蛋白质杂交技术
蛋白质杂交技术
（三）转膜缓冲液
39mmol/L 甘氨酸 48mmol/L Tris碱 0.037% SDS
20% 甲醇
（四）染色液与脱色液 1．考马斯亮蓝R250染液 100mg考马斯亮 蓝R250溶于40ml 乙醇，加10ml冰醋酸，补 水至100ml。 2．考马斯亮蓝脱色液 40ml 乙醇，加10ml 冰醋酸，补水至100ml。 3．丽春红S贮存液 2g丽春红S，30g三氯乙 酸，30g磺基水杨酸，加水至100ml。
经双丙烯酰胺交联后丙烯酰胺凝胶的 刚性和抗张强度都有所增加，形成的小 孔必须能够允许SDS蛋白复合物通过
这些小孔的孔径随双丙烯酰胺、丙烯 酰胺比率的增加而变小，比率接近1:20 时孔径达到最小值。一般按双丙稀酰胺、 丙烯酰胺为1:29配制
表1 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围
丙烯酰胺浓度 （％）
2×蛋白上样缓冲液 100mmol/L Tris·Cl(pH 6.8) 200mmol/L二硫苏糖醇（DTT） 4% SDS(十二烷基硫酸钠) 0.2% 溴酚蓝 20%甘油
（二）SDS-PAGE试剂 1．30%丙烯酰胺溶液 丙烯酰胺30g、双
丙烯酰胺0.8g，溶于100ml水中，过滤后贮
于褐色瓶中低温保存，可用一个月。
溶液成分 （ml）
5%积 层胶
水
3.4
30%丙稀酰胺 0.83
1.5mol/L
－
Tris(pH8.8)
1.0mol/L Tris(pH6.8)
0.63
10%SDS
0.05
10%过硫酸胺 0.05
TEMED
0.005
总体积（ml） 5
不同浓度的分离胶 6% 8% 10% 12% 5.3 4.6 4.0 3.3 2.0 2.7 3.3 4.0
蛋白质互作方法总结
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。
把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。
一、酵母双杂交系统酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。
其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。
将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。
在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。
Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。
可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。
此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。
二、噬茵体展示技术在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。
此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。
目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。
三、等离子共振技术表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。
它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。
SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。
Western杂交
操作步骤：
编辑本段
原理
Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。
Western Blot编辑本段回目录此项技术是一种蛋白质的固定和分析技术，是将已用聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶或电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，其程序Sonthern Blot相似，故称为Western Blot,第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗(同位素或非同位素的酶)来检测，此方法可检测1ng抗原蛋白。Western杂交方法灵敏度高，通常可从植物总蛋白中检测出50ng的特异性的目的蛋白。
(2)用一张滤纸，剪成与胶同样大小，在转移电泳缓冲液中预湿，放在Scotch-Brit Pad上，在胶的阴性端放上滤纸，胶的表面用该缓冲液浸湿，排出所有气泡。
(3)在胶的阳极面放置同样大小浸湿的硝酸纤维素膜，排出气泡，再在滤膜的阳极端放置一张滤纸，排出气泡，再放一个Scotch-Brit Pad。
分子杂交名词解释细胞生物学
分子杂交名词解释细胞生物学
分子杂交指的是不同的DNA片段之间，DNA片段与RNA片段之间，如果彼此问的核苷酸排列顺序互补也可以复性，形成新的双螺旋结构。
