小鼠大脑皮层神经元原代细胞培养
神经元原代培养实验报告
一、实验背景神经元是神经系统中最基本的结构和功能单位，研究神经元生物学特性对于理解神经系统疾病和开发新的治疗方法具有重要意义。
神经元原代培养是研究神经元生物学特性的重要方法之一，它能够模拟体内神经元的生长和发育过程，为神经元生物学研究提供了一种有效的手段。
二、实验目的1. 掌握神经元原代培养的方法和步骤。
2. 观察神经元原代培养过程中的形态学变化。
3. 分析神经元原代培养过程中细胞生长、增殖和分化情况。
三、实验材料1. 实验动物：E17-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠。
2. 试剂：含10%胎牛血清的DMEM培养基、神经元维持培养基(NeurobasalB27谷氨酰胺）、胰蛋白酶、抗神经丝抗体、荧光染料等。
3. 仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器等。
四、实验方法1. 取E17-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠大脑皮质，用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液。
2. 将细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3. 每天观察细胞生长情况，记录细胞形态学变化。
4. 培养第3天，进行细胞计数，观察细胞生长速率。
5. 培养第5天，进行免疫荧光染色，观察神经元纯度。
6. 培养第10天，进行神经元分化实验，观察神经元功能。
五、实验结果1. 细胞形态学观察：神经元原代培养过程中，细胞从圆形逐渐转变为梭形，并逐渐出现突起，形态逐渐成熟。
2. 细胞生长速率：培养第3天，细胞生长速率为（2-4）×10^4个/皿；培养第5天，细胞生长速率为（4-8）×10^4个/皿。
3. 神经元纯度：免疫荧光染色结果显示，神经元纯度达到90%以上。
4. 神经元分化实验：神经元分化实验结果显示，神经元在培养过程中逐渐分化为不同类型的神经元，如运动神经元、感觉神经元等。
六、实验讨论1. 神经元原代培养过程中，细胞形态学变化与体内神经元生长和发育过程相似，为研究神经元生物学特性提供了有力手段。
2. 细胞生长速率受多种因素影响，如培养基、温度、CO2浓度等。
小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材方法原代培养是指直接从体内取下的细胞、组织和器官，经过清洗、剪切、分散等步骤后，立即进行培养的过程。
小鼠细胞原代培养取材方法主要包括以下步骤：1. 实验前准备：在超净工作台或生物安全柜中进行，确保无菌环境。
2. 取材：选择健康的成年小鼠，使用颈椎脱臼法处死小鼠。
用70-75%酒精对烧杯进行消毒，将整个小鼠浸入盛有纯酒精的烧杯中浸泡1分钟进行消毒。
3. 打开腹腔：取出小鼠，将其放在不锈钢手术盘中，用无菌手术剪打开腹腔。
4. 取出组织：小心将所需组织从体内取出，放入无菌培养皿中。
5. 清洗组织：用70-75%酒精擦拭培养皿外周后，将培养皿移至超净工作台或生物安全柜中，用含双抗的Hanks液洗涤组织数遍以去除血污。
6. 剪切组织：在体视显微镜下操作，用无菌手术器械去除多余组织，用解剖镊子或眼科剪将组织剪碎至1立方毫米的肉糜状。
7. 消化组织：将剪碎的组织放入含解离液或培养基的50ml离心管中，用10ml弯头滴管对组织进行吹打5-10次，然后用1ml枪头的吹打组织，最后用200μl的尖端进行吹打。
8. 过滤分散：将上述组织悬液通过70μm过滤器过滤，切碎和分散的组织悬浮液。
9. 离心收集细胞：在1200rpm、4℃下离心10分钟，弃掉上清液，加入配置好的细胞培养基重悬细胞。
10. 接种细胞：将细胞接种于经多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。
注意事项：取材过程应在无菌环境中进行，确保整个过程不受到污染。
操作时要小心，避免损伤组织。
使用的仪器和器皿均应进行消毒处理。
培养基和试剂应选择适宜的种类和浓度。
培养条件要保持恒定，包括温度、湿度、CO2浓度等。
在实验过程中要密切观察细胞生长情况，及时发现和处理异常情况。
以上是小鼠细胞原代培养取材方法的简要步骤，具体操作可能因实验需求和条件而有所不同。
建议在进行实验前仔细阅读相关文献和资料，并咨询专业人士的建议和指导。
神经元原代培养方法
神经元原代培养方法
从孕17-18天的雌鼠的胎儿分离神经元细胞。
孕雌鼠麻醉然后解剖，胎
儿收集到HBSS-1中然后快速断头。
剥离脑膜和白质后，大脑皮质收集
入 HBSS-2 液中机械磨碎。
皮质碎片移到有0.025%胰酶的HBSS-2液中3 7°C消化15分钟。
胰酶消化后，细胞用含有10%胎牛血清的HBSS-2液冲
洗两次，用神经基础培养液重悬细胞（培养液添加了0.5mM左旋-谷氨
酰胺，25μM左旋-谷氨酸，2%B27和0.12mg/mL庆大霉素）。
以1×105c
