酵母转化
酵母细胞转化
1. 挑取INVScI单菌落于5 mL YPAD培养基的试管中，30℃振荡（约250 rpm)培养过夜，OD600为1-2，取2 mL转入30 mL YPAD的50 mL的三角瓶中，30℃振荡（约250 rpm）孵育直至OD600为0.6（注：高培养密度会导致转化率下降）。
2. 4℃下1500×g离心10 min收集细胞。
3. 用1×TE Buffer ( pH 7.4) 冲洗细胞一次。
4. 用含200 mMLiAc 10-15 mL 的1×TE Buffer 9（无菌）重悬细胞，室温下放置10分钟。
5. 2500g离心收集细胞弃上清。
6. 用含200 mMLiAc的0.5 mL 1×TE Buffer(无菌)重悬细胞，用于转化。
7. 每次转化用上述制备好的感受态细胞溶液100μL。
8. 在含有100μL感受态细胞的离心管中，加入1μg待转化质粒DNA和100μg变性鲑鱼精DNA(salmon sperm DNA)。
9. 加入700μL的1XLiAc/40% PEG-3350/1XTE，彻底混匀。
10. 30℃孵育溶液30 min。
11. 加入88μL的二甲基DMSO，混匀，42℃热激7 min。
12. 高速离心10s，收集细胞。
13. 1mM 1× TE重新悬浮，再次离心，去除上清。
14. 重新加入50-100μL1×TE，混匀，均匀涂抹在筛选平板上。
15. 30℃生长2-3d，观察结果。
试验总结的几种高效酿酒酵母转化方法
电转法设计方案一:感受态制备：1 .挑一环酵母菌接种于5mLYEPD培养基中，30C、250-300rpm培养过夜；2 .取1mL一级种子分别接种于两瓶50mLYEPD培养基中，30C、250-300rpm培养约16-18h（OD:1.3-1.5）;3 .于4c离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水重悬，可换成较小的离心管；4 .加入1ml,pH7.5,10灯E缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml10*iAc,旋转摇匀，于30度轻轻摇动45min；5 .再加入0.4ml1mol/LDTT,并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min；6 .于4c离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤；7 .2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）；8 .每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70C冰箱保存。
电转化：1 .向感受态细胞中加入约5〜10ug（体积小于10ul）的DNA,用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；2 .擦干电转杯，电击，电击参数：1.5KV,25uF,200欧姆；3 .立即加入1ml预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30c静置1h;4 .离心，弃上清，加入1mLYEPD后，于30C、200rpm培养2h;5 .离心得菌体后，吸除550ul上清液，然后按150ul版进行涂板。
说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。
设计方案二：感受态制备：1 .挑一环酵母菌接种于5mLYEPD培养基中，30C、250-300rpm培养过夜；2 .取1mL一级种子分别接种于两瓶50mLYEPD培养基中，30C、250-300rpm培养约16-18h（OD:1.3-1.5）;3 .于4C,5000rpm,5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬于8ml处理液中（处理液配方：100mMLiAc,10mMDTT,0.6M山梨醇，10mMTris-HCl,pH7.5）,室温静置30min;4 .4C,5000rpm,5min离心收集菌体，用1.5mL1mol/L预冷的山梨醇洗涤三次，离心条件一样；5 .每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山梨醇），最后以80ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70C冰箱保存。
酵母是如何做成粉剂的原理
酵母是如何做成粉剂的原理酵母是一种微生物，以其在食品加工和发酵过程中的重要作用而闻名。
酵母常见的形态有酵母细胞（单细胞）和酵母菌团（聚集细胞）。
酵母菌主要是通过生长、培养和分离等步骤制备成粉剂。
下面将详细阐述酵母制备成粉剂的原理。
首先，酵母的生长主要依赖营养物质，如碳源、氮源、矿物盐和维生素等。
在培养过程中，人们通常选择适当的培养基，提供充足的营养物质，促进酵母的繁殖和生长。
常用的培养基包括琼脂糖、葡萄糖、酪蛋白胨和酵母粉等。
酵母菌在最适宜的温度、pH值和氧气条件下培养，通过无限增殖和分裂，形成可见的酵母悬浮液。