这种按照互补碱基配对而使不完全互补的两条多核苷酸链相互结合的过程称为分子杂交。
分子杂交是利用分子间特异性结合的原理对核酸或蛋白质进行定性、定量分析的一项技术，主要包括核酸杂交和蛋白质杂交。
核酸分子杂交是在核酸变性及复性基础上建立起来的实验技术，是具有一定同源序列的两条单核苷酸链按碱基互补配对原则在退火条件下形成异质双链的过程。
蛋白质杂交则是一种以抗原—抗体特异性结合为基础的生物技术。
蛋白质杂交技术的原理和应用
蛋白质杂交技术的原理和应用1. 蛋白质杂交技术简介蛋白质杂交技术是一种常用的生物学实验方法，用于研究蛋白质的相互作用及其功能。
通过将两个不同的蛋白质片段或融合蛋白合并在一起，可以检测它们之间是否存在相互作用，并进一步研究这种相互作用的功能和机制。
2. 蛋白质杂交技术的原理蛋白质杂交技术基于DNA分子的互补性原理进行设计。
通过将目标蛋白质的DNA序列与另一个蛋白质的DNA序列连接在一起，形成一个新的杂交DNA，然后将这个杂交DNA转化到宿主细胞中，使宿主细胞表达出杂交蛋白。
通过检测该杂交蛋白的功能或相互作用，可以研究目标蛋白质的功能和相互作用机制。
2.1 DNA互补性原理DNA序列是由四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶）组成的，碱基之间存在对应关系，即腺嘌呤与胸腺嘧啶之间形成两个氢键，鸟嘌呤与胞嘧啶之间形成三个氢键。
根据这种互补原理，我们可以将两段DNA序列通过相互配对形成一个完整的DNA。
2.2 蛋白质片段连接将两个蛋白质的DNA片段连接在一起时，通常会使用DNA重组技术，通过PCR扩增目标DNA片段并使用限制性内切酶进行切割，之后通过连接酶将两个片段连接在一起，形成杂交DNA序列。
2.3 转染宿主细胞将合成的杂交DNA导入宿主细胞中，可通过多种方式实现，例如利用病毒载体将DNA导入细胞内，或通过电穿孔等物理方法使DNA直接进入细胞。
2.4 杂交蛋白表达和检测转染后，宿主细胞会开始表达杂交DNA中的融合蛋白。
通过特定的检测方法，如免疫印迹、荧光染色、酶活性测定等技术，可以确定杂交蛋白是否成功表达，并进一步研究其功能和相互作用。
3. 蛋白质杂交技术的应用蛋白质杂交技术被广泛应用于生物医学研究和药物开发领域，并取得了重要的成果。
3.1 蛋白质相互作用研究蛋白质杂交技术可用于研究蛋白质间的相互作用关系，从而揭示细胞内的信号传导途径、蛋白质结构和功能等方面的信息。
通过构建杂交蛋白库以及筛选和鉴定具有特定相互作用的蛋白质，可以进一步了解蛋白质的功能和作用机制。
蛋白互作常用的研究方法
蛋白互作常用的研究方法蛋白互作技术蛋白质是生物功能最直接的执行者，虽然一些蛋白质可以独立的完成他的使命，但是大部分的蛋白都是需要一些伴侣分子的协助一起完成任务或者形成复合物之后才能充分发挥他的功能。
所以，了解蛋白质与蛋白质之间的相互作用，能够帮助我们更好的了解细胞的生命活性，揭示隐藏在表象下的调控机理。
经典的蛋白互作研究方法主要包括三个：酵母双杂交、免疫共沉淀、GST-pull down。
蛋白质互作（图片来源：百泰派克生物【biotech-pack】）1. 酵母双杂交技术：主要用来进行互作蛋白的筛选，缺点就是假阳性较高，所以需要进行结果验证，一般可采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进行验证。
2. 免疫共沉淀：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内相互作用的有效方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B 也能一起沉淀下来。
再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行Western blot检测，进而证明两者间的相互作用。
3. GST pull-down实验：是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。
其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体，然后进行体外表达及纯化。
将得到的靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，充当一种“诱饵蛋白”，然后将目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的蛋白，将目的蛋白洗脱下来，通过SDS-PAGE电泳及western blot分析证实两种蛋白间的相互作用。
以上三种方法是比较经典的研究筛选和验证蛋白互作关系的方法。
但是也存在一定局限性。
酵母双杂交可以大规模的筛选未知的互作蛋白，但是假阳性高，免疫共沉淀及pull down只是对已知的蛋白互作关系进行验证，不能发现新的未知蛋白。
蛋白互作常用的研究方法
蛋白互作常用的研究方法
蛋白质互作常用的研究方法包括酵母双杂交技术、免疫共沉淀和GST pull-down实验。
