone acetyltransferase (HAT)enzyme activities were detected by ELISA.Cell apoptosis was detected by flow cytometry.The expression levels of B lymphoma-2(Bcl-2),Bcl-2related X protein(Bax)and cysteine protease3(Caspase-3)were detected by Western blot assay.Results The0.4mmol/L of TSA and20hours were the optimal condition for culturing HT-22cells after testing. ELISA results showed that after treatment with TSA,HDAC significantly decreased and HAT increased significantly(P＜0.05).Flow cytometry results showed that after TSA inhibiting for20h,the apoptosis rate increased significantly.While TSA was added to cells under high glucose conditions,the apoptosis rate increased more.After20hours of TSA treatment,Bcl-2 expression was significantly down-regulated,while Caspase-3was significantly up-regulated(P＜0.05).Conclusion TSA基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（81960151，81960822）；贵州省教育厅创新群体重大研究项目（黔教合KY字［2018］021号）；贵州省科技计划项目（黔科合支撑［2019］2802号）作者单位：1贵州医科大学附属医院贵州省产前诊断中心（邮编550004）；2贵州医科大学医学检验学院；3贵州医科大学公共卫生学院；4贵州中医药大学作者简介：许雯（1994），女，硕士在读，主要从事糖尿病慢性并发症发病机制研究。
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版精华序言：国内外关于原代培养有很多文献;不幸的是;没有一篇是详细的;没有一篇解答过why.为了让大家少走弯路;根据我杀过3000只老鼠的经验;我把我这几年摸索的经验和大家分享;请求多投几票得几个叮当..相信你follow我的这篇文章一定会做的很好..我的标题说的很像吹牛;但是我是严肃认真的说的;I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验;99..9%原创;经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法;除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献;所以我才说是99.9%原创..1.材料选择..一定要严格按照国际上;NCBI数据库;其他文献的材料一致..胎鼠就要胎鼠;新生鼠就要新生鼠;不能混淆..因为新生鼠有一些受体;在培养的工作中失去功能;会不能再生;比如NMDA受体..和文献不同会导致错误结论;甚至困惑..很多人写信问我新生鼠的培养问题;我回答用新生鼠的实验很少;八成是你自己搞错了实验对象;请确认国际上的相关研究文献所用老鼠;再来问我下面的问题..2;培养基选择neurbasal/neurobasal-a;invitrogen Co.ltd..