禾谷镰刀菌拮抗菌筛选探究方案
拮抗尖孢镰刀菌的芽孢细菌的筛选
单 菌 落 转 接 至 ＮＡ 培 养 基 斜 面 上 ，３ ７ ℃恒 温 培 养 ２ ４ｈ ，４℃冰 箱保 存备 用 。
镰 刀 茵有 显 著拮 抗 作 用 的 菌株 ６株 ，其 中 ｚ Ｈ一１ ５
菌株 拮抗 作 用 最显 著 ，为 尖孢镰 刀 茵 ；拮 抗 ；芽孢 细茵 ；筛选
由尖 孢镰 刀菌 （ Ｆ ｕ ｓ ａ ￣＇ ｕ ｍｏ ｘ ｙ ｓ ｐｏ ｍｍ） 侵染 引起 的 植 物枯 萎 病 是 一种 世 界 性 的土 传 真 菌病 害 【 】 。病 菌 从 根 部 为 害 植 物 ， 引起 维 管 束 病 害 ，造 成 植 株 枯 死 ，在植 株 的全 生育 期均 可 发生 ，对 生产 造 成 了具 大 的损 失［ ２ － ３ ］ 。 国 内外 已报 道 的被 严重 为 害 的作 物 有 棉 花 、甘 蔗 、香蕉 、番 茄 、黄 瓜 、 哈 密瓜 、西 瓜 、 大豆 、豇 豆 等［ ４ － ５ ］ 。 目前 防治枯 萎病 的主要 方法 是 培 育抗 病 品种 、使 用化 学药 剂 和利 用农 业措 施等 ，但 由于枯萎 病 属于 土传 病 害 ，这些 措施 在 防治 中往往 效 果都不 太 理想 ， 因此 ，尖孢 镰 刀菌 的生 物 防治越 来越 引起 人们 的关 注旧 。 芽孢杆 菌（ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓｓ ｐ ｐ ． 是 一 类 好 氧 或 兼 性 厌 氧 、产 芽孢 的革 兰 氏阳性 菌 ，对 人畜 无毒 无害 ，不 污染 环境 ，能产 生 多种抗 菌 素和 酶 ，具有 广谱 抗菌 活性 和极 强 的抗逆 能 力 ，不仅 可 以在 土壤 、植 物根 际 体表等 外 界环 境 中广泛 存在 ，同时 还是 植物 体 内 常 见 的 内生 细 菌【 ７ 】 。芽 孢 杆菌 最 突 出 的特 征 是 生长 快 、营养 简单 ，能产 生耐 热 、抗逆 的芽孢 ，这 有利 于 生 防菌 剂 的 生产 、剂 型加 工及 在环 境 中的 存 活 、 定 殖 与 繁 殖 ，而 且批 量 生产 工 艺 简 单 ，成 本 也 较 低 ，施用 方便 。 田间应用研 究 己经 证 实芽孢 杆 菌 生 防菌 剂在 稳定 性 、与 化学 农药 相容 性和 在 不 同植物
百合抗镰刀菌资源鉴定及抗病相关基因筛选_马璐琳
园艺学报 2012，39（6）：1141–1150 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@ 百合抗镰刀菌资源鉴定及抗病相关基因筛选马璐琳1,*，张艺萍1,*，丁鲲2，吴丽芳1，王祥宁1，崔光芬1，贾文杰1，段青1，王继华1,**（1云南省农业科学院花卉研究所，云南省花卉育种重点实验室，昆明 650205；2云南省农村科技服务中心，昆明650021）摘 要：对20个百合种质资源的组培苗进行尖孢镰刀菌百合专化型（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）室内接种鉴定；以筛选出有较好抗性的大花卷丹（Lilium leichtlinii var. maximowivzii Baker）为材料，以镰刀菌诱导12和24 h的作为处理组，无菌水处理作为对照组，采用SMART技术构建了百合经镰刀菌诱导后的抑制差减正、反向两个SSH文库。
在正向文库中选择了4个抗病相关的ESTs，用半定量RT-PCR分析这些ESTs的表达情况。
经接种鉴定，20个百合种质资源中，对百合镰刀菌表现高抗的有3个，中抗9个，感病8个；SSH文库ESTs片段大小为200 ~ 2 000 bp。
依据斑点杂交结果，从正向SSH文库中挑取50个单克隆进行测序和比对分析，得到6种共10条抗病相关EST。
通过半定量RT-PCR对其中的4条抗病相关ESTs：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，S/TPK）、谷胱甘肽S–转移酶（glutathione S-transferase，GST）、过氧化物酶（peroxidase，POD）和亲环素（cyclophilin，CYP）的表达情况进行了分析，证明它们在一定程度上都受百合镰刀菌诱导而表现上调表达，推测其可能参与了百合对镰刀菌枯萎病的抗病过程。
