神经元原代培养
原代神经元培养
神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。
一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。
由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。
器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。
3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。
凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。
5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。
6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。
辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。
2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。
本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。
2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。
各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。
3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。
神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。
目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。
4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。
分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。
5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。
先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。
用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。
神经元原代培养实验报告
一、实验背景神经元是神经系统中最基本的结构和功能单位，研究神经元生物学特性对于理解神经系统疾病和开发新的治疗方法具有重要意义。
神经元原代培养是研究神经元生物学特性的重要方法之一，它能够模拟体内神经元的生长和发育过程，为神经元生物学研究提供了一种有效的手段。
二、实验目的1. 掌握神经元原代培养的方法和步骤。
2. 观察神经元原代培养过程中的形态学变化。
3. 分析神经元原代培养过程中细胞生长、增殖和分化情况。
三、实验材料1. 实验动物：E17-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠。
2. 试剂：含10%胎牛血清的DMEM培养基、神经元维持培养基(NeurobasalB27谷氨酰胺）、胰蛋白酶、抗神经丝抗体、荧光染料等。
3. 仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器等。
四、实验方法1. 取E17-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠大脑皮质，用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液。
2. 将细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3. 每天观察细胞生长情况，记录细胞形态学变化。
4. 培养第3天，进行细胞计数，观察细胞生长速率。
5. 培养第5天，进行免疫荧光染色，观察神经元纯度。
6. 培养第10天，进行神经元分化实验，观察神经元功能。
五、实验结果1. 细胞形态学观察：神经元原代培养过程中，细胞从圆形逐渐转变为梭形，并逐渐出现突起，形态逐渐成熟。
2. 细胞生长速率：培养第3天，细胞生长速率为（2-4）×10^4个/皿；培养第5天，细胞生长速率为（4-8）×10^4个/皿。
3. 神经元纯度：免疫荧光染色结果显示，神经元纯度达到90%以上。
4. 神经元分化实验：神经元分化实验结果显示，神经元在培养过程中逐渐分化为不同类型的神经元，如运动神经元、感觉神经元等。
六、实验讨论1. 神经元原代培养过程中，细胞形态学变化与体内神经元生长和发育过程相似，为研究神经元生物学特性提供了有力手段。
2. 细胞生长速率受多种因素影响，如培养基、温度、CO2浓度等。
神经元原代培养 丁香园
（丁香园protocol 2008）一、常规的试剂配制：1、培养基：选用高糖型DMEM/F12 (1:1)培养基干粉（含15 mmol Hepes），每升培养液中加入碳酸氢钠1.8 g，调节pH值7.0，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后，加入谷氨酰胺、无菌的青霉素和链霉素液，使其终浓度分别为0.5 mmol/L 、100 U/ml和100 μg /ml，分装后置于4℃保存，临用前加入2%的B27。