我强烈不建议用血清培养..原因是：首先;血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂;最后非常影响神经元产量；其次;为了抑制胶质生长;往往要加入阿糖孢苷..严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次;最重要的;血清培养的细胞状态很不均一;从正常到凋亡都有;严重影响试验准确;而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态;要么都好;要么都差;高度一致..Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasalneurbasal-A被认为是最标准;最好的培养基..需要的添加剂为B27和谷氨酰胺..培养出的细胞状态均一;胶质细胞几乎不分裂..其中;neurobasal是胎鼠培养基;而-A为新生鼠培养基..不过根据笔者实验;没什么太大区别;都能很轻松培养成功;但是;切忌中途换培养基;要从一而终..很多实验室是不加抗生素的;也有的实验室加..由于很多初学者操作不熟练;不注意;很多人会污染;所以我还是建议加双抗..注意由于无血清培养基添加剂不是血清;而是人工合成的B27也有用N2的;但是推荐B27;只差10美金;血清有复杂的解毒作用而B27没有;双抗对细胞的干扰;无血清培养基要大的多..所以;如果你在neurobasal里添加抗生素;记得用量只要标准量的一半..另一个添加成分谷氨酰胺溶液不稳定;所以每次用时候要现配现加..大概是0.5-2mmol/l大部分人用0.5mmol/l.虽然笔者试过;没加这个也正常生长;但是几乎所有文献都添加;we just simply follow.3.解剖过程一定要全程在冰上预冷..这就意味着;从你处死母鼠后;胎鼠的大脑的温度要最快的降低到0度..另外;在解剖过程中;胎鼠直到皮层或海马被剪碎的过程;有时候可能需要2小时;如果样品多..一定要注意多准备冰袋子..确保你的任何过程都在冰浴的培养液中进行消化步骤除外..这样可以大大提高存活率..在解剖大脑时候;有人用hank's;在其中解剖..根据我的经验;即使是0度;神经元还是在进行着很大程度代谢..所以;hanks的无糖环境很不利..我个人建议;用DMEM-高糖或DMEM-F12+马血清来浸泡解剖过程中的大脑;来供给大脑的代谢;血清可以抑制神经凋亡..这其中还有一个问题;就是DMEM培养液会在空气中变碱性..国外有的实验室用L-15培养液来浸泡解剖过程中的脑;因为L-15不会再空气中变碱性..没有L-15的国内几乎没有;可以全程用DMEM-HG或者DMEM-F12+血清浸泡解剖过程中的脑..注意注意：一切操作都在冰浴的液体中;所以要多准备冰袋..中途冰袋没了的是猪头4.关于培养皿的问题..一般来说;6孔板是最佳选择..神经元让人苦恼的问题是;神经元发育的情况和密度相关..大于6孔板比如6CM DISH会使得中间很难和周围的细胞密度一样;造成板中间和边缘成熟度不一样;而这会给实验带来很大干扰..而太小的话96孔或128孔细胞会倾向于向中间集中也会照成发育不均匀..所以笔者经验是6孔板是最佳选择..神经原代培养一定是要包被;用POLY-LYS或者胶原..关于POLY-LYS包被;我们是包被30分钟;吸干晾过夜;然后洗两次;或者只洗一次但是要30分钟接着晾干..由于neurobasal培养法相当成熟;所以没必要用难固定的胶原..5.处死母鼠并把胎鼠解剖时候;一定要注意母鼠状态;是否有死胎;胎儿胎盘是不是正常;有多少胎;母鼠是多少天的一般是E16-E18这些信息也要严格记录..处死孕鼠后;要立即取出子宫放入冰冷培养液中..注意孕鼠处死后要短暂的浸泡酒精消毒;防止污染..一般来说;冰袋笔者选择一面蓝一面白的..蓝的朝上;可以很清晰看到海马结构..而去除血管膜的时候;白的那面朝上;这样可以很清楚看到血管膜..