微生物工程实验指导2009
微生物工程实验报告
实验1 培养基的配制和灭菌一、目的要求1.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。
2.了解几种灭菌方法，掌握高压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。
3.熟悉菌种分离筛选的前期准备工作及操作方法。
4.每2人一组，每人一份实验报告。
二、实验材料1.药品：酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖、KNO3、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、1N HCl、1N NaOH2.设备：高压蒸汽灭菌锅、紫外线灭菌灯、75%酒精棉。
3.材料：天平、药匙、电炉、pH 试纸、烧杯、量筒、5mL、10mL 注射器、玻璃棒、试管、培养基、吸管、移液器（1mL 0.2mL）、牛皮纸、线绳、标签等。
三、实验内容(一) 培养基的配制1．培养基的配制方法和步骤1)称量：按照配方正确称取所需药品放于烧杯中。
2)溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。
3)调pH 值：用1N NaOH 或1N HCl 调pH，用pH 试纸对照。
4)加琼脂溶化：加热过程要不断搅拌，可适当补水。
5)分装：注意不要污染试管塞或纱布。
6)包扎成捆：用记号笔注明何种培养基。
7)灭菌：在高压锅中， 115 °C 高温灭菌30min。
2．培养基的配制A.富集培养基（液体）：海水2216E 液体培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉1.0，海水1L，pH 8.0。
取50mL 分装250mL 三角瓶后，8 层纱布封口，外包1层牛皮纸，121℃，高温灭菌20min。
B. 2216E 斜面（固体）：海水2216E 液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内。
加入3mL，121℃高温灭菌20min，灭菌后摆斜面。
C. 无菌生理盐水和保种液：生理盐水： NaCl 0.85% 蒸馏水配制。
每支试管加入5mL，盖上试管帽、包扎、121°C 高温灭菌20min。
保种液：生理盐水，加25%甘油D. 碳源优化培养基：以海水2216E 液体培养基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，磷酸铁0.01%，人工海水，pH7.6）为基础，碳源分别是：葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、乳糖，每种碳源的添加量为1%。
《微生物技术大实验》实验指导
《微⽣物技术⼤实验》实验指导《微⽣物技术⼤实验》实验指导（适⽤专业：11级本科⽣物技术微⽣物学⽅向）柯野编韶关学院英东⽣命科学学院2014年实验⼀、重组毕⾚酵母发酵表达蛋⽩酶及其初步鉴定⼀、实验⽬的1、学习重组毕⾚酵母培养基产物表达的⽅法。
2、学习发酵过程中菌体浓度的测定。
3、学习表达的重组蛋⽩酶的鉴定及其酶活的测定。
⼆、实验内容1、毕⾚酵母的菌体⽣长和诱导表达的培养基的制备。
2、重组毕⾚酵母⽣长菌体曲线的测定。
3、对重组毕⾚酵母⼯程菌株的诱导表达。
4、对重组毕⾚酵母⼯程菌株的诱导表达发酵液的酶活测定。
5、SDS-PAGE鉴定重组蛋⽩酶。
三、实验原理蛋⽩酶是催化蛋⽩质化合物中肽键⽔解为⼩肽或氨基酸的⼀类酶总称，⼴泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实及微⽣物中，并且对⽣物体的⽣理调控、催化各种代谢反应等⽅⾯具有重要的作⽤。
蛋⽩酶是⼀类重要的⼯业⽤酶，约占整个⼯业⽤酶量60%以上；⼴泛应⽤于⾷品加⼯、⽪⾰、医药和化⼯等⾏业。
由于蛋⽩酶具有⼴泛的⼯业、⾷品和医药等⽅⾯的应⽤价值，⽬前⼯业上需求量⼤。
植物中提取的蛋⽩酶主要是中性蛋⽩酶。
植物蛋⽩酶⽣产依赖于植物种植，这易受到季节、地理、⽓候等多因素的影响致使来源不稳定。
动物源性蛋⽩酶多从⽜、⽺和猪等的胰脏中提取⽽得。
动物来源蛋⽩酶⽣产成本较⾼，并受到世界动物保护协会和⼈员的强烈反对，⽬前主要⽤于医药⽅⾯。
因此，动植物源蛋⽩酶不能满⾜当代⼯业的需要。
微⽣物源蛋⽩酶⼏乎具有所有植物和动物来源蛋⽩酶的应⽤特性，成为了⽬前的蛋⽩酶的重要来源。
据统计，微⽣物蛋⽩酶占据了世界蛋⽩酶销售⼤约70%以上的份额。
⽬前商业化的蛋⽩酶主要来源于芽孢杆菌，中性蛋⽩酶来⾃植物⽊⽠，⽽来源于真菌的极少。
⽬前，国内外学者对来源于霉菌的蛋⽩酶的研究主要集中于通过优化固体(或者液体)发酵来提⾼蛋⽩酶的产量或通过分离纯化其产⽣的部分酶进⾏性质研究；⽽优化发酵条件很难⼤幅度提⾼蛋⽩酶产量，且发酵过程易受多种因素(如易污染或菌株⽣长状态)影响。