层出镰孢拮抗菌的分离筛选及发酵条件优化
层出镰孢拮抗菌的分离筛选及发酵条件优化层出镰孢引起的玉米鞘腐病是我国近年来玉米生产中普遍发生的一种新病害,不仅影响玉米产量,病菌产生的伏马毒素还直接威胁人畜的健康。
基于目前尚未有效防治该病的措施,本文从生态学的观点出发,从玉米田的土壤中分离筛选拮抗微生物来探讨该病的防治方法,经筛选共得到7株对层出镰孢具有拮抗作用的细菌菌株,主要结果如下:1.从玉米田土壤中分离筛选到的7株拮抗菌株YM-6、YM-7、YM-8、YM-10、YM-13、YM-14和YM-15,经形态学、生理生化特征、16S r DNA 序列分析,鉴定YM-6和YM-7菌株为莫哈韦芽孢杆菌(Bacillus mojavensis),YM-8、YM-10和YM-13为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens),YM-14为枯草芽孢杆菌(B.subtilis),YM-15为特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis),即均为芽孢杆菌。
2.为了验证生产中拮抗菌对玉米鞘腐病和穗腐病的防治效果,本研究人工接种病原菌和拮抗菌,在玉米乳熟期调查病害发生程度,并测产。
结果表明,不同生防菌剂对鞘腐病和穗腐病均有一定的防治效果,且可在一定程度上挽回病害损失,其中以菌株YM-8和YM-15组合为最好,田间防效达到84.21%。
3.选择拮抗效果较好的两株菌株YM-8和YM-15进行发酵条件优化,YM-8的最佳发酵条件为:蔗糖3.0%、胰蛋白胨3.0%、KH2PO4 0.01%、Ca Cl2 0.01%、培养基初始p H为9.0、装液量30 m L/250 m L、接种量2%,37℃、120 rpm摇床振荡培养。
YM-15的最佳发酵条件为:乳糖1.0%、酵母粉1.0%、Mg SO4 0.005%、培养基初始p H为7.0、装液量50 m L/250 m L、接种量2%、37℃、180 rpm摇床振荡培养。
经发酵条件优化后,两种菌株抗菌活性分别比优化前提高了81.17%和122.65%。
防治水稻恶苗病拮抗细菌的筛选、鉴定和评价
防治水稻恶苗病拮抗细菌的筛选、鉴定和评价作者：李风顺乔俊卿张荣胜刘邮洲刘永锋来源：《江苏农业学报》2022年第04期摘要：本研究從植物根际土壤中分离获得菌落形态各异的细菌分离株432株，以引起水稻恶苗病的藤仓镰刀菌菌群为指示菌，通过孢子萌发和平板对峙试验筛选获得对孢子和菌丝都具有显著抑制作用的细菌6株。
生防相关特征分析结果显示，菌株LSRS26、JTGSL12和JTGSM1对水稻恶苗病病菌的抑菌效果、生物膜形成能力、群集游动能力和产抑菌物质方面的作用较为优秀。
分子鉴定结果表明，菌株LSRS26、JTRSM1、JTGSL12和AHGHL2是Bacillus amyloliquefaciens（解淀粉芽孢杆菌），菌株JTGSM22和JTLM2是Paenibacillus jamilae（杰米拉类芽孢杆菌）。
水稻促生试验结果显示，当浸种菌液浓度（OD600）=0.1时，菌株LSRS26和JTRSM1对水稻出芽具有促进作用;当浸种菌液浓度（OD600）=0.1时，菌株JTGSL12对水稻植株鲜质量和株高的促进效果最为显著。
盆栽防效试验结果显示，当浸种菌液浓度（OD600）=1.0时，3株芽孢杆菌对水稻恶苗病都表现出不同程度的防治作用，防效为58.00%～72.00%，其中JTGSL12的防效最高，为71.62%。
本研究通过筛选获得3株优秀的生防菌，为防治水稻恶苗病的生物农药种子处理剂的创制积累了菌株资源。