神经细胞代谢旺盛，选用高糖型培养基；谷胱甘肽可保持培养基还原状态，营养成分稳定；B27是公认的刺激神经元生长的营养因子，不过价格挺贵；PH值很关键，Hepes是优秀的缓冲系统，pH值调好后能保持很长时间；2、多聚赖氨酸溶液的配制：称取1.5 mg L-多聚赖氨酸溶于100 ml PBS，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于4 ℃保存，可长期使用；3、磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：称取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.85 g Na2HPO4•12H2O 和0.2 g KH2PO4充分溶于900 ml dd H2O，调节pH值为7.2，补dd H2O至1000 ml并分装，高压灭菌（121～126 ℃），4 ℃备用；4、D-Hanks液的配制：称取KCl 0.4 g，KH2PO4 0.06 g，NaCl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，Na2HPO4•12H2O 0.08 g，溶于dd H2O中，调节PH值为7.2，定容至1000 ml，高压蒸汽灭菌（121～126 ℃），4℃备用；5、0.25%胰蛋白酶的配制：称取0.25 g胰蛋白酶粉末，少许D-Hanks溶液调成糊状，用D-Hanks定容至100 ml，混匀，冰箱内放置过夜，滤纸过滤后，0.22 m微孔滤膜过滤，分装，-20 ℃保存。
二、试验操作过程：1、包被：培养前晚上将培养瓶（板）用多聚赖氨酸包被10 min，吸除，无菌操作台上15min 自然晾干，置于培养箱中备用；2、取脑：选取新生24 h的SD大鼠数只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，D-hanks液洗数次；（预先准备至少4把眼科剪刀，分别用于断头、剪头皮和剪颅骨及第3步的剪组织这4个操作）3、分离：以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮层，暴露出新月状海马回，小心夹出海马组织，置于冰浴的D-hanks液中，仔细剔除微血管，用充分剪碎组织；4、消化：加入同体积0.125%的胰蛋白酶，瓶口用锡箔纸盖上，37 ℃培养箱内消化20 min 左右，期间轻摇数次；过滤：加入数滴胎牛血清终止消化，用尖头吸管轻轻吹打细胞数分钟，至液体成米糊状即停止吹打，动作要轻柔，用150目网筛过滤，收集细胞悬液；5、接种：以1100 rpm离心5 min，倾去上清，用DMEM/F12培养液重悬细胞，轻轻吹打，台盼蓝染色快速计数，根据计数结果，调整细胞终浓度为1 00000个/ml，加入终浓度为10%胎牛血清后接种于培养瓶（板）中，置于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养；12小时内禁止晃动6、换液：接种后24 h将培养液全量换成无血清DMEM/F12培养液，第48 h时加入终浓度为10 μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞的过度生长，随后每3 d半量换液。
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why. 为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。
相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。
我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。
9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。
（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3）本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。
1.材料选择。
一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。
胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。
因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。
和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。
很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。
2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。
我强烈不建议用血清培养。
原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。
严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。
神经元原代培养方法
神经元原代培养方法
从孕17-18天的雌鼠的胎儿分离神经元细胞。
孕雌鼠麻醉然后解剖，胎
儿收集到HBSS-1中然后快速断头。
剥离脑膜和白质后，大脑皮质收集
入 HBSS-2 液中机械磨碎。