微生物学类实验指导书(下)
实验一产酶微生物的分离、纯化与选育酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。
由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。
目前，能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。
通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。
1. 淀粉酶产生菌的分离与纯化1.1 实验目的学习从自然界中分离淀粉酶产生菌，并进行分离与纯化。
1.2 实验原理淀粉是由葡萄糖通过α-1，4糖苷键构成的直链淀粉和α-1，6位有分支的支链淀粉组成的。
按照水解淀粉方式的不同，主要的淀粉酶可分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和解枝酶（或异淀粉酶）4大类。
产淀粉酶的微生物有细菌、霉菌和酵母菌等。
利用淀粉遇碘液变为蓝色的特性，将分离的芽孢杆菌（或其他微生物）接种在含有淀粉的固体培养基表面进行培养，利用滴加碘液后菌落周围出现的透明圈判断该菌是否产生淀粉酶及初步判断淀粉酶活力的高低。
1.3实验仪器与材料土壤样品或其他富含淀粉质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、淀粉培养基平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。
1.4 实验方法与步骤1.4.1分离1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液；2）取1：10土壤悬液5 ml，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75-80 ℃水浴中热处理10min，以杀死非芽孢细菌；3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置，于30-32 ℃培养24-48 h；4）对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
微生物工程实验指导
微生物工程实验指导 田沈 范黎 杨秀山编首都师范大学生命科学院微生物系2005年8月目 录实验一 土壤中稀有放线菌的分离和纯化 (3)实验二 抗生菌的体外鉴别 (6)实验三 淀粉质原料的酒精发酵 (9)实验四 四环素的定向发酵及效价测定 (15)实验五 菌种保藏 (18)实验六 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的原生质体融合 (25)附录Ⅰ 实验常用培养基配方及其配制方法 (27)附录Ⅱ 实验中常用试剂的配制 (32)参考书目 (33)实验一 土壤中稀有放线菌的分离和纯化目的1、了解采集土样的要求和方法。
2、掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术。
3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。
原理筛选放线菌是新抗研究的重要课题之一。
迄今为止，已发现的抗生素有80%皆来自于放线菌。
放线菌主要存在于土壤中，并在土壤中占有相当大的比例。
一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。
通常，随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。
土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。
若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。
然而，当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。
由土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法，并通过选用特殊培养基的方法，来获得少量稀有放线菌。
仪器和材料1、培养基：葡萄糖天门冬素琼脂，精氨酸琼脂，高氏1号琼脂，以上每种培养基皆用500ml三角瓶分装250ml。
2、灭菌物品：牛皮纸袋，培养皿，1ml、5ml吸管，250ml三角瓶分装90ml无菌水（含30粒玻璃珠），18×180mm试管分装9ml无菌水，牙签，玻璃刮铲，18×180mm试管中分装10 ml 1‰K2Cr2O7母液。
《微生物与发酵工程实验指导》实验指导
5、实验室应保持肃静，不得谈笑喧哗，不许搞其他动作，以免影响他人实验。
6、清洗仪器、用具、材料时，须将固形物倒入指定容器内，不得直接倒入水槽，以免造成水管堵塞。