关键词：水稻恶苗病;拮抗细菌;促生作用;生防效果中图分类号：S476文献标识码：A文章编号：1000-4440（2022）04-0907-08Screening， identification and evaluation of antagonistic bacteria for the control of Rice Bakanae DiseaseLI Feng-shun QIAO Jun-qing ZHANG Rong-sheng LIU You-zhou LIU Yong-feng（1.College of Plant Protection， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095，China;2.Institute of Plant Protection， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）Abstract：In this study， 432 bacterial strains with different colony morphologies were isolated from rhizosphere soil， and six isolates with significant inhibition activity on both spores and mycelium were screened and obtained by spore germination and dural culture method using Fusarium fujikuroi strain complex group which could cause bakanae of rice as the indicator fungus. Analysis study of the biocontrol characteristics showed that strain LSRS26， JTGSL12 and JTGSM1 performed well in inhibition activity， biofilm formation， swarming ability and producing antagonistic substances against Fusarium. Results of molecular identification indicated that strains LSRS26， JTRSM1， JTGSL12 and AHGHL2 belonged to Bacillus amyloliquefaciens， strains JTGSM22 and JTLM2 belonged to Paenibacillus jamilae. The results of seed germination experiment showed that strains LSRS26 and JTRSM1 had a promotion effect on rice germination when the seed soaking concentration （OD600） was 0.1. When the seed soaking concentration （OD600） was0.1， strain JTGSL12 showed the most significant effect on the fresh weight and height of rice plants. Pot experiment showed that strains LSRS26， JTGSL12 and JTGSM1 exhibited different degrees of control effect against rice bakanae disease when the seed soaking concentration （OD600） was 1.0，the biocontrol efficiency ranged from 58.00% to 72.00%. Strain JTGSL12 got the highest control efficiency at 71.62%. Three excellent Bacillus strains were screened and obtained， which provided strain resources for the creation of biopesticide seed treatment agent for the control of rice bakanae disease.Key words：rice bakanae disease;antagonistic bacteria;growth-promoting effect;biocontrol efficiency水稻恶苗病是常见种传病害，自1828年日本首次报道后，几乎在世界各水稻种植区均有发生，在中国稻区分布广泛，造成不同程度的危害，一般减产10%～20%，严重时达50%[1-2]。
