细胞培养的超净台操作
细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。
细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
细胞培养的实验步骤
细胞培养的实验步骤细胞培养的实验步骤如下：1、细胞复苏：细胞培养条件2、复苏流程：（1）确认水浴锅的水清洁可用，方可提前打开37度预热。
（2）确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置，并做好复苏登记。
（3）提前做好复苏准备，预热培养基。
（4）悬浮和贴壁细胞复苏参数：（5）将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解，1.8ml时间大概1分30秒，1ml大概1min左右，需计时，其间不要老是拿起来观察，需要快速复溶，避免细胞受到损伤。
（6）贴壁细胞需离心，1000rpm，5min。
悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中（7）贴壁细胞离心后去除上清，用预热的培养基重悬细胞后加入T25方瓶，蕞后放入培养箱中培养。
（8）取小样计数观察，细胞活力在70%以上算正常。
低于70%活力可能细胞状态不太好，需要培养和恢复。
3、细胞传代培养1．悬浮细胞传代流程：（1）先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台。
（2）打开摇瓶瓶盖，用200ul移液器取100~200ul细胞放入1.5mlEP管中，瓶盖过火，拧紧，将培养瓶放回摇床。
（3）将200ul细胞混匀，取10ul细胞加入10ul台盼蓝，显微镜下计数。
根据细胞数决定下游实验。
（4）细胞需计数两次求平均值。
（5）悬浮细胞生长参数（6）根据不同细胞的生长曲线在合适的时间和密度给细胞接种传代。
以sf9细胞为例：细胞接种密度0.4x10^6个/ml,24h密度1x10^6个/ml,48h密度2.4x10^6个/ml,72h密度6x10^6个/ml，此时需要传代细胞。
要求留样100ml0.4x10^6个/ml具体操作如下：计算：需要母细胞体积=100*0.4/6=6.6ml需要培养基体积=100-6.6=93.4ml将上面体积的细胞和培养基加入摇瓶中，放回27度培养箱培养即可2.贴壁细胞传代流程：（1）显微镜下观察细胞状态和密度，80%汇合率以上需要传代。
（2）T25方瓶中加入0.5ml~1ml0.25%胰酶溶液（需37度预热），使瓶底细胞都浸入溶液中。
细胞培养的方法与步骤
细胞培养的方法与步骤1．开紫外灯前先擦超净台，台内紫外30分钟，室内紫外10分钟。
同时将放在4℃内的培养液提前放置到室温。
（可放在抽屉中，防止紫外照射）换液2．先将培养液打开（开一层烧一层），放置在酒精灯旁。
3．将细胞从培养箱中拿出，进超净台前先要喷酒精。
4．打开培养瓶，烧瓶口，而后弯脖朝后，倒液，注意瓶口不要残留液体，若有残液要用纱布擦净。
5．倒培养液（之前要烧瓶口），注意量（5ml）不要再瓶口有残留液体是烧瓶口，否则碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。
6．倒一瓶封一瓶，迅速放平，培养瓶口拧紧后再松一下，放入培养箱中。
传代2．拿出细胞，开口，烧，倒液。
3．（5ml大枪加3ml）用PBS洗2~3遍（洗净血清，放置血清钝化胰酶）。
4．胰酶消化，37℃5分钟（时间可自控）。
消化程度是细胞不能滑落，要吹落。
500微升胰酶（4×，1%）+1.5mlPBS→工作浓度0.25%（此时要用大枪）。
5．（大枪）加入3mlDMEM完全培养液终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞（不要让吸管的嘴端接触到瓶壁）6．将混合物吸入离心管，加封口膜，离心500g 5分钟（此时洗去胰酶）在此期间PBS 洗培养瓶3遍，PBS一定要吸净，否则加入培养液后会产生沉淀（培养瓶要重复使用，至少100次）7．倒掉上清，此时动作要轻或用大枪吸，加入3mlDMEM完全培养液重悬细胞，用吸管吹掉（再洗，清除胰酶）。
8．离心完毕，加入3ml新鲜培养液，再次吹打（约50~100下，视细胞情况而定），防止起泡沫，至细胞单个，圆球状为宜。