从处死老鼠到大脑被剥离出这段是人就会做;我就不多说了..不过有一点要注意;不管你是用皮层还是海马;不要取一个分离一个;而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出放到冰预冷的培养液中..我建议胎鼠取出来的时候胎鼠就放在冰冷的缓冲液中..就是说;处死后要迅速把大脑的温度降到0.6：最影响原代培养的成败因素之一：这小段请大家一定注意看..无论皮层还是海马;上面都是有一层血管膜..注意：一定要尽可能的去掉所有的血管和血管膜..可以用解剖显微镜..胎鼠很好剥离;而新生鼠则比较难..这里千万不能粗心大意血管膜没剥离干净的后果是：1 吹打时候很难吹打下来神经元;被迫多次吹打;造成神经元大量死亡；2 血管膜一部分细胞会混入原代培养中;这些细胞往往会分裂;导致你的培养成果根本不能用..可以说;剥离的不好不干净;实验就是失败的;不可能得到高质量的神经元..注意的事情二：如果是要的是皮层的神经元原代培养;而皮层的细胞很多;切忌不要放太多皮层消化吹打过多的细胞反而会导致神经元大量死亡..另外;请仔细注意文献中要的是皮层哪一部位..没有详细要求的话一般是取顶端..从大脑到单个海马的剥离我不细说了..我现在以海马神经元为例..在所有海马都成功剥离后;请仔细的去除血管膜;原因上面说过..最后;请再仔细检查一下是不是都去掉了..确认后;海马片段被移入一个小烧杯里;加少量培养液;用剪刀剪成0.5-1立方毫米的小块;放置冰上准备消化;7：实验成败的关键之二：消化..一般来说;我看很多人都用0.125%的胰酶消化..实话说;胰酶消化非常的难以掌握速度;而且消化效果真的是--很烂稍微不注意;就会消化过头;细胞都消化光了..而胰酶消化的快;还会出现细胞快速破裂释放出DNA;和其他蛋白缠结成絮状包裹在组织块外面;使得块里面的不到应有的消化..所以我个人不推荐胰酶..想做一个完美成功的消化;我强烈推荐木瓜酶+DNA酶..木瓜酶是消化过后;存活率最高的酶见附图..笔者是配成2mg/ml的木瓜酶..另外要用的是DNA 酶..DNA酶的作用是;消化掉破裂细胞的DNA;避免了释放的DNA和蛋白缠结在组织块表面而阻碍进一步消化..DNA酶由于各个公司的活性不一样;很难有标准浓度;需要摸条件;不过不是很严格;只要能防止DNA缠结就好..木瓜酶的特点是不会消化过头;非常温和..缺点是一定要现配请直接用无血清的培养液配来保证神经元的营养代谢;而且一定要现用现配..消化的技巧：消化时候;很多人有不良习惯;喜欢用个50ml试管装着所有东西..结果是组织都沉底;下面消化不足;上面消化的没细胞..笔者的技巧是;用一个6或10CM 培养皿来消化..这样消化液在培养皿里形成浅而广阔的一层;均匀分布着组织块;从而彻底解决了上述问题..消化酶是2mg/ml木瓜蛋白酶+适量DNA酶..木瓜蛋白酶很便宜请放心..消化过程是20-30分钟..由于木瓜蛋白酶温和;因此不会消化过头;使得你的实验消化的很稳定..消化时候请在37度温箱里;每5分钟稍微摇动一下..注意：1木瓜酶不要用巯基化合物激活;激活后消化好很多但是成活率坏很多；2尽量用不含血清的培养液来配置木瓜酶而不是用hanks;使得神经元保持营养；3木瓜酶一定要现用现配..再次重申：除了消化过程中要37度;其余任何时刻都是要浸泡在0度冰浴的液体中..消化过后可以用1ml血清终止反应我是用马血清;便宜;但是切忌不要用国产血清;污染几率很大..把消化用的培养皿放在冰上冷却;然后垫高一面使得液体集中在另外一面便于吹打..整个体系静止2-3分钟;然后仔细的去掉上层的液体;保留消化过的组织块8.实验成败最关键最关键的：吹打..笔者经验是;没有必要用巴斯德管..对于胎鼠和10天之内的新生鼠;一般的1ml蓝枪头就可以达到满意的效果..在一边被垫高的皿里面;加入1-1.5ml新鲜培养基和少量DNA酶;吹打10次..吹打时候要注意;切忌过快;要缓慢吹打..