皮质碎片移到有0.025%胰酶的HBSS-2液中3 7°C消化15分钟。
胰酶消化后，细胞用含有10%胎牛血清的HBSS-2液冲
洗两次，用神经基础培养液重悬细胞（培养液添加了0.5mM左旋-谷氨
酰胺，25μM左旋-谷氨酸，2%B27和0.12mg/mL庆大霉素）。
以1×105c
ell/cm2接种到事先用多聚赖氨酸包被的培养皿上，放到37°C，5%CO2
湿温培养箱里进行培养。
每3天用吸管换液，一次换0.5mL。
体外培养8
天细胞就能用于实验。
选用17-18天的胎鼠能够提高神经元培养的效率，因为与乳鼠相比胚胎
组织的细胞连接还很少。
因此，用乳鼠会使神经元的分离更加困难，
会造成细胞连接不可逆的损伤，细胞之间的共同的轴突和树突更容易
发生损伤。
另外，用出生后1天内的大鼠皮质培养容易有胶质细胞污染，而用胎鼠则可以避免这种情况。
如果用的是乳鼠，一般是在培养36个
小时后加入阿糖胞苷，抑制胶质细胞生长。
另外，如果把分化的影响看成是考虑的重要因素，可以用培养4天的、
8天的、18天的细胞。
其中一个例子可以是观察毒性物质对小孩和成年
的不同效应。
大鼠海马神经元原代培养
汇报人：何克宇
S
实验要点
S 取活体细胞
S 令海马神经元贴壁生长
S 神经元培养液
实验材料
S 动物：大鼠胎鼠（15~20天）
S 试剂：多聚赖氨酸
解剖液（DMEM+PBS） 0.125%胰蛋白酶
S 培养液：①DMEM+F12+10%胎牛血清
②Neurobasal+2%b27+1%双抗
1. 胰蛋白酶（预暖）消化15min，3~5min震荡一次。
2. 静置2min，去上清，PBS洗两遍终止消化 3. 加入DMEM，吹打，取上清。重复3次。 4. 种板，培养液（DMEM+F12+10%胎牛血清），细
胞密度3.5*105/cm2
抗）
Thank You
实验步骤
1.器械灭菌 2.多聚赖氨酸（PLL）铺板
0.1mg/ml，包被30min，吸去多余PLL，
过夜晾干
实验步骤
1.孕鼠颈椎脱臼处死，取胎鼠 2.胎鼠断头，置于PBS，取全脑，置于解剖液（冷） 3.体视显微镜下沿中线分离半球，取海马，仔细分离血 管和膜性组织。（快、干净）
实验步骤
实验步骤
神经元原代培养方法
一、器材二氧化碳培养箱(Forma Series Ⅱ Water Jacketed CO2 Incubator) Thermo公司；SW-CJ- 2F 型超净工作台苏州安泰空气技术有限公司;80- 2B 型离心沉淀机盐城市科学仪器厂;LS-B50L 立式压力蒸汽灭菌器江阴滨江医疗设备厂;AB104 － N 电子天平上海电子仪器厂倒置显微镜 OLYMPUS-IX71二、试剂Neurobasal®-A Medium (1×)无血清培养基 500ml 美国Gibco公司；B-27 Supplement(50×) 10ml 美国Gibco公司DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium) Invitrogen公司胰酶（Trypsin 1:250） 5g Solarbio公司；多聚赖氨酸( Poly-L-Lysine，MW 150000- 300000) 25mg Solarbio公司；无支原体胎牛血清四季青浙江天杭生物科技有限公司;马血清（特级）北京元亨生物技术有限公司;注射用硫酸链霉素 100万单位/瓶华北制药股份有限公司注射用青霉素钠 80万单位/瓶华北制药股份有限公司三、方法1.试剂的配制（1）神经元专用培养液将500ml Neurobasal®-A Medium (1×)无血清培养基和10ml B-27 Supplement(50×)混合后，加青霉素和链霉素（终浓度为100单位/ml）使其混匀，4℃储存备用。
（2）D-Hank,s缓冲液称取NaCl8.0g KCl0.4g Na2HPO4·12H2O0.09g KH2PO40.06g 葡萄糖1g,加双蒸水定容至1000ml,调PH于7.2-7.4，抽滤后4℃储存备用。
（3）0.25%胰酶称取0.25g胰酶溶于100ml D-Hank,s缓冲液中，抽滤后4℃储存备用。
各类神经元细胞的培养方法
各类神经元细胞的培养方法神经元细胞是神经系统中的主要细胞类型之一，负责传递神经信息和调控神经功能。
神经元细胞的培养是神经科学研究和临床治疗的重要工具。
通过细胞培养，可以研究神经元的发育、功能和病理机制，同时也可以应用于药物筛选、组织工程和神经修复等领域。
下面将介绍一些常用的神经元细胞培养方法。
1.原代培养2.细胞系培养细胞系是已经建立起来的可持续增殖和培养的细胞株。
细胞系培养可以使用血清或无血清培养基。
通常，将细胞系继代传代，以保持其细胞特性和增殖能力。
细胞系培养可以持续扩大细胞数量，并用于大规模试验和应用，如药物筛选和基因表达研究等。
3.单细胞培养单细胞培养是将单个神经元细胞分离和培养。
首先，通过机械或酶消化方法将神经组织分散为单细胞悬浮液。
然后，通过单细胞分选技术，将单个神经元细胞分离并分配到各个培养孔中。
最后，单个细胞通过培养基提供的营养物和因子进行生长和分化。
单细胞培养是研究神经元个体特性、细胞发育和功能的重要手段。
4.同代培养同代培养是将同一类型的神经元细胞培养在同一培养物中，以形成功能连通的细胞群。
同代培养可以通过多孔膜培养皿、微流控芯片和三维支架等技术实现。
通过细胞之间的相互作用和联结，同代培养可以模拟神经系统的复杂性和功能，用于研究神经网络特性和神经系统发育。
5.共培养共培养是将不同类型的细胞培养在同一文化器皿中，以研究细胞之间的相互作用和信号传递。
常见的共培养方法包括胶质细胞和神经元细胞的共培养，以及神经元细胞和非神经元细胞的共培养。
共培养可以提供更接近体内情况的环境，用于研究细胞间相互作用和细胞发育过程。