一株禾谷镰刀菌拮抗菌株的筛选及鉴定
ａ ｎ ｔ ａ ｇ ｏ ｎ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｔ ｏ ｗａ ｒ ｄ ｓ Ｆ ｇ ｒ ａ ｍｉ ｎ ｅ ａ ｍｍ．Ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ８ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｓ ．ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ Ｊ ｃ 一 ０ ７ ｓ ｈ ｏ ｗ ｅ （ １ ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ｒ ｏ ｎ ｇ ｅ ｓ ｔ ｉ ｎ ｈ ｉ ｂ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｅ ［ ＇ ｌ ｅ ｃ ｔ ．Ｂ ａ ｓ ｅ ｄ ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ，ｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ａ ｎ ｄ ｂ ｉ ｏ ｃ ｈ ｅ ｍｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ａ ｓ ｗｅ ｌ ｌ ａ ｓ ｔ ｈ ｅ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｇ ｏ ｆ １ ６ Ｓ ｒ ＤＮ Ａ，ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ Ｊ Ｃ 一 ０ ７ ｗａ ｓ
有拈抗作用 ， 其 中， 菌株Ｊ ｃ 一 ０ ７ 的拮抗效果最佳。根据形态特征 、 生理生化特性和 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ 序列分析 ， 将菌侏Ｊ ｃ 一 ０ ７ 初 步
鉴定 为 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 （ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ａ ｍｙ ｌ ｏ ｌ ｉ ｑ ｕ ｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ ） 。抑 菌 实 验 表 明 ， 菌株 Ｊ ｃ 一 ０ ７ 发 酵 滤 液 明 显 抑 制 禾谷 镰 刀菌 的菌 丝
禾谷镰刀菌拮抗菌筛选探究方案
由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病是小麦重要病害之一，也是影响中国小麦生产的重要病害[2]。
小麦赤霉病别名红麦头、烂麦头、麦穗枯。
在全世界普遍发生，气候湿润多雨的温带地区受害比较严重，在潮湿和半潮湿区域发生率较高。
从幼苗到抽穗都可受害，主要引起苗枯、茎基腐、秆腐和穗腐，其中穗腐的危害最为严重。
小麦赤霉病的表现小麦赤霉病主要引起穗腐、苗腐和杆腐等症状。
最常见的是穗腐。
初期在颖片和小穗上会出现浅褐色斑，小穗也会慢慢感染，接着蔓延到邻近小穗，导致小穗枯黄。
湿度大时，会产生红色霉层；湿度小时，病小穗枯白，没有霉层产生[3]。
种子带菌或土壤中病残体侵染小麦会产生苗腐，刚感染小麦会变得瘦小，时间长了可能会病死。