9．在培养瓶中加入新鲜培养液4ml，将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中（量依需要而定）。
80微升，100微升都可以。
冻存8．在冻存管中加入200微升冻存液，在离心管中加入1000微升冻存液，吹打（防止起泡），移入冻存管中，此段时间不宜过久（DMSO对细胞伤害很大）。
9．封口膜封紧冻存管，可多封几层，用胶布缠紧，只缠一层就行，然后写字。
细胞培养无菌操作
细胞实验考核要点一、准备工作1、清点超净台中仪器物品（垃圾桶、饭盒中三种管、橡胶塞、蓝枪头、移液枪、电子枪、50ml离心管、镊子、剪刀、marker笔、打火机、卫生纸、6孔板、平衡50ml内含1ml离心管），合理布置台面。
2、超净台灭菌：酒精喷洒超净台面，紫外照射20min左右。
3、预热：将PBS、10%FBS、胰酶装进PE手套中，37℃预热备用。
二、实际操作1、点燃酒精灯2、从水浴锅中取出预热的三种液体，喷酒精后放入超净台，用卫生纸擦拭瓶壁酒精。
撕开三个封口膜。
瓶口在外焰烧灼烧，拧松三个瓶盖，以备用。
3、手喷酒精后，旋松并取出T25瓶。
在显微镜下观察细胞长势，若细胞密度达到了80%-90%，则可以进行传代。
注意若显微镜没有人用过，需要在载物台附近喷洒酒精后擦拭。
4、将T25拿到超净台里面。
手进入台面内需酒精喷洒消毒（后不赘述）。
打开吸泵。
5、来回灼烧吸泵铁头。
旋开T25瓶，注意灼烧瓶盖，瓶盖扣放。
铁头插上两个蓝枪头，瓶身倾斜吸去瓶中原培养基。
灼烧瓶盖和瓶口后盖盖，不要盖太紧。
6、取1ml移液枪，将T25竖起来，向未生长细胞的侧壁打入5ml PBS冲洗。
盖盖后左右上下稍移动。
将PBS吸出。
关吸泵！7、向瓶中加入500ul胰酶。
稍混合均匀。
放入培养箱中消化2min。
计时。
8、2min内需完成的操作（1）取出一个50ml离心管。
（2）烧套管：镊子在火上过一下，套管盒稍稍开一小口，用镊子取出一个套管，火上来回灼烧，然后放置在离心管架上。
（3）烧弯头吸管：从烧瓶中用镊子取出一个塞子。
弯头吸管盒稍开一小口，确定是不是塞棉花的一头。
镊子稍稍过火灼烧，开一小口，镊子夹出塞棉花一头，放下镊子，拿出吸管。
盒子放回原处。
将塞子塞入弯头吸管中。
手持塞子来回在火上灼烧，完毕后放入套管中。
9、取出培养箱中消化的细胞，显微镜及肉眼观察消化是否合适。
若在显微镜下看到细胞质壁分离呈球形，大部分细胞已经脱离瓶壁游走在视野中，肉眼观察有白色的成片细胞脱落，说明消化完成。
细胞培养超净台的使用流程
细胞培养超净台的使用流程简介细胞培养超净台是一种专门用于进行细胞培养的设备，它可以提供一个无菌环境，确保细胞培养的成功。
本文将介绍细胞培养超净台的使用流程，包括准备工作、操作步骤和注意事项等内容。
准备工作在正式使用细胞培养超净台之前，需要做一些准备工作，以确保操作的成功和安全性。
1.确保超净台的清洁：使用前，需要先对超净台进行清洁，包括台面、操作面板、门把手等部分。
使用一种有效的清洁剂，确保彻底清洁。
2.检查工作区的设备和物品：检查超净台内的仪器设备和所需物品是否完整，如培养皿、管道、培养液等。
确保所有设备和物品的质量和数量符合实验需要。
3.穿戴合适的实验服和防护用品：进行细胞培养实验时，需要穿戴实验服、手套、面罩等防护用品。
检查这些防护用品是否齐全，并确保它们平整干净。
操作步骤完成准备工作后，可以开始按照以下步骤正确操作细胞培养超净台。
1.打开细胞培养超净台的电源开关，待设备启动完毕后，确认台面无菌。
2.消毒操作区域：在操作区域进行消毒处理是保证实验无菌的重要一步。
使用经过验证的消毒剂，将操作区域进行彻底消毒。
3.开启超净台内部紫外线灯：超净台内部通常配有紫外线灯。
启动紫外线灯进行灭菌，时间通常为15-30分钟，具体时间根据实验需要进行调整。
4.确保洗手消毒：在进行任何实验操作之前，必须先进行洗手消毒。
使用洗手液彻底清洁双手，然后使用酒精进行彻底消毒。
5.将所需的仪器和物品摆放到操作区域：将培养皿、离心管、试管等所需仪器和物品摆放到超净台的操作区域，以便于进行操作。
6.样品处理、细胞培养：根据实验要求，进行样品处理和细胞培养的操作。
在操作过程中，确保操作区域的无菌状态，避免污染。
7.实验结束后清洁超净台：实验结束后，清洁超净台是保证下次实验成功的必要步骤。
彻底清洁台面，消毒操作区域，并关闭超净台的电源开关。