7、实验过程中，须按操作规程仔细操作，注意观察试验结果，应及时记录。不得抄写他人的实验实习记录，否则，须重做。如有疑问，应向指导教师询问清楚后方可进行。
冷藏(2～5℃)
成 品
（二）、酸奶制作操作要点
⑴调配与均质 按1:7（14.3g:100ml）的比例加水（水质要求： PH6.5～7.3，硬度≤10度（德国度）），在45～50℃下把奶粉配制成复原牛奶，并加入10%白砂糖及适量（0.4-3.0%）稳定剂变性淀粉（使制成的酸奶口感饱满，粘度高，抗机械剪切力强，使酸乳在输送过程中保持良好状态），高速混料，水合45 ～60min，防止气泡产生。或用市售鲜牛奶加5%蔗糖调匀也可。
2、酵母菌常用培养基
（1）麦芽糖培养基 蛋白胨1%
麦芽糖2%
酵母膏0.5%
琼脂2%
自然pH 121.3℃灭菌20min。
3、霉菌常用培养基
PDA（马铃薯蔗糖培养基） 去皮马铃薯200g切成小块，加水1000ml煮沸30min出汁，三层纱布过滤，滤液中加入2%蔗糖，补充水至终体积1000ml，加琼脂2%，自然pH。121.3℃灭菌20min。
⑻品味 品尝自己制作的酸奶，判断其感官品质是否达到要求，若达不到要求，分析其原因。
酸奶质量的评定以品尝为标准，通常有色泽、凝块状态，表层光洁度、酸度及香味、无异味等各项指标。感官检验试验方法
2．麸曲培养基制备：取市售、无霉变麸皮过筛去除细粉（50目筛），称取8g麸皮，加入250ml三有瓶中，加水约8ml拌均，于121℃灭菌30min即得。
微生物学实验指导MICROBIOLOGYEXPERIMENT微生物学实验指导微生物学实验共20页
干热灭菌的原理
• 干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固 变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与 其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细 胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水 量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热 灭菌所需温度要高（160～170纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。
一般用于糖发酵或血清学试验，和其它需要节省材料 的试验。
• 三角瓶:
100mL、250mL、500mL和1000 mL 用来装无菌水、培养基和振荡培养微生物等.
• 烧杯:
50mL、100mL、250mL、500mL和1000mL 用来配制培养基与各种溶液等。
• 玻璃吸管: 0.2mL、0.5mL、 1mL、 5mL、10mL
脱脂棉），目的是避免将外界或嘴中杂菌吹入管内，或不慎 将菌液吸出管外。
玻璃器皿的洗涤方法:
1、新玻璃器皿的洗涤 在2%的盐酸溶液中浸泡数小时，用自来水冲洗干净。
2、旧玻璃器皿的洗涤 （1）试管、培养皿、三角瓶：洗衣粉和去污粉洗刷，自来水冲洗
洗涤装后有，固若体内培壁养的基水：均刮匀掉分，布洗成涤一薄层，表示完全洗净，若还 挂有水珠，则需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水冲洗。
微生物学实验指导 MICROBIOLOGYEXPERIMENT微生物学
实验指导微生物学实验
时间反复无常，鼓着翅膀飞逝
环境工程微生物学实验指导书
实验报告要包括以下内容： 1．实验名称、学生姓名、学号、班号和实验日期； 2．实验目的和要求； 3．实验仪器、设备与材料； 4．实验原理；
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武汉科技大学实验指导书
5．实验步骤； 6．实验原始记录； 7．实验数据计算结果； 8．实验结果分析，讨论实验指导书中提出的思考题，写出心得与体会。
二、实验内容
掌握细菌的革兰氏染色方法；掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养，以观 察菌种的个体，学会生物图的绘制。
三、实验仪器、设备及材料
显微镜、载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、石碳酸复红染液、草酸铵结晶紫染液、革氏 碘液、95%乙醇、蕃红染液、接种钩、酒精灯、已培养好的菌株。
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武汉科技大学实验指导书
实验三 微生物的接种技术
一、实验目的
掌握从环境中分离培养微生物和对微生物进行扩大培养的方法，从而获得若干种微生物的纯培养 技能。
二、实验内容
以微生物的斜面接种技术为例，掌握微生物的各种接种技术中需要注意的问题。
三、实验仪器、设备及材料