穗下第一、二节则容易发生杆腐，叶鞘上会先出现淡褐色斑点，再向节部内部蔓延，严重时不能抽穗。
小麦赤霉病的发病条件在充足的湿度和空气条件下，赤霉病会形成子囊壳和子囊孢子，最适和的生长温度为24～25℃，最低9～10℃，最高32℃。
在适宜的条件下2～3d 即可产生子囊壳，5～10d 形成子囊孢子。
在小麦抽穗前后，子囊孢子会随风飘散，飘落在麦穗上，子囊孢子会在颖内花药上腐生，接着整个花器及小穗都会被感染。
还会产生分生孢子群，分生孢子会接着随风飘散，接着侵染其它小麦，使病害扩展蔓延[4]。
气象条件对小麦赤霉病的影响较大。
当平均气温为9℃以上，3～5d 的雨天时，便形成了子囊孢子。
这会十分有利于子囊孢子的释放和侵染，小麦赤霉病很有可能大流行。
小麦赤霉病的危害小麦赤霉病是造成农业损失的主要原因之一[5]，联合国粮农组织（FAO）统计，每年由植物病害引起的减产平均损失为总产量的10%～15%，而其中的80%的损失是由真菌引起的[6]。
小麦赤霉病会严重影响小麦的产量，同时还会降低小麦的品质。
该还能产生以脱氧雪腐镰刀菌烯醇为主的真菌毒素，能较大的危害人、畜。
当有4%的病麦时就不能使用了，这时小麦已经失去了利用价值。
1950年以来全国赤霉病大流行12年，中度流行17年，流行的频率为46.8%。
禾谷丝核菌拮抗真菌的鉴定及抗菌活性研究
２ １ 年 第 ８期 ００
禾谷丝核菌拮 抗真菌 的鉴定及 抗菌活性研 究
伊 艳 杰 ，时 玉 ， 兴 泉 ， 慧 茹 吴 张
（ 南 工业 大 学 生物 工 程学 院 ， 南 郑 州 ４ ０ ０ ） ｆ ｇ 河 ５ ０ １
摘要 ： 用从 小麦 茎叶组织 中分 离的 内生真菌 ， 利 进行 平板对 峙试验 ， 中筛选 出 ２株对 禾谷丝核 茵有 从 明显抑制 效果的菌株 （ Ｆ Ｒ ５和 Ｒ ６ 。采 用改 良的 真茵基 因组 Ｄ Ｆ） ＮＡ提 取 方法 ， 取 内生真 菌 Ｒ ５和 提 Ｆ Ｒ ６的基 因组 Ｄ Ａ， 用 Ｉ Ｓ序列通用 引物（Ｔ ４Ｉ Ｓ ） Ｆ Ｎ 运 Ｔ Ｉ Ｓ 、Ｔ ５ 进行 扩增 ， 别得到 约 ６ ０ｂ 分 ０ ｐ的特 异条 带。
Байду номын сангаас
ｅ ｄ ｐ ｙ ｉ ｆ ｎ ｉ ｔａｎ ｒ ｏ ａｅ ｒ ｍ Ｄ ｍｅ ｉｍ ｉ ｃｕ ｅ ｔａｎ ＲＦ ｎ ６ ｎ ａ — ｎ ｏ ｈ ｔ ｕ ｇ ｒ ｉ ｓ ｃ ｓ ｗｅ ｅｉ ｌｔ ｄｆｏ Ｐ Ａ ｄｕ ｗｈ ｃ ｉ ｌ ｄ ｄ ２ ｓｒ ｉ ｓ（ ５ａ ｄ ＲＦ ）ａ ｔｇ ｓ ｈ ｎ
关 键 词 ：禾谷 丝核 茵 ；内生 真 菌 ； Ｔ Ｉ Ｓ鉴 定 ；抑 茵 活 性 中 图 分 类 号 ： ４２ ２ １ ｓ ８． ９ 文献标识 码 ： Ａ 文章 编 号 ： ０ ４ ２ ８ ２ １ ）８— ０ ６ ４ １ ０ —３６ （０ ００ ０ ８ —０
不同谷子品种对禾谷镰孢菌的抗性鉴定及防治药剂筛选
不同谷子品种对禾谷镰孢菌的抗性鉴定及防治药剂筛选赵颖;郭栋;高青云;杜静凯;王建桥;赵治海;刘颖慧;瓮巧云【摘要】为生产上谷子赤霉病防治提供依据,利用组织分离法分离获得谷子禾谷镰孢菌菌株,采用胚根抑制法研究不同谷子品种对禾谷镰孢菌的抗性,并对其防治药剂进行筛选.结果表明:在8个谷子品种中,张杂谷10号对谷子禾谷镰孢菌抗性最强,与其余谷子品种抗性程度差异明显;苯甲·嘧菌酯在浓度为325 μg/mL时对该菌抑菌活性最高,为74％.黄柏提取物在30 mg/mL时的抑菌活性最高,为73.1％.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2018(046)007【总页数】3页(P59-61)【关键词】谷子;禾谷镰孢菌;抗性鉴定;药剂筛选【作者】赵颖;郭栋;高青云;杜静凯;王建桥;赵治海;刘颖慧;瓮巧云【作者单位】河北北方学院农林科技学院,河北张家口075000;河北北方学院农林科技学院,河北张家口075000;河北北方学院农林科技学院,河北张家口075000;河北北方学院农林科技学院,河北张家口075000;河北北方学院农林科技学院,河北张家口075000;张家口市农业科学院河北张家口075000;河北北方学院农林科技学院,河北张家口075000;河北北方学院农林科技学院,河北张家口075000【正文语种】中文【中图分类】S515禾谷镰孢菌属于半知菌类镰刀属真菌，主要侵染禾谷类作物，病害名称为赤霉病。