吸入时候要很缓慢;吹出的时候可以略快;但是也要缓慢..轻柔吹打是细胞成活关键要用进口枪头;国产的有时候会过细..我们采用的是最合理的分步吹打法..每个10次吹打过后;静止2分钟..这时候游离的单细胞在上面;而团块会沉到下面去..上面的那层就是你要的单个悬浮细胞;把它们挪到指定容器里一样要冷在冰上..下面沉淀下去的细胞团块不要丢弃;再加1-1.5ml新鲜培养液;重复刚才的步骤;轻柔吹打;再静止2分钟;转移上层的单细胞到刚才指定容器里;一共这样分步吹打3次..3次之后如果还有团块在下面;请果断丢弃..造成这个的原因就是刚才的血管膜没剥好..这个分步吹打的过程保证了每一个单细胞都避免了过度吹打;而分布吹打又保证了尽可能多的收获单细胞..重申一下;为了保证最大程度收获活细胞;每次吹打之前;可以加入少量DNA酶..这招可以更容易收获大量高质量细胞;尤其是实验材料不足时候..消化和吹打非常忌讳操作的细胞过多;这样反而会使大量细胞死亡..实验者如果是用的皮层这种原材料充足的话;切忌不要放入过多皮层..9可选可不选;但是我建议全选神经元进一步纯化.. 一般来说;收获的细胞悬液已经是很纯的神经细胞了..但是;由于实验者等个人或者客观原因;血管膜可能不会被完全剥离；杂细胞可能也被吹入了细胞悬液；操作者手法不熟练;造成死细胞过多;影响种板等等原因;还是会影响到培养的神经元的质量..为了克服这些;笔者查了一些文献;经过反复测试采用了nycoprep低转速密度-梯度离心..现在这个梯度溶液已经被公司升级为optiprep.稀释时候;NycoPrep 1.077 推荐稀释成 60%;就用刚才悬浮细胞的培养液来配置..注意：1.077被广泛应用于血液中分离血细胞;如果你拿到的nycoprepoptiprep不是1.077;那么请换算一下稀释度值得注意的是;皮层和海马可能需要的稀释度稍微有不同..一般来说;一个10ml梯度离心管中;2-4ml稀释过的梯度液体就够用;取决于你收获的细胞量多少..把你收获的细胞悬液小心的加到稀释好的梯度剂的上面一层;经过1500转不是15000请注意5-8分钟;神经元被高度压缩到梯度面和上面的培养液分界面那一层..而最下面的梯度剂下的沉淀则是细胞团块;血细胞;杂细胞;以及部分小胶质细胞..而最上层最浮头;则是细胞碎片..这样;你就得到了最大限度去除了杂细胞;和细胞碎片;并去掉了一定的胶质细胞的最干净最纯粹的神经元..如果实验者技术精湛;也可以不用这步;但是用这步会效果更好..注意：母液稀释到60%只是参考;具体实验室不同可能略微有差别;要摸条件而不是死记硬背..另外皮层和海马浓度也稍微有差别..有些文献曾经报道;在梯度一定的情况下;一些特定梯度可以分开神经元和少突和其他胶质细胞;但是笔者从来没成功过..10.种板..这一步没有那么非常重要;但是如果没认真弄;浓度的不均一也会使得整个实验失败..记住的是;神经元原代培养是细节决定成败;任何一个环节没处理好;整个实验都会失败..种板密度过低是非常有害的..首先;神经元互相接触的几率小;难以存活和成熟..其次;胶质细胞会大量分裂;导致神经元变得更少;从而得到失败的实验..密度过高也是很有害的..由于营养争抢;密度过高有可能导致局部细胞营养枯竭死亡..另外;高密度会导致细胞聚团;结果也是细胞不正常形态或者死亡;导致错误或失败的实验结果..笔者的经验是6孔板每一个孔要有7×100000 个正好如果是台酚蓝染色只记录活细胞;那么酌情减少密度..注意;注意由于神经元的成熟速度和接种密度有很大关系;所以细胞计数一定要非常严肃认真一定要所有格子都看如果发现计数板细胞不均匀;宁愿重新计数由于接触抑制现象;适当密度的神经元可以抑制胶质细胞生长;从而达到理想的实验由于neurbasal培养液相当昂贵;所以种板时候是不用它的;而第一次换液才用..一般种板时候我们用的是DMEM-HG或者DMEM-F12 +10%马血清..注意一定要进口的..国产杂质很多会导致莫名其妙的细胞死亡..