ell/cm2接种到事先用多聚赖氨酸包被的培养皿上，放到37°C，5%CO2
湿温培养箱里进行培养。
每3天用吸管换液，一次换0.5mL。
体外培养8
天细胞就能用于实验。
选用17-18天的胎鼠能够提高神经元培养的效率，因为与乳鼠相比胚胎
组织的细胞连接还很少。
因此，用乳鼠会使神经元的分离更加困难，
会造成细胞连接不可逆的损伤，细胞之间的共同的轴突和树突更容易
发生损伤。
另外，用出生后1天内的大鼠皮质培养容易有胶质细胞污染，而用胎鼠则可以避免这种情况。
如果用的是乳鼠，一般是在培养36个
小时后加入阿糖胞苷，抑制胶质细胞生长。
另外，如果把分化的影响看成是考虑的重要因素，可以用培养4天的、
8天的、18天的细胞。
其中一个例子可以是观察毒性物质对小孩和成年
的不同效应。
小鼠背根神经节神经细胞的原代培养新方法
小鼠背根神经节神经细胞的原代培养新方法小鼠背根神经节神经细胞原代培养是神经学研究、药物筛选及细胞病理学研究中必不可少的一环。
本文将介绍一种新的小鼠背根神经节神经细胞原代培养方法的步骤及注意事项。
步骤1: 动物处理。
用取出小鼠的背根神经节放入无菌的PBS缓冲液中搅拌7-8分钟，使神经节中的细胞离体，并通过多次离心来去除PBS缓冲液。
步骤2: 细胞悬浮。
将含有神经细胞的细胞悬液用1mL冰冷的PBS缓冲液洗涤2次。
再用1mL冰冷的70%酒精进行紧密覆盖，静置5分钟。
再用PBS缓冲液洗涤5次，最后用DMEM/F-12添加10%胎牛血清（FBS）调整至适当浓度。
步骤3: 细胞培养。
将细胞悬液转移到含有0.1%聚赖氨酸的DMEM/F-12培养基中，距离表面1cm左右，进行孵育24-48小时。
孵育室应控制在37℃的恒温条件下，同时CO2含量应设定在5%。
步骤4: 原代细胞出现。
24-48小时后，可见到原代神经细胞在培养皿中生长，而其他非神经细胞则无法生长。
这是因为神经元比其他细胞易受到聚赖氨酸的作用，从而对组织细胞进行筛选。
步骤5: 细胞传代。
当原代细胞数量足够时，可进行细胞传代。
将同等的DMEM/F-12培养基中加入0.5%胰酶，将原代细胞取下进行培养。
注意事项：1.处理过程中必须保持无菌，防止微生物污染。
2.神经节处理过程中的时间要注意，过久会导致细胞死亡，过短则分离不完整。
3.使用的培养基及化学试剂要质量优良。
4.培养条件要严格控制，CO2含量及温度要保持恒定。
本文介绍的方法较为简单易行，对于初学者或初学者也容易了解。
但细胞培养中实验操作需要非常谨慎，为保证实验的准确性和有效性，一定要保证实验过程中的无菌、温度、CO2含量和实验技术的高效性。
原代神经细胞培养
原代神经细胞培养新生鼠神经元细胞的培养准备工作：1、解剖器械一套（实验室有专门用于细胞间取材用的成套器械），需提前一天灭菌，过夜烤干。
2、试剂、溶液：Neuralbasal培养基（2mM glutamine）；D-PBS缓冲液；0.25%trypsin/0.02%EDTA消化液；0.05%poly-lysin。
3、包被玻片：干烤灭菌12 x 12mm2玻片，12孔板。
包被过程：0.05%poly-lysin滴于置培养板中的盖玻片上（注意勿溢出玻片），37℃放置12hr后纯水洗3遍，晾干。
4、操作中所用枪头均用剪刀剪去枪头尖，然后在酒精灯上迅速过一下抛光。
取材：1、从-200C取出三个冰袋，预冷若干皿D-PBS，一大皿用于冷却剥出的脑子，另外的35mm的皿用于冷却分离出的脑组织，如：海马，皮层，下丘脑等，分离几个部位就预冷几小皿D-PBS，小皿盖子上做好标记，第三个冰袋上放一皿盖，上面放灭过菌的滤纸，用于剥离脑子的操作。
2、取1-3天鼠，75％酒精浸泡片刻后，用大剪子断头处死。
3、弯头眼科剪剪开颅骨，取出完整脑至盛有预冷D-PBS的培养皿中，在体式镜下分离相应部位的组织,分别放在相应的皿中。
4、将组织块用弯头眼科剪剪碎，每小块约2mm3左右，用枪移入5mlEP中，稍为沉淀1分钟，吸弃上清，加入0.25%trypsin/0.02%EDTA，37℃消化10-15分钟左右，期间每3分钟颠倒几下。
注：每四个海马用胰酶1ml，每个皮层用胰酶2ml。
5、消化完毕，每毫升胰酶加入100ul血清以终止胰酶，颠倒混匀；1000rpm，4分钟，离心沉淀。
6、吸弃上清，注意不要将组织吸出。
7、加入37℃预热的1-2ml DMEM／10%FBS，用枪头吹打20下左右，此时液体浑浊，组织块明显变小。
8、放置沉淀3分钟左右，可见组织块沉底，吸取上清，其中包含所要的细胞。
9、计数，将细胞密度调整至2－4 x 10 5 /ml后接种于预先用poly-lysine包被过的盖玻片或皿上，100ul每玻片（12 x 12mm玻片）。
神经细胞图片集锦2
十、1.细胞种类：原代小鼠大脑皮层神经元 2.培养的天数：6d 3.放大倍速：20X4.培养基种类：DMEM/F12+2%B275.细胞状态与特征简述：细胞体积增大，突触发育完全，开始形成网络十一、1.细胞种类：原代小鼠大脑皮层神经元 2.培养的天数：7d 3.放大倍速：20X4.培养基种类：DMEM/F12+2%B275.细胞状态与特征简述：1抗Rabbit Anti-NSE，二抗Cy3-羊抗兔IgG，DAPI复染细胞核十二、【原创】原代培养大脑皮质神经元甲苯胺兰染色1、细胞种类：SD大鼠大脑皮质神经元2、培养天数：6天3、放大倍数：倒置显微镜200倍4、培养基种类：Neurobasal-B275、细胞状态及特征：胞体呈椭圆形、梭形、贴壁生长。