无菌斜面培养基、已培养好的待接种微生物、酒精灯、接种钩、无菌操作台。
七、实验注意事项
必须严格掌握乙醇脱色程度，如果脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够时，阴性菌被误 染为阳性菌。
八、思考题
1、光学显微镜的操作方法？ 2、微生物的染色原理是什么？ 3、绘制细菌的形态图，并说明革兰氏染色的结果。 4、通过革兰氏染色，你认为它在微生物学中有何实践意义？
主要参考文献： 周群英 高廷耀编著，环境工程微生物学（第二版）中第三部分“环境工程微生物实验”，高等教育出版 社，北京，2000
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武汉科技大学实验指导书
临床2009医学微生物教学大纲
4.熟悉真菌的微生物学检查法；
5.了解真菌感染的防治原则（了解真菌感染的治疗药物）
第三十七章主要病原性真菌
1.熟悉表面感染真菌、皮肤癣真菌形态特点；
2.熟悉皮下感染真菌、地方性流行真菌（掌握各种真菌的形态特点）；
3.掌握各种真菌的致病性及感染特点。
大纲制定者：高丰光
大纲审定者：
3.熟悉水痘-带状疱疹病毒与单纯疱疹病毒特性的区别及致病性；
4.熟悉EB病毒的致病机制与所致疾病；
5.熟悉人巨细胞病毒致病机制与所致疾病。
第三十三章逆转录病毒
掌握人类免疫缺陷病毒（生物学性状、传播环节、致病特点及防治原则）
第三十四章其它病毒
1.掌握狂犬病病毒（掌握要生物学特性、传播环节、致病特点及防治原则；
4.熟悉铜绿假单胞菌的生物学特性和致病性；
5.熟悉空肠弯曲菌的生物学特性和致病性。
和致病性；
2.熟悉诺卡菌属的生物学特性和致病性
第十九章支原体
1.熟悉支原体的培养特点及与细菌L型的主要区别；
2.掌握肺炎支原体和解脲脲原体的致病性；
3.熟悉肺炎支原体和解脲脲原体的致病性。
第九章球菌
1.掌握各种化脓性细菌的形态染色、培养特性，致病物质和所致疾病。
2.掌握葡萄球菌、链球菌的抗原构造及分类。
3..熟悉化脓性细菌的微生物学检查方法
4.了解其防治原则。
第十章肠杆菌科
1.掌握肠道杆菌的共同特性。
2.掌握埃希菌、志贺菌、沙门菌的致病物质、所致疾病。3.熟悉肠道感染细菌的生化反应特点、微生物学检查及防治原则。
第二十六章呼吸道病毒
1.掌握流感病毒的生物学特点、抗原变异与流行的关系；
2.熟悉流感病毒的致病性；
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微生物工程实验指导河北农业大学生命科学学院制药工程系2007 年10 月实验一细菌生长曲线的测定一、实验目的了解细菌生长曲线特点及测定原理；学习用比浊法测定细菌的生长曲线。
二、原理将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。
它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。
依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。
这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。
因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。
测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。
本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD 值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD 值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。
三、实验材料1. 菌种大肠杆菌（E.coli ）o 严去甘2. 培养基肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g,蛋白胨10g, NaCI 5g，琼脂15-20g，水1000mL，调pH 7.0-7.2。
3. 仪器和器具721 分光光度计，比色杯，恒温摇床，无菌吸管，试管，三角瓶。
四、流程种子液f 标记f 接种f 培养f 测定五、实验方法1. 种子液制备取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入肉膏蛋白胨培养液中，静止培养18h作种子培养液。
2. 标记编号取盛有50mL(5mL)无菌肉膏蛋白胨培养液的250mL三角瓶(18X 180试管)11 个，分别编号为0、1.5、3、4、6、& 10、12、14、16、20h。
3. 接种培养用2mL (1mL)无菌吸管分别准确吸取2mL (0.2mL)种子液加入已编号的11个三角瓶(试管)中(可早、晚各接种一次，则均在白天取样，次日下午或晚上可测)，于37C下振荡培养。