注意事项在使用细胞培养超净台时，需要注意以下事项，以确保操作的准确性和实验结果的有效性。
超净工作台的正确使用方法
超净工作台的使用方法：1、接通电源2、提前20分钟开风机。
3、提前30分钟开台内紫外灯杀菌。
注意事项：1、新安装的或长期未使用的超净工作台使用前：须对净化工作台及周围环境用超净真空吸尘器或无纤维的工具进行清洁；2、工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流正常流动，不受干扰。
3、禁止在工作台面上记录，工作时应须尽量避免作明显扰乱气流的动作无菌操作注意事项体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。
即便使用设备完善的实验室。
若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。
因而．为在一切操作中为最大可能的保证无菌．每一项工作都必须做到有条不紊和完全靠。
【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。
有关数据的计算要事先做好。
根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。
这可以避免开始实验后．囚物品不全往返拿取而增加污染机会。
【操作野消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)．紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。
然后紫外线淌毒30min。
在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置．否则会遮挡射线降低消毒效果。
—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。
【洗手和着装】原则上和外科手术相同。
平时仅做观察不做培养操作时，可穿装细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。
在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。
如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。
进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。
【火焰消毒】在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。
细胞培养实验报告
细胞培养实验报告细胞培养实验报告细胞培养主要包括细胞复苏、细胞传代和细胞冻存三个过程。
一、实验仪器及用品（一）超净台：1.枪头：10 mL、5 mL、1 mL、200 μL、10 μL；2.移液枪：同上，及相应的支架；3.离心管：50 mL、15 mL、1.5 mL，及相应支架与盛皿；4.记号笔；5.PBS缓冲液；6.酒精棉；7.废液杯×2：一个装枪头，一个装废液；8.封口膜；9.排枪卡槽；（二）细胞间：1.离心机：中型、小型；2.培养瓶：透气的用于培养，密封的用于运输，培养皿；3.灭菌离心管、枪头、冻存管等备用；4.毛巾、手套、口罩、酒精喷壶、灭菌超纯水、除菌滤膜；5.100 μL排枪；6.血球计数板、载玻片；7.水浴锅；（三）冰箱：1.双抗、环丙沙星；2.4℃：DMEM、1640、PBS、已配培养基；3.-20℃：MTT、MTS、DMSO、血清、胰酶；（四）缓冲间：罐、液氮罐；1.CO2（五）换衣间1. 实验服、拖鞋、手套、口罩、酒精喷壶；二、实验前准备（一）实验前将需要带入的物品洗净、高温灭菌、喷酒精，放入传送窗，将传送窗与细胞间紫外开启杀菌半小时；（二）半小时后关闭紫外，开启风阀与空调，散去臭氧，双手用洗手液洗净擦干后进入换衣间，换上隔离服（若不使用超净台，换实验服即可），戴上口罩、手套喷酒精，进入缓冲间风浴1-3 min；（三）进入细胞间，冰箱中取出所需溶液（胰酶、培养基等）置于超净台中，开启超净台紫外，关闭传送窗紫外，将物品取出后喷酒精后放于应处位置；注：若是冬天，溶液应在37℃水浴后再使用，所有物品放入超净台前均需再喷酒精，特别是盖口处。
