酵母重新转化及对照制备
酵母感受态的制备(化学法)
1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene gl ycol缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0. 5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulD MSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。
酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？各种SD培养基：1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his（组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4) SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5) SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
酵母双杂(共转)
酵母双杂交的原理及实验步骤吴健2015.12.25一酵母双杂交的原理在酵母细胞中，有半乳糖存在的情况下，GAL4 可以激活半乳糖代谢酶GAL1的转录。
GAL4 蛋白包含两个结构域，单独的N 端的结构域(BD)可以特异地结合DNA 但是不能够激活转录；单独的C 端包含一个激活区域（AD）但是如果不能结合到17-mer 上游激活序列USA G 也不能激活转录。
将来自大肠杆菌的LecA DNA 结合域BD 和酵母的GAL4 转录激活域AD 重组后，在酵母中实现了下游基因的转录激活。
说明转录因子的BD 和AD 功能域可相互独立地发挥各自的作用，并且在重组后仍然具有基因转录的活性(Brent and Ptashne, 1985)。
酵母双杂交系统就是在这一分子基础上开发出来的，GAL4 的BD 和AD，分别与能够互作的蛋白X 和Y 融合表达。
由于XY 蛋白的结合，实现了GAL4 的BD 和AD 重组，GAL4 就重新获得了转录活性，转录因子就可以驱动报告基因表达(Fields and Song, 1989)。
除了将两个杂合载体BD-X 或AD-Y 转化入同一酵母细胞外，利用两个不同性别的酵母杂交（mating）也是实现BD 和AD 蛋白重组和蛋白互作检测的有效方法(Bendixen et al., 1994)。
Fig1. 酵母双杂原理图Fig2. 常用两种酵母菌的基因型Fig3. 常用两种酵母菌的报告基因Fig4. 常用AD和BD载体图Fig5. 酵母双杂流程图二酵母双杂交的基本步骤1 酵母感受态的制备配制培养酵母YPAD 培养基，以及筛选和转化酵母的SD 培养基，灭菌备用。
1) 用灭菌的接种环从保存的菌种中挑取一小块，在YPAD 培养基上划线分离单菌落，在30℃培养箱中倒置培养 3 d 活化菌种；2) 用灭菌的接种环挑取一个2-3 mm，生长时间小于一个月的单克隆到3 ml 的YPAD 培养基中，剧烈震荡1 min，打散所有的细胞块，30℃震荡培养8 h；3) 接种5 μl 的培养物到含有50 ml YPAD 的250 ml 的烧瓶中，30℃，250 r/min 震荡培养20 h，直到OD 600 =0.3；4) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用100 ml 的YPAD 重悬细胞块，30℃230-250 r/min 震荡培养3-5 h，直到OD 600 =0.4-0.5；5) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用60 ml 的灭菌的dd H2O 重悬细胞块；6) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用3 ml 的1.1×TE/LiAc 溶液重悬细胞块；7) 将上清分装到2 个无菌的1.5 ml 的离心管，室温13200 g 离心15 sec；8) 去除上清，用600 μl 1.1×TE/LiAc 溶液悬浮细胞块，感受态制备完成。
酵母双杂实验操作手册和注意事项
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。
基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。
后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。
酵母过程自己总结
一．准备过程(定容均用ddH2O)1，葡萄糖溶液用于给培养基提供碳源40%葡萄糖配100ml，即40g葡萄糖定容于100mlddH2O中。