马血清会抑制神经元凋亡并且抑制胶质细胞生长FBS也可以;但是太贵种板注意事项一：种板时候的溶液推荐使用含有谷氨酸的培养液..神经元的NMDA等谷氨酸毒受体一般3天后才会出现..所以种板时候有谷氨酸不会导致细胞毒性反应..而这时候的谷氨酸反而是有利条件;可以促使神经元贴壁;从而提高存活率..注意事项二严格注意种板后都是要摇晃板摇匀细胞;切记千万不能圈圈摇晃圈圈摇晃会导致神经元都集中到培养板的孔中间;导致浓度不均;生长不均匀;会直接导致实验失败..正确的摇法是左右平行翻转角度;然后前后平行翻转角度;千万不要让里面液体画圈注意事项三严格注意种板后过过一定时间要换成正常标准培养神经元的neurobasal+b27+谷氨酰胺的无血清培养液..很多paper是1小时就换液;理由是胶质细胞贴壁差;会除去..但是笔者的经验来看;这是极端错误的1小时换液;神经元还没有完全贴壁;这时候换液会吹下很多神经元;流到孔另外一侧再贴壁;直接照成一个孔内细胞分布不均匀;从而成熟的不均匀..严格来说这种事情直接实验失败..笔者的经验是种板4-6小时换液;但是千万不能超过12小时..原因是：超过12小时;混在细胞悬液中的大量细胞碎片也会牢牢贴壁;而细胞碎片直接影响神经元存活和正常代谢；另外12小时后;胶质细胞会开始分裂;这时候就很难抑制了..笔者推荐是4小时;但是别超过8小时..注意事项四：4小时后换液时;请轻轻摇晃板几下再换..原因：细胞碎片贴壁很慢而且不牢固;这时候的摇晃可以最大程度去掉细胞碎片..然后;注意：细胞请再用没有加血清的;种板时候用的培养液清洗一次;也是要轻微摇晃;来进一步去除细胞碎片;从而得到良好的细胞生长环境..有条件也可以洗两次;但是笔者觉得一次足够..洗了之后吸干液体;换成neurbasal+B27+谷氨酰胺的神经元专用无血清培养基..对于原代培养;是细节决定成败;一个地方不够好会满盘皆输;所以请严肃对待..德国队的fans于凌晨×××××××××ugly分界线××××××××××××下面是对版面一些犯错误的研究方法中最严重的错误之一的提醒;请大家注意;我把回帖编辑到这里了..enjoy.刚回答了一系列形形色色的问题;我把这个问题挑明了说..如果您不相信 neurobasal最好的而还是坚持用DMEM之类的培养液;麻烦检查一下你们的DMEM或者MEM或者DMEM-F12的invitrogen产品序列号;到网站上检查下相应的组成公式..很多这种培养液都是含有谷氨酸;而且是mmol级的..成熟的神经元10um的谷氨酸即可照成细胞凋亡;而谷氨酸受体4-6天就开始表达;如果胎鼠神经元经历了mmol浓度的培养液中的谷氨酸还不被毒死;那就是怪事了..新生鼠不受这个限制;新生鼠原代培养没有有功能的 NMDA受体;×××××××××××ugly 分界线××××××××最雷到我的;是板上有人用材料非常混乱;一会用胎鼠;一会用新生鼠;一会成年鼠的你们这叫对自己不负责任 we do all cases seriously 而不是凭借肉眼观察和猜测..做原代培养的;首先就是收集大量背景文献;看看你的相关要求的国际公认的做法是用哪种..胎鼠和新生鼠虽然形状一样;但是神经元的功能一点都不一样;表达受体都不一样.. 大部分实验都是用胎鼠;而新生鼠往往用来培养测一些LTD之类的not quite sure;文献太少;所以有人问我新生鼠的问题;我都是说你先看下背景文献是不是你搞错了..而成年鼠是另外的培养方法;要求更小心仔细和特别的处理..硬套胎鼠的原代培养必然导致失败..另外;在一些药物保护实验中;不要以为NGF就一定对神经有很大作用;笔者的经验是;想要细胞存活;FGF2是最佳选择但是;FGF2会导致细胞变化很大;所以还是别用在原代培养中;不过成年鼠培养一定要用FGF2..对于一些雷到我的;我只能再次说;请收集足够的背景文章在去选择合适材料;please do it carefully and seriously祝大家都能培养出健康漂亮的神经元;欢迎大家来问问题如果是美女的话;给个电话我会很开心声明;除了最后一幅图是来自别的文献;前面所有的经验都是我的原创;从无数失败总结出的我认为最完美的神经原代培养..最后提醒大家注意：nycoprepoptiprep可能有很多浓度;但是NycoPrep 1.077 以前是最常用的;笔者默认的就是用这个溶液配置的密度梯度..如果您买到的不是这个密度;请换算一下..笔者当时只有NycoPrep 1.077在中国能买到;现在可能会有更多浓度供选择;请大家注意换算..。