该病菌在寄主苗期至成株期均可危害作物，引起种腐、苗腐、茎腐和穗腐，其中以穗腐危害最重。
据报道，麦类赤霉病是世界性病害，在中国、美国和加拿大等国家均有发生及流行，引起麦类产量的重大损失[1-6]。
我国麦类赤霉病已上升成为影响小麦产量及品质的首要病害，一般流行年份引起产量损失达10%～30%，大流行年份可导致田块颗粒无收[7-8]。
玉米穗腐病主要在我国黄淮海地区发生普遍，发病率为5%～10%[9]，其病原也是镰孢菌。
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由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病是小麦重要病害之一，也是影响中国小麦生产的重要病害[2]。
小麦赤霉病别名红麦头、烂麦头、麦穗枯。
在全世界普遍发生，气候湿润多雨的温带地区受害比较严重，在潮湿和半潮湿区域发生率较高。
从幼苗到抽穗都可受害，主要引起苗枯、茎基腐、秆腐和穗腐，其中穗腐的危害最为严重。
小麦赤霉病的表现小麦赤霉病主要引起穗腐、苗腐和杆腐等症状。
最常见的是穗腐。
初期在颖片和小穗上会出现浅褐色斑，小穗也会慢慢感染，接着蔓延到邻近小穗，导致小穗枯黄。
湿度大时，会产生红色霉层；湿度小时，病小穗枯白，没有霉层产生[3]。
种子带菌或土壤中病残体侵染小麦会产生苗腐，刚感染小麦会变得瘦小，时间长了可能会病死。
穗下第一、二节则容易发生杆腐，叶鞘上会先出现淡褐色斑点，再向节部内部蔓延，严重时不能抽穗。
小麦赤霉病的发病条件在充足的湿度和空气条件下，赤霉病会形成子囊壳和子囊孢子，最适和的生长温度为24～25℃，最低9～10℃，最高32℃。
在适宜的条件下2～3d 即可产生子囊壳，5～10d 形成子囊孢子。
在小麦抽穗前后，子囊孢子会随风飘散，飘落在麦穗上，子囊孢子会在颖内花药上腐生，接着整个花器及小穗都会被感染。
还会产生分生孢子群，分生孢子会接着随风飘散，接着侵染其它小麦，使病害扩展蔓延[4]。
气象条件对小麦赤霉病的影响较大。
当平均气温为9℃以上，3～5d 的雨天时，便形成了子囊孢子。
这会十分有利于子囊孢子的释放和侵染，小麦赤霉病很有可能大流行。
小麦赤霉病的危害小麦赤霉病是造成农业损失的主要原因之一[5]，联合国粮农组织（FAO）统计，每年由植物病害引起的减产平均损失为总产量的10%～15%，而其中的80%的损失是由真菌引起的[6]。
小麦赤霉病会严重影响小麦的产量，同时还会降低小麦的品质。
该还能产生以脱氧雪腐镰刀菌烯醇为主的真菌毒素，能较大的危害人、畜。
当有4%的病麦时就不能使用了，这时小麦已经失去了利用价值。
1950年以来全国赤霉病大流行12年，中度流行17年，流行的频率为46.8%。
1985年全国赤霉病又大流行，仅河南省发病面积就达3.0×106 hm2。
2000以来赤霉病在中国大流行频率不断增加，发病面积呈明显扩大趋势，有9个年份赤霉病的发生面积就超过了3.3×106 hm2。
其中仅河南省就有7年的发病面积超过6.7×105 hm2。
在2012年的赤霉病大流行中，山东省南部和西南部较重，河南省整体偏重，豫南更重，安徽和江苏普遍严重[7]。
1赤霉病严重威胁小麦的安全生产，一般的流行年份可引起5%～10%的产量损失，大的流行年份可导致相当多的田块绝收。
根据调查2008～2009年度全国11 个省的1018个饲料样品的毒素污染情况发现，DON毒素的检出率达95.8%，超标率达17.7%，其中西北地区的超标率高达38.1%，华北和华中地区的超标率则分别为21.0%和20.1%[8]。
本课题便是用牛肉膏蛋白胨培养基涂布平板法从小麦根际土壤中分离出细菌，纯化后用平板对峙法进行初筛和复筛。
通过形态学方法、生理生化分析进行初步鉴定，研究其抗菌活性，为寻找有效抵御小麦赤霉病的方法奠定基础。
2 材料与方法2.1 供试病原菌和小麦根际土样供试植物病原真菌：禾谷镰刀菌（9435实验室保存）。
小麦根际土样：河南工业大学西门大谢村麦田。