1L培养基需要50ml葡萄糖溶液（葡萄糖溶液灭菌：115度，15分）2，10*LiAc溶液终浓度为1M用乙酸调PH7.5定容后高压灭菌3.10*TE溶液Tris 终浓度0.1M(Hcl调PH7.5)EDTA-Na 终浓度 0.01M二者混合定容后高压灭菌4.Trp—Leu终浓度8g/L（NaOH调PH6.0-6.5）加入Agar（20g/L）灭菌后倒板前加入灭好的55度预热的葡萄糖溶液5.Tre-Leu-His-Ura+3AT与4步骤相同，另3AT终浓度为25Mm6.x-gal solution溶液（注意现用现配）溶液包括 Z buffer 10ml10mg x-gal 溶于100ulDMF （避光）60ulẞ-巯基乙醇其中Z buffer(100ml装)包括Na2HPO4·12H2O 2.147g NaH2PO4·2H2O 0.591g MgSO4·7H2O 0.0246g Kcl 0.075g7.YPAD培养基1LYest extract 10gPeptone 20gDextrose 20gA 100mgAgar 20g(Hcl调PH6.0)二．酵母感受态的制备(MAV203)1.划板挑菌摇菌，30度，16-18小时后扩摇3-5小时，OD值=0.42.室温离心，5分钟，3000g，去上清3，加入一半量得灭菌水，重悬沉淀，再次离心，条件同上4.再用一半量的1*TE/LiAC,重悬沉淀，离心，条件同上5.后再用少量1*TE/LiAC,重悬沉淀，每管分装40-50ul后待转化另25ml1*TE/LiAC包括2.5ml10*TE2.5ml10*LiAC20mlddH2O（一般扩摇1L MAV203可以制备20管左右的酵母感受态）（注意即做即用）三．转化1.将ssDNA放于沸水中10分钟，后放于冰上5分钟，可重复一遍，使其彻底变性2.将感受态 40-50ulssDNA 5ulBD 1-2ulAD 1-2ul以上四种混合与离心管中，轻弹是其充分混合3．将10*TE 300ul10*LiAC 300ul50%PEG3350 2.4ml以上三种混合，取300ul，加入到2中离心管，震荡混匀10秒4.30度200rpm，摇陪30分钟5.42度水浴热激15分钟后放冰上数分钟6.6000-8000g，20-30秒离心后，去上清。
重组法酵母转基因的操作流程
重组法酵母转基因的操作流程1.酵母基因组DNA的提取酵母基因组DNA提取的目的是获取酵母菌体内的DNA用于后续的操作。
一般采用裂解酵母菌体的方法提取DNA，具体步骤如下：-通过酵母预培养，得到酵母菌悬浮液。
-沉淀酵母菌悬浮液，去除培养基。
-使用细胞裂解缓冲液裂解酵母细胞，释放DNA。
-使用丙酮沉淀DNA，去除其他杂质。
-通过洗涤、溶解等步骤得到纯化的酵母基因组DNA。
2.外源DNA的构建外源DNA的构建是将目标基因或其他DNA片段经过特定的操作，构建成可用于转基因的载体DNA。
-针对目标基因，进行PCR扩增或使用其他适当的方法获得目标DNA片段。
-将目标DNA片段与载体DNA进行连接，一般采用限制酶切和DNA连接酶的方法。
-外源DNA还可以构建其他特殊序列，如启动子、标记基因等，以实现特定的目标。
3.酵母菌体的转化转化是将外源DNA导入酵母中，使酵母细胞能够表达外源基因。
酵母菌体转化一般有两种方法：化学法和电转化法。
-化学法转化：-制备酵母靶菌株，包括选择合适的酵母菌株及对应培养基成分的调整。
-制备产生低盐胆固醇溶液和转化缓冲盐溶液。
-稀释酵母导入质粉末，并加入充足的低盐胆固醇溶液。
-在冰上孵育一段时间，将混合液通过热激冷冻的方法转移到电泳气泡中。
-通过勺子串入导入液，冻结导入液后，电泳电环泵注入电泳。
-电泳过程中伴有导入液的减量。
结束电泳时，针尾切割成小片。
-电转化法转化：-将酵母细胞培养至对应的生长期。
-调整酵母细胞浓度。
-准备转化缓冲盐溶液和性相为空凝气泡的溶液。
-将酵母细胞和目标DNA溶液混合。
-通过不同电压的电击法将酵母细胞进行电转化。
-回收转化后的酵母菌体并进行培养。
4.筛选转基因酵母为了筛选出成功转基因的酵母细胞，一般采用标记基因的方法。
-构建一个可表达特定筛选标记基因的转基因酵母菌株。
-将转化后的酵母菌种悬浮液培养在含有选择性的培养基中，使只有转基因酵母能够存活下来。
-通过对菌落进行PCR扩增或其他方法，确认是否成功获得目标基因的酵母菌株。
酵母转化手册(译自Yeastmaker
质粒 DNA（浓度、纯度高） 变性的**Yeastmaker 宿主 DNA (10 µg/µl)
Small‐Scale （1.5 ml tube） 100 ng 5 µl
Library‐Scale （15 ml tube） 5–15 µg* 20µl
（* For example, use 5 µg of bait + 10 µg of prey for yeast two‐hybrid library cotransformation. ）
50 µl 500 µl 30 min
600 µl 2.5 ml 45 min
6. 加入 DMSO，轻柔混匀
20 µl
160 µl
7. 在 42℃水浴锅中温浴
（注意：期间 Small‐Scale 每隔 5 min，Library‐Scale 每隔 10 min，轻轻倒混几次）
15 min
20 min
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B． 方法：转化酵母感受态细胞 1. 材料 Yeastmaker Yeast Transformation System 2 酵母感受态细胞(Section 6.A) PEG/LiAc (Section 4) 0.9% (w/v) NaCl DMSO 2. 将下列组分加入到已经预冷的无菌离心管中，混合均匀。