血管性痴呆小鼠海马神经元JNK的表达及意义
ｓｏ ｅｅ ，ｔｅｓｉ ｍｉｇｔ ｅｗ ｓｐｏ ｎｅ ，ａ ｄｔ ｒ ｒｉ ｅ ｅｅｉｃｅｓｄ Ｐ＜ ０ ５ ． ｅｉ ｕ ｏｉｏｈ ｍ ｃｌ ｈ ￣ ｎｄ ｈ ｗｍ ｎ ｍ ａ ｒｌ ｇｄ ｎ ｅｅ ｏ ｔ ｓｗ ｒ ｎ ｒａｅ （ ｉ ｏ ｈ ｒ ｍ ． ）Ｔ ０ ｈ ｍｍ ｎ ｈｓ ｃｅ ｉａ ｔ
实用 医学杂 志 ２ １ ０ ０年第 ２ ６卷第 ３ 期
３９ ７
血 管性 痴呆 小 鼠海 马神 经 元 Ｊ Ｋ的表 达及 意义 Ｎ
王 雪笠 吕佩 源 冯连 元 张 笋 甄 宁 黄 通瑞
摘要 目的 ： 探讨血 管性 痴呆 小鼠海马神 经元 Ｊ Ｋ的表达及其 意义。 Ｎ 方法 ： 应用双侧颈 总动 脉线结反 复缺血一 再灌 注法制备 血管性痴 呆小鼠模 型 ， 并设正 常组 、 手术组 、 管性痴 呆模 型组 （ 假 血 模型 组） 利 用跳 台试验 和水迷 宫 。 试验观测 其行 为学改 变， 应用免疫 组化技 术观测其 海马神 经元 Ｊ Ｋ的表达 变化 。结果 ： 型组 小鼠与 正常组、 手 Ｎ 模 假 术组相 比较 ， 模型 组ｄ 鼠学 习成绩 为跳 台试验反应 时间长 ， 、 游全程 时间长 ， 误 次数 多。记忆成绩 为跳 台试验潜伏 错
ａ ｄ ｓ ａ ｏ ｅ ａｉｎ ｇ ｏ ｐ，ｔ ｅｌａ ｎ ｎ ｓ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ｅ ｒ ｓ ｏ ｓ ｉ ｎ ｅ ｓ ｉ ｎ ｈ ｍ ｐ ｒｔ ｒ ｕ ｏ ｈ ｒ ｉ ｇｔ ｔ ｈ ｗｅ ｔ ｈ ｅ ｐ ｎ ｅｔ ｅ ｅ ｈ ｔ ｍｅａ ｄ ｔ ｗ ｍｍｉ ｇｔ ｆ ｈ ｎ ｉ ｏ ｍｅ ＶＤ ｄ ｌ ｇ ｏ ｐ ｗ ｒ ｍｏ ｅｓ ｒ ｕ ｅ ｅ
ｉ ｍｍｕ ｏ ｉ ｏ ｈ ｍｉａ ｘ ｒｓｉｎ ｏ ＮＫ ｗ ｒ ｂ ｅｖ ｄ ｉ ｈ ｈｅ ｒｕ ｓ ｎ ｈｓ ｃ ｅ ｃ ｌｅｐ ｅｓｏ ｆ ｔ Ｊ ｅｅｏ ｓｒｅ ｎｔｅｔｒｅｇｏ ｐ ．
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小鼠海马神经元的培养
小鼠海马神经元的培养
一、实验材料：
1、所有用于细胞培养的器械、器皿剂溶液必须灭菌消毒。
2、多聚赖氨酸铺板以磷酸盐缓冲液(PBS)或蒸馏水溶解多聚赖氨酸
（分子量为30-70KD）至1mg/ml。分装储存。临用前稀释至终浓度为
20-60mg/ml过滤备用。在培养板或皿中加少量多聚赖氨酸溶液，以
覆盖底部为宜，在37℃、CO2孵箱中过夜。次日，用移液管吸取多聚
赖氨酸，并用水洗2-3遍，晾干备用，如果培养目的适用于电生理的
单细胞记录或者免疫组化和荧光染色，则在培养皿的底部加上盖玻
片，多聚赖氨酸铺于盖玻片上，则更易得到强烈的荧光信号。
3解剖液（HEPES平衡盐溶液）取100ml10x平衡盐溶液（Hank’s
balancesaltsolution,HBSS）
HEPES3.9g,
NaHCO30.84g，
青霉素104U,
链霉素100mg，
H2O800ml。
以1mol/LHCl调节PH至7.2，再加H2O之后总体积为1L，以0.2μm
直径的滤菌器过滤，4℃保存。
4、DMEM培养基（Dulbecco’smodifiedEagle’smedium）DMEM培
小鼠海马神经元的培养
养基500ml，加小牛血清和或马血清各10%（血清需经56℃，30min灭
活）1%的青/链霉素.