神经网络明显，细胞核淡染，偏于一侧。
尼氏颗粒明显，分布于胞浆。
十三、【原创】神经干细胞1.细胞种类：SD大鼠海马来源的神经干细胞；2.培养的天数：11天；3.放大倍速：（相差显微镜）200倍；4.培养基种类：DMEM-F12；5.细胞状态与特征简述:细胞呈克隆球状生长十四、1.细胞种类：SD乳鼠海马神经元； 2.培养的天数：12D； 3.放大倍速：100倍；4.培养基种类：90% DMEM+5% HS+1% N2 Supplement+1% glutamine+1% Penicillin-Streptomycin+2% B27 Supplement；5.细胞状态与特征简述:海马神经元某蛋白免疫荧光(FITC标记)十五、【原创】原代皮质神经元1、细胞来源：新生SD大鼠2、培养的天数：10d3、放大倍数：倒置显微镜×2004、培养基种类：DMEM/F12＋10％FBS＋双抗5、细胞特征简述：采用尼氏染色法—可见偏向胞体一侧的空泡状核，另外周边有深染的尼氏小体颗粒，神经细胞网络形成明显。
十六、【原创】原代培养神经干细胞抓拍分裂!1、细胞种类：大鼠神经干细胞分裂2、培养天数：3天3、放大倍数：倒置显微镜100倍4、培养基种类：DMEM+10%新生牛血清5、细胞状态及特征：呈椭圆形，贴壁生长。
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版资料
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why. 为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。
相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。
我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。
9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。
（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3）本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。
1.材料选择。
一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。
胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。
因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。
和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。
很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。
2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。
我强烈不建议用血清培养。
原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。
严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。
Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。
小鼠原代神经元细胞的分离
原代神经元细胞的分离培养（小鼠）
本实验是自己实验室平时做的（仅供参考）
实验材料的准备：出生24h以内的小鼠若干只；预冷的pbs（不含钙、镁离子）；DMEM（高糖）培养液（实验之前预热）；75%酒精；尖头镊子、小剪刀；含EDTA的胰酶（实验之前预热）；神经元细胞培养液；灭菌的1.5mlEP管若干只
实验阶段：（整个操作保持无菌）
1，取小鼠用酒精擦拭全身，用剪刀剪下小鼠头部，小心剥下头皮和脑壳后取出整个脑子放入预冷的pbs中（也可以把pbs放在冰盒上面）
2，用剪头镊子小心剥下脑膜、小脑和大脑中的血管后将其放进1.5mlEP管中
3，用小剪刀反复剪（感到手很累了为止），然后用1ml枪头将其加入预热的胰酶中，反复吹打几次后放进37℃ 5%CO2培养箱中孵育20min，期间晃一晃有利于重复消化
4，消化时间到了之后，用含血清的DMEM培养液终止消化后，用吸管反复吹大几次
5，过筛网：用大概200目的筛网过滤后，计数种于培养皿中（培养皿提前一天用多聚赖氨酸包被）（6cm dish种300w个为好）
6，24h后，换成神经元培养液，48h后加入5-氟-脱氧尿苷（终浓度20ug/ml），以后每3-4天换半液。