三、细胞培养（一）细胞复苏1. 培养基配制：倒出50 mL培养基，加入50 mL血清，5 mL双抗（浓度10-50 μg/mL环丙沙星可作用一周抑制支原体生长），分装3天够用的培养基即可，所有都用封口膜封住；2. 冻存液配制：1 mL DMSO、2 mL血清、7 mL培养液混合；3.37℃温育DMEM培养液（含双抗和血清）。
细胞培养操作步骤
细胞培养操作步骤培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml冻存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。
依次比例酌量配置。
超净工作台常规配置移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精……实验前准备：所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。
首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37℃的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37℃水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。
若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。
这一过程可在超净工作台外操作。
实验步骤一、原代细胞的培养1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
2.将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。
特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。
3.取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。
4.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。
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弃物应丢弃在超净台内的处理容器中。
示范操作
操作时意事项
• 避免胳膊在前开口处快速移动和频繁进出。 • 双手离开超净台再进入时，需再次用消毒剂擦拭消毒。 • 尽量避免污染的物品进入洁净区。 • 在生物安全柜内进行操作时，不能进行文字工作。 • 尽量减少操作者身后的人员活动 • 由于超净工作台对操作者和环境无保护作用，要特别做好个人和环境的保护，
• 等待至少3分钟，以除去空气中的污染源。
洁净区 半污染区 污染区
超净台操作规范
2、操作规范
• 先将穿上的手套用消毒剂擦拭消毒。双臂垂直缓慢进入 前面的开口，在超净台中等待大约1分钟，让里面的空 气“扫过”手和双臂的表面后，才可以开始对物品进行 处理。
• 所有操作应在离前窗10cm以外的工作区进行。
如穿戴帽子、眼镜、口罩、工作服等，并保持室内通风。 • 如果超净工作台长期没有维护，操作时可关闭排风机，以减少空气过滤器漏
出的污染源。
超净台操作规范
3、实验后的处理
• 将超净台继续运行至少3分钟，以完成“净化”过程。
• 将超净台物品移出前，应使用有效的消毒剂擦拭。
• 实验结束后，对超净台的内壁和台面用消毒剂进行擦拭。
超净工作台操作常见问题
操作本身造成的污染
危险操 作
操作太靠近门口
Thank you for listening！
知识回顾 Knowledge Review
祝您成功！
• 5分钟后，关闭前窗、照明灯、风机，打开紫外灯照射 30分钟。
超净台操作后的消毒
超净台的定期保养
• 用湿布擦拭内壁和工作台面 • 每年按需要更换紫外灯和日光灯 • 每年至少认证一次
——《医学实验室—安全要求》 —— YY0569-2005 生物安全柜 ——《实验室生物安全手册》（第三 版，2004）
细胞培养的超净台操作
超净台操作规范
1、实验准备
• 先用湿布清洁超净台内外表面，除去可能影响杀菌效果 的灰尘和污垢。开启紫外灯照射30分钟
• 关紫外灯，打开超净台的日光灯和风机，用消毒剂对超 净台的内表面进行消毒擦拭
• 将实验中要用的物品先用消毒剂擦拭，然后放在台面相 应位置上：洁净区、半污染区、污染区