其次，酵母菌团的形成是酵母制备成粉剂的关键步骤。
当酵母悬浮液培养到一定浓度时，可以采取离心分离或超滤等方法将酵母细胞从悬浮液中分离出来。
然后，采用适当的方法，如液-液接触、搅拌、吹膜等，使酵母细胞相互接触和聚集形成酵母菌团。
酵母菌团比酵母细胞更易于干燥和保存，所以将酵母制备成粉剂的过程中主要是转化为酵母菌团。
然后，酵母菌团经过适当的处理和处理，可将其转化为酵母粉。
处理过程中常见的方法有冷冻干燥、热风干燥、喷雾干燥和真空干燥等。
在干燥过程中，酵母菌团中水分逐渐蒸发，菌团中的酵母细胞逐渐死亡。
在适当的时间和温度条件下，酵母菌团完全干燥后，形成了酵母粉。
最后，酵母粉通常被加入食品加工中。
酵母粉在加工过程中可以发酵并产生二氧化碳和乙醇等物质，促进食品的膨松和美味。
此外，酵母粉还可以在食品加工过程中提供植物蛋白、增加营养成分、改善食品口感和延长保质期等。
总的来说，酵母制备成粉剂的原理主要包括：1）提供适宜的培养基和条件，促进酵母的繁殖和生长；2）将酵母悬浮液中的酵母细胞分离并聚集形成酵母菌团；3）对酵母菌团进行适当的处理和干燥，转化为酵母粉；4）将酵母粉应用于食品加工中，发挥其发酵和促进作用。
酵母粉作为食品和饮料加工中的常见原料，被广泛应用于面包、饼干、啤酒、葡萄酒、酸奶等产品中，为食品产业的发展和食品质量的提高做出了重要贡献。
酵母转化试剂盒使用说明书第二版
酵母转化试剂盒使用说明书（第二版）储存条件：Carrier DNA-20℃保存，其它组分可室温保存，有效期1年。
产品内容：Components SK2400-200PEG Solution50mlLiAc Solution50mlCarrier DNA2×1ml说明书1份酵母感受态细胞的制备：1.活化菌种。
-80℃保存的菌种在固体YPDA培养基（YPDA加20g Agar/L）上划线，在30℃培养2-4天。
2.挑取酵母单菌落在固体YPDA培养基上划3-5mm的短线，在30℃培养2-4天。
待酵母单菌落长至2mm长时，接种。
3.首先把酵母细胞接种到3ml液体YPDA培养基中，30℃过夜培养。
4.第二天转接到含有30ml液体YPDA培养基的三角瓶中继续培养，待OD600到0.4-0.5范围内。
收集细胞，1000g，离心5min,去上清。
5.沉淀用30-50ml的无菌的去离子水悬浮。
1000g，离心5min，去上清。
6.沉淀用合适体积的1/10浓度的LiAc悬浮（30ml的酵母菌最多用不超过1mL的1/10浓度的LiAc悬浮，通常100μl的酵母细胞用于转化一个质粒，即一个反应）。
1/10浓度的LiAc稀释方法：100μl LiAc Solution+900μl无菌水。
7.把酵母细胞的悬浮液分装到1.5ml的离心管中，每管分装100μl，用于转化一个质粒即一个反应。
1000g，离心5min，去上清。
制备好的感受态细胞备用。
酵母转化：1.配制预混液，每转化一个质粒即一个反应需要360μl的预混液。
PEG Solution240μlLiAc Solution36μlCarrier DNA10μl质粒（大约200ng/μl）5μl（根据质粒的浓度加入相应的体积）总体积360μl（不足体积用ddH2O补充）2.吸取360μl的预混液加入到感受态细胞中，用枪头反复吹吸沉淀，使离心管底的酵母细胞彻底地悬浮在含有PEG的预混液中。
酵母转化手册(译自Yeastmaker
质粒 DNA（浓度、纯度高） 变性的**Yeastmaker 宿主 DNA (10 µg/µl)
Small‐Scale （1.5 ml tube） 100 ng 5 µl
Library‐Scale （15 ml tube） 5–15 µg* 20µl
（* For example, use 5 µg of bait + 10 µg of prey for yeast two‐hybrid library cotransformation. ）
50 µl 500 µl 30 min
600 µl 2.5 ml 45 min
6. 加入 DMSO，轻柔混匀
20 µl
160 µl
7. 在 42℃水浴锅中温浴
（注意：期间 Small‐Scale 每隔 5 min，Library‐Scale 每隔 10 min，轻轻倒混几次）
15 min
20 min
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B． 方法：转化酵母感受态细胞 1. 材料 Yeastmaker Yeast Transformation System 2 酵母感受态细胞(Section 6.A) PEG/LiAc (Section 4) 0.9% (w/v) NaCl DMSO 2. 将下列组分加入到已经预冷的无菌离心管中，混合均匀。
酵母转化的原理
酵母转化的原理
酵母转化指的是酵母菌体内发生的一系列生化反应，将底物转化为产物的过程。
其原理是酵母菌体内的酶作用下，将底物分解为较小的分子或化合物，进而合成新的产物。
酵母转化的具体过程包括底物的吸附、底物与酵母酶的结合、催化反应、产物的释放等。
其中，底物吸附与酵母酶的结合是酵母转化的第一步，在这一步中，底物需要与酵母酶发生亲和作用，才能进一步发生催化反应。
催化反应是酵母转化的核心步骤，酵母酶将底物分解为较小的分子或化合物，从而形成新的产物。