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神经元原代培养
一、准备
1•试剂
1）胎牛血清灭活：血清室温自然融解，摇匀。
选用与血清瓶同规格的对照瓶一个，并加入与血清等体积的水。
对照瓶内插入1〜2支温度计（保证测试温度的准确性）。
将血清瓶与对照瓶同时放入恒温水浴箱，待温度计所示温度上升至56C 时，定时30分钟。
灭活后分装，10ml/瓶, 一瓶放在培养箱做无菌实验，其余-20〜-70 °C保存。
2）D-Hank's液（g/L）: NaCI: 8, KCl: 0.4, KH2PO4: 0.06, Na2HPO42H2O: 0.06, NaHCO3： 0.35;酚红：0.02,超纯水溶解，调节PH至7.2,高压灭菌（购自南方医院临床试验中心）。
3）多聚赖氨酸：避光，用超纯水配制好后过滤,200卩或400卩l/tube分装,-20度储存。
母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml（购自Sigma,
P2636,100mg）。
配置方法：20ml超纯水溶解，分装为1ml/管。
用时加入49ml超纯水稀释为0.1mg/ml的工作液。
4）50mM谷氨酸：超纯水溶解，滤过除菌，分装50卩l/tube -20C保存。
使用时需将终浓度调整为25讪（购自Sigma, G8415, 100g，分子量：147.13）。
配制方法：电子天平称量谷氨酸 1.4713g,即0.01mol=10mmol,溶于200ml超纯水中，配制为50mM的谷氨酸母液。
例：500ml 的Neurobasal Medium 中加入Glutamate 母液（50mM）250 卩，此时终浓度约为25^M O
5）胰蛋白酶:0.25% （购自Hyclone, SH30042.01, 100ml）。
6）阿糖胞苷（AraC）母液：10mM,（阿糖胞苷，1：1000稀释用）（购自Sigma, C1768, 100mg，分子量：243.22）;配制方法：100mg/243.22~0.41mM，加入41ml超纯水溶解，配制成10mM的AraC母液。
AraC工作液：10^M（半量换液，终浓度5^M）;
7) DNAse I ()(购自ROCHE,, 100mg, 1mg=2000U,用dH2O 配成10mg/ml 母液，过滤分装100卩l/tube每次使用50-100 pl)
Q\拉餐甘
8 ）培养基
FBS
DMEM/F12 ：购自Hyclone，SH30023.01B，500ml
双抗：购自GIBCO ，，100ml
Neurobasal Medium-A:购自GIBCO,（新生鼠）或（孕鼠），500ml
B27:购自GIBCO, 17504-044, 10ml
Glutamax-100X:购自GIBCO, 3505061, 100ml
①分离培养基: 10%FBS+DMEM/F12+ 双抗
②培养用Start Medium: Neurobasal Medium-A 500ml+B27 10ml+Glutamax-100X 5ml+ Glutamate 25
③换液用Culture Medium: Neurobasal Medium-A 500ml+B27 10ml+Glutamax 100X 5ml
2. 耗材
1）EMS盖玻片：膜片钳和激光共聚焦检测试验时才需要使用。
2）各型枪头：10 d、100 pl、1000 pl、5ml
3）细胞培养皿:
4）细胞培养瓶:
5）离心管:
二、步骤
1. 手术器械消毒:直头眼科剪、直头、弯头显微镊各1 把为一套器械,准备两套并分别置于50ml 烧瓶中, 70%酒精浸泡30min。
2. 动物：出生24小时内的SD大鼠（下称乳鼠）约10只；
3. 海马组织分离:
①培养皿2个，分别加入冰冻D-Hank'液约5ml，至于冰盘上；
②取乳鼠, 用左手拇指和食指固定乳鼠头部, 酒精棉球皮肤消毒3遍,直头眼科剪酒精灯火焰消毒后（下同）剪开皮肤,换第二把直头眼科剪剪开颅骨,弯头显微镊向两侧牵拉开颅骨暴露乳鼠大脑, 换第二把弯头显微镊由颅底部分离乳鼠大脑，然后置入冰冻的D-Hank'液中。
③用直头显微镊固定乳鼠大脑, 将两大脑半球分离后, 用弯头显微镊分离脑干后, 以直头显微镊固定并敞开皮质, 最后用弯头显微镊由海马游离端仔细分离海马组织,并剔除血管及脑膜。
④将分离好的海马组织至于加有冰冻D-Ha nk' s液的青霉素瓶中，用直头眼科剪
剪碎组织至约1mm3的小块，加入约5倍组织体积的0.25%胰蛋白酶37C消化
10min，加入分离培养基终止消化。
⑤机械吹打分散细胞，40叩筛网过滤，制成单细胞悬液，1000rpm室温离心6min, 弃去上清液，加Starting medium，尖嘴吸管吹打分散细胞后，制成4X105个/ml 的单细胞悬液，接种在预先包被有多聚赖氨酸（PLL）的培养板内。
⑥在通以95%空气、5%CO2 , 37C细胞培养箱中培养。
接种72h后，加入含10讪阿糖胞苷的Culture Medium作用48h，以抑制胶质细胞的过度增殖。
之后每隔两天用Culture Medium换液，每次更换的量为原体积的1/2，培养12天后对神经元进行鉴定并用于实验。
换液举例：1月1日培养神经元，于1月4日用含AraC （10^M）的Culture Medium 换液，AraC 作用48小时后（1 月6 日）用Culture Medium 换液，最后一次于 1 月9 日换液。
此为一般情况，视具体情况而定，应于换液前在显微镜下观察，看是否污染、胶质细胞多少、神经元状态，胶质细胞较多时可延长AraC 作用时间，污染和神经元状态不好应丢弃，若需延长培养时间可以加换一次液体。