2.2 试剂及仪器2.2.1 试剂名称及生产厂家试剂名称规格生产厂家蛋白胨蔗糖牛肉浸膏BRARBR北京双旋微生物培养基制品厂天津市瑞金化学品有限公司北京双旋微生物培养基制品厂可溶性淀粉BR 天津市瑞金特化学品有限公司对二甲基氨基苯甲醛AR 上海试剂三厂氯化钠AR 天津市德恩化学试剂有限公司酵母膏AR 北京奥博星生物技术有限责任公司琼脂粉BR 上海化学试剂厂有限公司溴百里香酚兰AR 上海三爱思试剂有限公司葡萄糖AR 天津市科密欧化学试剂有限公司氢氧化钠AR 天津市科密欧化学试剂有限公司磷酸氢二钾AR 天津市化学试剂三厂柠檬酸钠AR 湖南省医药公司化玻站硫酸镁AR 天津市永远化学试剂开发中心乳糖无水乙醇ARAR天津市科密欧化学试剂有限公司天津市永大化学试剂开发中心磷酸二氢铵AR 天津化学试剂三厂二甲苯AR 洛阳昊华化学试剂有限公司硝酸钾AR 天津市瑞金化学品有限公司乙酸（冰醋酸）AR 开封市芳晶化学试剂有限公司浓盐酸AR 洛阳昊华化学试剂有限公司三氯化铁AR 天津市化学试剂工厂碘AR 天津市科密欧化学试剂有限公司甲基红AR 天津市科密欧化学试剂有限公司结晶紫AR 天津市化学试剂三厂次氯酸钠AR 天津市光复精细化工研究所番红花红T AR 天津市科密欧化学试剂研究所2.2.2 实验仪器仪器名称仪器型号生产公司电热恒温鼓风干燥箱XMTD-8222 上海精宏试验设备公司高压蒸汽灭菌锅SX-700 日本TOMY震荡培养箱HZQ-X100 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司电热恒温培养箱DHP-9052 上海浦东荣本科学仪器有限公司台式离心机TDL-5A 上海菲恰尔分析仪器有限公司漩涡混合器HQ-60-Ⅱ北京北方同正生物技术发展有限公司无菌操作台SW-CJ-2F 苏州净化设备有限公司移液枪KHB 上海科华实验系统有限公司电子天平JJ200 常熟市双杰测试仪器厂冰箱BCD-155TDGA 青岛海尔股份有限公司BCD-232MA/X1 海信容声冰箱有限公司洁净操作台SW-CJ-1FD 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司万用电炉DL-1 北京中兴伟业仪器有限公司3pH计DELTA 320 梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO）2.3 试验方法2.3.1 常用培养基的配制方法１、牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏0.5ｇ；蛋白胨1ｇ；氯化钠0.5ｇ；琼脂2ｇ；蒸馏水100 mL；pH 7.2～7.6。
步骤：(1) 称量：准确地称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠放入烧杯中。
牛肉膏要玻棒挑取，放在小烧杯中称量，用热水溶化后倒入三角瓶。
也可放在称量纸上，称量后直接放入三角瓶中，按比例加水后再稍微加热，牛肉膏便会溶于水中，然后立即取出称量纸。
另外称取蛋白胨时要迅速准确。
(2) 融化：可先加少许水量在电炉上加热使其溶解。
药品完全溶解后，再补充水分。
将琼脂加到融化的药品中，不断搅拌加热，防止琼脂糊底，烧杯破裂。
最后再补充所失的水分。
(3) 调pH：先用精密纸测量培养基的pH值，一般pH偏酸，再向培养基中逐滴加入1mol/L的NaOH，一边加一边搅拌，并不停的用pH试纸测其pH值，直至pH达7.2～7.6。
注意慢调，以避免过碱，再回调pH，否则，会影响培养基内各离子的浓度，还有可能破坏培养基的成分。
如果有pH计，还可以用pH计。
(4) 分装，加塞，包装：按要求可将培养基分装于试管内或三角烧瓶内。
分装时要注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，避免沾污棉塞而引起污染。
固体若装于试管，则其装量不应超过管高的1/5，灭菌倾斜放置，制成斜面。
三角瓶的装量不应超过容积的一半。
(5) 灭菌，无菌检查：将上述培养基以1.05 kg/cm2，121.3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。