然后分别按对应时间将三角瓶(试管)取出，立即放冰箱中贮存，待培养结束时一同测定OD600值。
4. 生长量测定将未接种的肉膏蛋白胨培养基倾倒入比色杯中，选用600nm波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.10-0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD 值。
六、结果1. 将测定的OD值填入下表：2. 以上述表格中的时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制大肠杆菌的生长曲线实验二从土壤中分离产酸细菌一.实验目的要求：掌握微生物分离纯化的方法，学习筛选培养基制备原理和方法。
二.实验原理：从混杂的微生物群体中获得某一种或某一株微生物的过程，称微生物的分离与纯化，本实验采用稀释涂布平板法分离产酸细菌，以碳酸钙为底物，经产酸菌酸化形成透明圈。
2H+ + CO3J CO z f + HO三.主要设备、器材：1■实验器皿：250 mL三角瓶2只；试管7支（带棉或硅胶塞）；9 cm培养皿6个; 1 mL 移液管7根；吸耳球1个；涂布棒3个；废报纸、棉花、棉绳、玻璃珠若干。
净工作台、接种环、酒精灯各一套2■实验试剂：琼脂，蛋白胨，牛肉膏，CaCO3, 0.5mol/L的HCI溶液，0.5mol/L的NaOH 溶液，玻璃棒，pH 试纸四实验步骤：1. 分离用器皿的准备用报纸包扎6个培养皿，7根1mL移液管，3个涂布棒，160 C干热灭菌60 min。
（亦可121C湿热灭菌20 min）2. 无菌水的制备取1只250 mL三角瓶装入90 mL自来水和15-20粒玻璃珠。
121C湿热灭菌20 min。
取6支试管各加自来水9 mL （6只一捆）。
121C湿热灭菌20 min。
3. 培养基的制备及分离平板制作取1只250 mL三角瓶制作细菌固体培养基100 mL （配方：蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，CaCO3 1%，琼脂1.8-2.0%，pH 7.0），121 C湿热灭菌20 min，60C 恒温箱保温。
倒平板，将培养基充分摇匀呈浑浊液，立即在超静台上将6 个培养皿倒入细菌培养基（约15-16 mL）。
4. 土壤中产酸细菌的分离操作称取校园土10 g,在超静台无菌操作倒入冷却至室温的无菌水中（90 mL蒸馏水/250mL三角瓶带玻璃珠），摇匀5-10 min，制成菌液，用十倍稀释法稀释到10-6 （5 支无菌水试管）。
分别取10-4，10-5，10-6稀释度的稀释液，每个稀释度涂布两个培养皿，每个培养皿0.1 mL （2-3滴）。
35C培养箱培养2d，观察单菌落周围有无透明圈出现。
如有透明圈说明该菌株可能产酸。
（以下内容选作）挑取具有透明圈的单菌落至牛肉膏蛋白胨斜面，进一步利用划线分离法纯化，做产酸能力实验。
从复筛培养基上挑取透明圈较大的单菌落接种至三角瓶液体培养基中，摇床培养2天后，检测产酸能力（用pH 试纸或酸碱滴定法）。
五根据实验结果进行分析讨论六思考题:1. 根据实验结果回答，如何区分平板中非产酸菌？2. 你觉得本实验设计的筛选培养基该如何改进？实验二喷雾干燥酶粉中分离筛选1398 中性蛋白酶生产菌株（选做）一、实验目的要求掌握微生物分离纯化的方法，学习筛选培养基的制备，灭菌等无菌操作技术。
二、实验原理中性蛋白酶是许多微生物分泌到胞外的能在pH 值中性范围内水解蛋白质的酶类，利用此机制以干酪素为底物，根据水解透明圈与菌落比值的大小来进行菌株的筛选。
比值大的其产酶活力明显增大。
三、材料与方法1、试验材料供试材料为喷雾干燥的中性蛋白酶样品。
购自市场。
2、培养基（1）干酪素培养基：干酪素 2.0％（用适量NaOH 溶液加热溶解），琼脂1.5%, pH7.0 （或干酪素4g,硫酸镁0.5g,氯化钾0.5g，硫酸铁O.OIg,蔗糖30g,琼脂20g, 1000mL）。
（2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.4%，蛋白胨0.6%，酵母浸出粉0.2%，NaCl 0.5 %，琼脂 2.0%，pH7.0（3）发酵培养基I:麸皮 4.0 %，蛋白胨0.1%, Na2HPO4 12H2O 0.4%, KH 2PO4 0.03%, pH7.0。
发酵培养基U:可溶性淀粉 1.0%,蛋白胨0.5%, Na2HPO4 12H2O 0.4%, KH2PO4 0.03% , CaCI2 0.1%, pH7.0。
3、仪器与设备超净工作台,恒温培养箱,恒温振荡培养箱,恒温水浴锅,台式低速离心机, 721 型分光光度计4、步骤（ 1 ）初筛利用样品通过常规稀释平板法：即取10 g样品置于已加入90mL 无菌水的三角瓶中，220 r/min旋转摇床，20 min后取出，静置30 s。