1. 酵母双杂交技术：主要用来进行互作蛋白的筛选，缺点就是假阳性较高，所以需要进行结果验证，一般可采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进
行验证。
2. 免疫共沉淀：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内相互作用的有效方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A 的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉
淀下来。
再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行Western blot检测，进而证明两者间的相互作用。
3. GST pull-down实验：是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试
验技术。
其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体，然后进行体外表
达及纯化。
但是也存在一定局限性。
这些方法各有优缺点，应根据研究目的和具体情况选择合适的方法。
蛋白质杂交技术PPT课件
线性分离范围
36～94
5
57～212
1．SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制
（1）安装玻璃板
（2）确定凝胶溶液体积，按所需丙烯酰 胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。
依次混合各成分（见下表） 一旦加入TEMED，马上开始聚合，故 应立即快速旋动混合物并进入下步操作
表2 积层胶、分离胶所需溶液成分的配比
（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
✓原理是根据大多数蛋白质都能与阳离子 表面活性剂SDS按重量比结合成复合物
✓使蛋白质复合物所带的负电荷远远超过 天然蛋白质分子所带的负电荷，消除了 不同蛋白质分子的电荷效应
✓蛋白质分子的迁移速率完全取决于分子 量的大小，从而达到了分离不同分子量 大小蛋白质的目的
胶有效分离范围取决于用于灌胶的聚 丙烯酰胺的浓度和交联度。
由于蛋白质的电泳分离几乎总是在变性 的条件下进行，因此，不存在溶解、聚集 以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等问题。
还具有简便、标本可长期保存、结果便 于比较等优点。
二、试剂
（一）蛋白提取试剂 1．细胞裂解液
20mmol/L Tris(pH 7.5) 150mmol/L NaCl 1% Triton X-100 焦磷酸钠，β-磷酸甘油，EDTA，正钒酸钠 (Na3VO4)亮抑肽素等多种蛋白酶抑制剂
5．TEMED（N,N,N′,N′－四甲基乙二胺） 通过催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯 酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 6．Tris-甘氨酸电泳缓冲液 配成10×贮存液备用，在900ml去离子水 中溶解30g Tris碱和144g甘氨酸，然后加入 10g SDS，用HCl调pH至8.3，用去离子水 补至1000ml。 使用前用去离子水稀释成1×应用液。
使用时，将1份上述贮存液加9份去离子 水即为丽春红S应用液，使用后应废弃。
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•被转移到固相支持物上，固相支持物以非 共价键的形式吸附蛋白质
•以固相支持物上的蛋白质为抗原，与对应 的抗体发生特异性的抗原抗体结合反应
•与酶或同位素标记的第二抗体发生反应
•经过底物显色或放射自显影，以检测电泳 分离的靶蛋白。
20mmol/L Tris(pH 7.5) 150mmol/L NaCl 1% Triton X-100 焦磷酸钠，β-磷酸甘油，EDTA，正钒酸钠 (Na3VO4)亮抑肽素等多种蛋白酶抑制剂
2×蛋白上样缓冲液 100mmol/L Tris·Cl(pH 6.8) 200mmol/L二硫苏糖醇（DTT） 4% SDS(十二烷基硫酸钠) 0.2% 溴酚蓝 20%甘油
15
线性分离范围 （kD）
12～43
10
16～68
7.5
36～94
5
57～212
1．SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制
（1）安装玻璃板
（2）确定凝胶溶液体积，按所需丙烯酰 胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。
依次混合各成分（见下表） 一旦加入TEMED，马上开始聚合，故 应立即快速旋动混合物并进入下步操作
表2 积层胶、分离胶所需溶液成分的配比
第四节 蛋白质杂交技术
•检测DNA可用Southern印迹法
•检测RNA可用Northern印迹法
•检 测 蛋 白 质 同 样 有 蛋 白 质 印 迹 法 （Western印迹法）