酵母菌表面展示实验前的准备工作步骤
酵母菌表面展示实验前的准备工作步骤酵母菌表面展示实验是一种常用的生物技术手段，用于在酵母菌表面展示外源蛋白或多肽，以实现对这些蛋白或多肽功能的研究。
在进行酵母菌表面展示实验之前，需要进行一系列的准备工作，以确保实验能够顺利进行并获得可靠的结果。
准备工作步骤如下：1. 酵母菌培养基的准备：酵母菌培养基是实验所需的基本培养基，可根据实验要求选择不同类型的培养基。
常用的酵母菌培养基包括YPD培养基、SD培养基等。
需要按照配方将培养基的各种成分称量并混合，然后进行高温高压灭菌，最后将培养基倒入适量的培养容器中。
2. 酵母菌培养样品的准备：酵母菌培养样品是实验中需要用到的酵母菌细胞，可以从实验室保存的冷冻细胞中复苏培养得到。
首先需要从冷冻细胞中挖取一小部分并接种到含有适量培养基的琼脂平板上，然后进行恒温培养。
培养过程中，可以观察到酵母菌的生长情况。
3. 酵母菌转化体的制备：酵母菌转化是将外源DNA导入酵母菌细胞内的过程，用于实现酵母菌表面展示。
在实验中，需要首先将目标基因克隆到酵母表达载体上，然后通过化学方法或电穿孔法将酵母表达载体导入酵母菌细胞内。
转化后，通过选择性培养基筛选出转化成功的酵母菌。
4. 酵母菌培养：在进行表面展示实验之前，需要将转化成功的酵母菌培养至适当的阶段。
通常情况下，酵母菌会从初级培养开始逐渐生长，直到达到所需的菌体数量。
在培养过程中，需要定期检测菌株的生长情况，调整培养条件以促进酵母菌的生长。
5. 准备相关试剂和材料：在进行酵母菌表面展示实验前，需要准备实验所需的各种试剂和材料。
例如，可以准备酵母菌培养所需的培养基组分和琼脂平板，准备转化所需的DNA、电穿孔缓冲液等。
此外，还需要准备一些常用的实验设备，如离心机、培养箱等。
6. 实验室卫生和个人防护：在进行酵母菌表面展示实验前，需要确保实验室的卫生状态良好，并采取必要的个人防护措施。
实验室应定期清洁和消毒，实验人员需要佩戴实验手套、实验口罩等个人防护装备，以避免可能的交叉污染和实验安全问题。
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酵母重新转化及对照制备(20181213)
背景：
前面酵母转化非常不顺，对照制备失败。
这次置换Y2HGold菌株（from陆勇军老师实验室），重新转化相关质粒以及制备酵母筛库的对照。
实验设计：
实验流程：
1.复苏及培养酵母
1)提前三天划板(YPDA无筛选板)复苏酵母细胞Y2HGold、Y187，至30℃恒温培养箱生长3
天
2)将复苏的菌落挑单克隆至3ml YPDA液体培养基(15ml摇菌管) ，至30℃恒温摇床200rpm
摇8h
3)将5ul/10l培养物分别转入2个50mlYPDA液体培养基（250ml锥形瓶）
至30℃恒温摇床200rpm摇16-20h，至OD600=0.15-0.3
4)将培养物转至50ml离心管，室温离心700g 5min
5)弃上清，将沉淀的酵母细胞重悬，转至100mlYPDA液体培养基（250/500锥形瓶）
至30℃恒温摇床200rpm摇3-5h，至OD600=0.4 -0.5
2.制备酵母感受态
6)将上述培养物转至2个50ml离心管，室温离心700g 5min
7)弃上清，悬浮于30ml去离子水中（50ml离心管），室温离心700g 5min
8)弃上清，悬浮于3ml 1.1XTE/LIAC中，分装于两个1.5mlEP管中，每管高速离心15s
9)吸弃上清，把沉淀悬浮于600ul 1.1XTE/LIAC中
3.转化
10)在1.5mlEP管中加入相应质粒1000ng
10)加入5ul Carrier DNA（提前变性处理：95~100℃ 5min，冰上冷却）
11)加入50ul 酵母感受态细胞，温和混匀
12)加入500ul PEG/LIAC，温和混匀
13)放入30℃水浴锅30min 每15min摇一次
14)加入20ul DMSO，温和混匀
15)放入42℃水浴锅30min 每10min摇一次
16)高速离心15s
17)弃上清，加入500ul YPD-plus液体培养基
放至30℃恒温摇床摇90min 100rpm
18)室温离心700g（2500rpm）5min
19)弃上清加入500ul 0.9% NaCl至EP管中
涂板吹干封板
（100ul 1/100稀释液于相应平板上玻璃珠摇匀）
20)放至30℃恒温培养箱生长3天
4.单转→mating
1)分别挑取一个2-3mm的菌落，制备酵母双杂对照
阳性对照：pGBKT7-53 x pGADT7-T
阴性对照：pGBKT7-Lam x pGADT7-T
2)将两种菌落挑入至加了500ul 2xYPDA液体培养基的1.5mlEP管
3)30℃，220rpm，20-24小时
4)100ul 1/10、1/100、1/1000 、1/10000 稀释液涂布于下列平板上：
DDO、QDO/X/A
5)放至30℃恒温培养箱生长3天
6)从DDO平板上挑取2-3mm的健康菌落，在新的DDO板上重新划线
（即得到pGBKT7-53 x pGADT7-T阳性对照克隆）
7)放至30℃恒温培养箱生长3天
8)保存：
短期保存（＜4周）：封口膜封好，4℃储存
长期保存：挑一个大而健康的菌落重悬于500ul YPDA+25%甘油中，-80℃储存。