此三角瓶中液体的浓度为10-1，再用7支分别装有9 mL 无菌水的试管进行稀释，稀释至10-8。
将干酪素培养基分别倒入已灭菌的 6 个平皿中，每个平皿倒入10 mL 左右，然后吸取0.1 mL 的10-6，10-7，10-8稀释液分别涂布于干酪素培养基表面，每个稀释浓度涂布2个平皿。
37 C培养24 h。
肉眼选出产生透明圈的菌株。
将牛肉膏蛋白胨培养基分别倒入7个已灭菌的平皿（每个平皿倒10mL 左右，置平板）和7支试管（每支试管6mL左右，置斜面）内。
然后将选出来的若干株菌在平皿上划线，每株划一个平皿。
37 'C培养24 h。
取出，然后从平皿中选出其单菌落划线至斜面试管（每个平皿对应一支斜面试管）进行活化培养，37 C培养24 h。
（2）复筛面试管中分别接一环对应于装有发酵培养基I的三角瓶中进行发酵培养。
30 C恒温振荡培养48 h，3500r/min离心30 min，取上清液测蛋白酶活力。
然后从中挑选出酶活力较高的1-3株。
用发酵培养基H进行发酵培养，30 C恒温振荡培养48 h，3500 r/min离心30 min，取上清液测蛋白酶活力。
然后从中挑选出酶活力最高的 1 株。
5、蛋白酶活力的测定（1）原理采用福林-酚试剂法。
福林酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色（钼蓝和钨蓝混合物），由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸，色氨酸等），可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。
因此可利用此原理测定蛋白酶活力。
通常以酪蛋白为底物，在一定pH 值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶反应，经离心或过滤除去酪蛋白等沉淀物后取上清液，用Na2CO3 碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比，酪氨酸含量用分光光度计在660 nm处测定，从而计算出蛋白酶活力。
（2）试剂福林-酚试剂在2000mL 磨口回流瓶中，加入100g 钨酸钠（Na2WO4 2H2O），25g 钼酸钠（Na2MoO4 2H2O）及700mL 蒸馏水，再加50mL85%磷酸，100mL浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入50g 硫酸锂（Li 2SO4），50mL 蒸馏水及数滴浓溴水（99％），开口继续沸腾15 分钟，以便驱除过量的溴。
冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加浓溴水的步骤）。
定容至1000mL，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。
此溶液使用时加两倍蒸馏水稀释，即成已稀释的福林试剂。
0.4mol/L 三氯乙酸（TCA）溶液精确称取TCA65.4g ，加去离子水定容至1000 mL。
0.4mo1/L 碳酸钠溶液精确称取无水碳酸钠42.4 g，加去离于水溶解后，定容至1000 mL。
pH7.2 磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钠（NaH2PO4 2H2O）31.2 g，定容至1000 mL，即成0.2 mol/L溶液（A液）。
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4 12H2O）71.63 g，定容至1000 mL，即成0.2 mol/L 溶液（B 液）。
取 A 液28 mL 和 B 液72 mL ，再用蒸馏水稀释 1 倍，即成0.1 mol/L 、pH7.2 的磷酸盐缓冲液。
准确称取干酪素2 g,称准至0.002 g,加入0.1 mol/L氢氧化钠10 mL ,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮2%酪蛋白溶液沸)，然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100 mL即成。
配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。
100卩g/m酪氨酸溶液精确称取在105 °C烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000 g,用1 mol /L盐酸溶液60 mL溶解后，用蒸馏水定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。
吸取1 mg/mL酪氨酸标准溶液10 mL，用0.1 mol /L盐酸溶液定容至100 mL，即得到100g g/mL的酪氨酸标准溶液。