5、无血清培养基最常用的一种无血清培养基为，Neurobasal+2%
的b27+1%抗生素
6、2.5%胰蛋白酶（typsin）溶液临用前以解剖液稀释至终浓度
0.125%。
7、台盼蓝(typanblue)溶液终浓度为0.2%-0.4%。
8、阿糖胞苷终浓度为8-10μmol/L。
9、动物妊娠天数的选择通常选择出生24h之内的乳鼠。
二、实验步骤：
1、脱臼处死乳鼠，75%的酒精浸泡3-5min，将清洗完的乳鼠放入含预
冷解剖液的培养皿中。
2、用两把尖镊逐个去除鼠的头部皮肤和颅骨，取出全脑，置于另一
含预冷解剖液的（PBS）培养皿中，小心剥离并去除脑膜及脉络丛。3、
在中线处用尖镊分离大脑半球，在解剖显微镜下小心去除嗅球、中隔、
丘脑及下丘脑，剥离脑膜及脉络丛，在大脑皮层下方小心取出海马，
置于含冰冷解剖液的6cm培养皿中。
4、用弯头尖镊把海马剪成小碎片，收集全部海马碎片，置于一含有
0.25%胰蛋白酶溶液的培养皿中（该溶液必须在37℃孵箱中预暖）,
在孵箱中消化5-7min。
5、收集全部海马碎片，置于10ml预暖的DMEM培养基的试管中（培
养基中含有10%的胎牛血清和或马血清各，1%抗生素，以及谷氨酰胺）。
最好用培养基洗2-3遍，以中止消化反应。
6、加少量培养基于试管中，以中空塑料管反复吹打10-15次，直成
细胞悬液。加培养基于同一试管中至约10ml，静置约10min。取1-2μl
细胞悬液于99μl0.2%-0.4%台盼蓝溶液中，用细胞计数板计算存活
和死亡的细胞数，从而测定细胞密度(细胞计数：活体细胞具有排斥
台盼蓝的能力，而死亡细胞则能吸收台盼蓝变成蓝色)。
7、根据实验需要，以培养基稀释细胞悬液至所需的细胞密度，接种
细胞至经多聚赖氨酸铺板过夜处理的培养皿或培养板中。通常细胞密
度为（2-2.5）x105细胞/cm2.
8、待6-8h细胞贴壁后，换培养基为含2%B27的Neurobasal，含有
B27和0.5mM的谷氨酰胺。
9、培养2-3d培养基中加入8-10μmol的阿糖胞苷，以抑制或阻止非
神经细胞和原代胶质增殖。
10、每三天用Neuronbasal使用液半量换液
三、形态学观察
细胞接种6-12h，开始贴壁，细胞成圆形或椭圆形，两周后神经元最
为丰满，胞体圆形或多角形，四周晕光明显，胞核及核仁清晰可见，
位于细胞中央或一边，神经多而粗大，分支成网络。培养一月后，细
胞开始退化。一般认为，培养2-4周开始实验比较适宜。
四、注意事项
1、L-多聚赖氨酸（0.1mg/ml）包被培养板后，要待其干后才能接
种，因为其对神经元有毒性。L-多聚赖氨酸（0.1mg/ml）能回收再利
用。
2、取脑组织时动作尽量要快，并且尽量低温操作。
3、分离皮层和海马时，要尽量分离脑膜和血管，否则有大量的成纤
维细胞。
4、用吸管轻轻吹打细胞时，尽量不起泡沫，以免损伤神经元。
5、接种细胞的过程，动作要快，以免细胞聚集。
6、接种细胞后，24h勿移动，以免影响细胞贴壁。
五、结果、
大多数神经元在接种1h内贴壁，3-5h开始变平，并长出1-2个突起。
3天后，许多细胞从胞体长出数个突起。神经元在7-10天开始成熟，
胞体逐渐长至30-40um,晕光明显，胞核和核仁清晰可见，突起变粗，
变长并且有分支，边缘清楚，发亮，形成明显的神经网络。神经元可
存活1-2月。
附：
一、血细胞计数法及台盼蓝测细胞活度
（一）
实验材料和实验前准备
1、显微镜，血细胞计数器，盖玻片
2、毛细移液管，1ml血清移液管，5ml试管，擦镜纸或软布
3、0.4%的台盼蓝溶液，0.3%苯胺黑（nigrosin）溶液，95%，乙醇
4、用擦镜纸或者软布将血细胞计数板的计数池擦干净。再
用酒精95%血细胞技术板和盖玻片，晾干备用。
5、讲清洁干净的盖玻片覆盖于血细胞技术板的计数池上。
6、胞浓度=4大格细胞数/4×稀释倍数×104/m
（二）实验步骤
1、制备制备细胞悬液取一试管，分别加入0.4%台盼蓝溶液0.2ml
(或0.3%苯胺黑溶液)及混合均匀的细胞悬液0.8ml，用手轻柔振荡
试管，以混合悬液和染料。
2、以中空移液管轻柔混匀细胞悬液后，立即用毛细移液管吸取少量
细胞悬液，置移液管尖头于细胞计数板计数池的边缘（小心不要移动
盖玻片），缓缓释放细胞悬液。通常一侧计数池可以容纳20ul细胞
悬液。
3、细胞计数每个正方形的边侧都有三根线，在左侧和上方，应将
接触到三根线的中线的内侧线的细胞计算在内，技术两侧计数池，共
八个正方形。