•蛋白质印迹是将蛋白质转移到固相支持 物上，然后利用抗体与附着于固相支持 物上的靶蛋白发生特异性的抗原抗体结 合反应
一、原理
2.5 2.5 2.5 2.5
－ －－
－
0.1 0.1 0.1 0.1
0.1 0.1 0.1 0.1
0.008 0.006 0.004 0.004
10 10 10
10
15% 2.3 5.0 2.5
－ 0.1 0.1 0.004 10
（3）迅速在两板的间隙灌注丙烯酰胺溶 液，留出积层胶所需空间（梳子的齿长 再加1cm）。然后小心的在丙烯酰胺溶液 上加一层去离子水。凝胶垂直放置于室 温下。 （4）分离胶聚合完全后（约30min）， 倾斜倒出覆盖的去离子水。 （5）配制5%积层胶。
（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
•原理是根据大多数蛋白质都能与阳离子 表面活性剂SDS按重量比结合成复合物
•使蛋白质复合物所带的负电荷远远超过 天然蛋白质分子所带的负电荷，消除了 不同蛋白质分子的电荷效应
•蛋白质分子的迁移速率完全取决于分子 量的大小，从而达到了分离不同分子量 大小蛋白质的目的
•胶有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙 烯酰胺的浓度和交联度。
•Western印迹有SDS-PAGE的高分辨力
•固相免疫测定的高特异性和敏感性，可测 出1ng～5ng中等大小的蛋白质。
•由于蛋白质的电泳分离几乎总是在变性的 条件下进行，因此，不存在溶解、聚集以 及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等问题。
•还具有简便、标本可长期保存、结果便于 比较等优点。
二、试剂
（一）蛋白提取试剂 1．细胞裂解液
溶液成分 （ml）
5%积 层胶
水
3.4
30%丙稀酰胺 0.83
1.5mol/L
－
Tris(pH8.8)
1.0mol/L Tris(pH6.8)
0.63
10%SDS
0.05
10%过硫酸胺 0.05
TEMED
0.005
总体积（ml） 5
不同浓度的分离胶 6% 8% 10% 12% 5.3 4.6 4.0 3.3 2.0 2.7 3.3 4.0
•经双丙烯酰胺交联后丙烯酰胺凝胶的刚 性和抗张强度都有所增加，形成的小孔 必须能够允许SDS蛋白复合物通过
•这些小孔的孔径随双丙烯酰胺、丙烯酰 胺比率的增加而变小，比率接近1:20时 孔径达到最小值。一般按双丙稀酰胺、 丙烯酰胺为1:29配制
表1 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围
丙烯酰胺浓度 （％）
3．10% SDS 可用去离子水配成贮存液 保存于室温。 4．10%过硫酸胺 •过硫酸胺提供丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚 合所必需的自由基。 •可用去离子水配制小量的贮存液并保存 于4℃冰箱中。 •由于过硫酸胺会缓慢分解，故应隔周重 新配制。
5．TEMED（N,N,N′,N′－四甲基乙二胺） 通过催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯 酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 6．Tris-甘氨酸电泳缓冲液 •配成10×贮存液备用，在900ml去离子水 中溶解30g Tris碱和144g甘氨酸，然后加入 10g SDS，用HCl调pH至8.3，用去离子水 补至1000ml。 •使用前用去离子水稀释成1×应用液。
使用时，将1份上述贮存液加9份去离子 水即为丽春红S应用液，使用后应废弃。
（五）封闭液
5％脱脂奶粉 0.01% 防沫剂A 0.02%叠氮钠 溶于磷酸盐缓冲液（PBS）
三、实验方法
（一）样品前处理 •细菌一般直接用蛋白上样缓冲液裂解； •真核细胞或哺乳动物组织通常加细胞裂解 液，机械或超声波室温匀浆0.5min～1min。 •4℃ 10,000g～13,000g离心5min，取上清 •按照每4μl蛋白样品加入1μl 5×蛋白上样缓 冲液的比例混合。100℃水浴加热3min～ 5min，以充分变性蛋白。 •冷却到室温SDS-PAGE试剂 1．30%丙烯酰胺溶液 丙烯酰胺30g、双
丙烯酰胺0.8g，溶于100ml水中，过滤后贮
于褐色瓶中低温保存，可用一个月。
2．Tris缓冲液 （1）1.5mol/L Tris(pH8.8)/积层胶缓冲液： Tris碱 18.17g，用HCl调pH8.8，加水至 100ml。 （2）1.0mol/L Tris(pH6.8)分离胶缓冲液： Tris碱 12.11g，用HCl调pH6.8，加水至 100ml。
（三）转膜缓冲液
39mmol/L 甘氨酸 48mmol/L Tris碱 0.037% SDS
20% 甲醇
（四）染色液与脱色液 1．考马斯亮蓝R250染液 100mg考马斯亮 蓝R250溶于40ml 乙醇，加10ml冰醋酸，补 水至100ml。 2．考马斯亮蓝脱色液 40ml 乙醇，加10ml 冰醋酸，补水至100ml。 3．丽春红S贮存液 2g丽春红S，30g三氯乙 酸，30g磺基水杨酸，加水至100ml。