如不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
灭过菌后再将培养基放入37℃的温室中培养24～48小时，以检查灭菌是否彻底。
２、PDA培养基配方：马铃薯100ｇ；葡萄糖10ｇ；琼脂10ｇ；蒸馏水500 mL；自然pH。
步骤：(1) 称量：先把马铃薯洗干净，除去皮,再称取100ｇ马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用8层纱布过滤。
(2) 溶解：可加热后再加琼脂，搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍微冷却后再补充水分至500 mL。
分装、加塞、包扎、灭菌与上面的相似，如需备用，可冷存。
３、LB液体培养基配方：胰蛋白胨10ｇ；酵母提取物5ｇ；NaCl 10ｇ；蒸馏水1000 mL；pH：7.0 步骤：根据配方配置培养基，液体分装时不超过试管的1/4为宜，不超过三角瓶的1/2为宜，包扎灭菌等步骤与上面的相似。
2.3.2 采取土样在河南工业大学西门口的大谢村小麦地采取土样，用小铲挖取小麦根系土壤，选取５个点的小麦根系土壤，混合后备用。
2.3.3 分离土样中的细菌将采集到的麦田土壤作为内生细菌分离对象。
取采集到的10ｇ土样置于装有90ml 无菌水的三角瓶中，200r/min震荡30min即成10-1菌悬液，将所得的菌悬液吸取10ml置于装有90ml的无菌水三角瓶中，依次稀释成10-4、10-5、10-6，取0.1ml 稀释液涂布于装有牛肉膏蛋白胨培养基的平板上。
4次重复，28℃培养3～4d，记录单菌落数量。
根据平板上长出菌落的形态、颜色、大小等特征挑取不同单菌落，反复纯化后接斜面保藏。
2.3.4 筛选拮抗细菌1、拮抗细菌的初筛用对峙培养法，取直径为8 mm的禾谷镰刀菌菌饼置于PDA培养基平板( d = 90 mm) 中央，用接种环挑取细菌菌株点接在距离平板中央30mm处，28℃培养3～5d后测量抑菌带宽度，以仅接种禾谷镰刀菌的处理为对照，每个处理重复4次。
观察菌落的生长变化，根据公式计算抑制率，筛选出具有拮抗活性的菌株。
抑菌率(%) = [ (对照菌落直径（mm）-处理菌落直径（mm）) /对照菌落直径] ×100%2、拮抗细菌的复筛对有明显抑菌效果的细菌接种于装有100mL液体LB培养基的三角瓶中，三角瓶置于37℃摇床中，培养2d，将混浊的菌悬液注入无菌离心管中离心10min(5000 rpm) 可得到上清液。
在无菌操作台上，抽取上清液，用细菌过滤器滤去上清液中的细菌。
取200uL 无菌发酵液，涂布平板，待其凉干，接病原菌菌饼，每菌种三个重复并做对照，5～7d后观察对峙效果，测量抑菌圈直径或者半径。
2.3.5 细菌的生理生化鉴定１、形态学观察采用插片法、埋片法, 对该拮抗细菌的菌落形态特征作镜检观察。
用革兰氏染色进行油镜观察。
5①革兰氏染色溶液和试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式碘液，95%乙醇，番红复染液等。
试验步骤：(1) 涂片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不易过厚）、干燥和固定。
(2) 初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位1～２min，用水冲洗至流出水无色。
(3) 媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖１min，倾去碘液，水洗至流出水无色。
(4) 脱色：在上述涂片上流加95%乙醇溶液（一般20～30s），当脱色至流出液无色时立即用水洗去乙醇。
(5) 复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，用吸水纸吸去残水晾干。
(6) 镜检：用油镜观察。
②芽孢染色(1) 制片：按常规方法涂片、干燥及固定。
(2) 加热染色：向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持５min，加热时应注意补充染液，切勿让涂片干涸。