催化反应的速度受到多种因素的影响，如底物浓度、酵母酶浓度、反应温度、反应pH等。
在酵母转化的过程中，产物的释放同样是十分关键的一步。
产物必须及时地从酵母菌体中释放出来，以避免在酵母菌体内积累过多的产物，影响酵母菌体的生长和发育。
总之，酵母转化是一种复杂的生化过程，是酵母菌体内多种酶协同作用的结果。
了解酵母转化的原理，对于优化酵母发酵、提高发酵产物的质量和产量等方面具有重要的作用。
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酵母感受态细胞的制备及酵母转化
小 1.5ml 0.1μg 0.1μg 0.1mg 0.1ml 0.6ml 70μl
大 50ml 20-100μg 10-50μg 2-0.5mg 20mg 8ml 60ml 7.0ml
5S(14krpm)
5min (1000×g) 1.0ml1 为自激活 对照； pGADT7- T+pGBKT7-53 阳性对照；pGADT7-T+pGBKT7- lam 阴性对照。 为了检测每一个质粒的转化效率， 100μl 水稀释 1μl 转化子， 用 铺于 SD-Leu 和 SD-Trp 平板上；为了检测共转化效率，按不同比例（1:1000，1:100，1:10）稀释转化子，取 100μl 涂于 SD-Leu-Trp 平板上； 酵母培养基： YPD medium (1L) Dific peptone（可用 OXOID 公司的胰化蛋白胨）20g/L Yeast extract Agar（for plates only） 加蒸馏水 调 pH 6.5 高压灭菌，待冷却到 55℃左右，加 40％的葡萄糖 50ml 至终浓度 2％。 40％葡萄糖：40g 葡萄糖加 60ml 左右的蒸馏水溶解，然后定容至 100ml，过滤灭菌，4℃ 存放。注意，一定不能高压灭菌，因长时间高温会使葡萄糖变黑。 YPDA medium (1L) 在上面的 YPD 培养基中每升加 0.2% 的腺嘌呤半硫酸盐（adenine hemisulfate）15ml 至 终浓度 0.003%，高压灭菌。 0.2% adenine he misulfate： 0.2g 加 100ml 蒸馏水溶解即可。 注 ： 如果需要在 YPD(YPDA) 中 加抗生素 如 kanamycin， 在上面准备 的培养基 中加 50mg/ml 的 Km0.2-0.3ml 至终浓度 10-15mg/L SD medium (1L) 无氨基酸酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids, YNB） Dific 琼脂 10×DO 蒸馏水 浓度为 2％。 注：如果使用固体 DO，1L 中加 0.64g。 下面氨基酸成分是无缺陷 DO 中所需的所有氨基酸：
酵母转化常用培养基及程序
酵母实验操作方案一．质粒酶切及线性化1）用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2，可得到较纯的质粒10μg/3ml菌液，终体积80ul。
2）线性化质粒使用80μl酶切体系9KSF2质粒70μl内切酶（SacI，SalI，BglⅡ）2μl10 x buffer 8μl3）酶切3－16小时，一般3小时即可；二．乙醇回收酶切质粒1）2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAC（PH 5.2），混匀，沉淀DNA；2）－200C数个小时（>2小时），13,200rpm离心10～20分钟，吸弃上清；3）300ul 70％乙醇洗一次，13,200rpm离心10分钟，吸弃上清（注意离心管位置，从含有DNA的离心管另一侧吸取）；4）37℃烘干水分和残留乙醇；5）用20μl ddH2O重溶；6）1ul样品电泳检测DNA量，计算DNA总量；三．电转化1．准备感受态细胞1）5ml YPD 接种GS115单菌落，250rpm，300C，摇菌24 hours；2）100ml YPD，接种百分之一，同时留1ml空白YPD，300C ，250rpm，7～8hours，直到OD600＝1.3～1.5；3）菌液转入500ml离心管，JA14，1500g，40C离心5 min，弃上清；4）100ml冰水重悬，同上离心，弃上清；5）80～90ml冰水重悬【50ml】，同上离心，弃上清；6）20ml冰1M sorbitol 重悬【5ml】，然后转移到50ml 离心管中，同上离心，弃上清；7）约150μl 1M sorbitol重悬【250ul】，40C备用，剩下的感受态细胞可以保存在－700C冰箱大约3周。
2．转化1)100μl GS115感受态细胞加入＋20μl 线性化质粒，用枪打匀；2)冰浴5min，加入0.2cm转化杯中，轻轻将液体震到杯底，立即冰浴；3) 电转化，参数设定：电压1500V 电容25μF电阻200欧姆，放电时间4～5ms4)立即加650μl 冰1M sorbitol 入转化杯，打匀；5) 迅速涂板，250μl/块MD板，共3块；6) 涂好的板放在300C培养箱中培养4～5天，至菌落直径1mm即可。
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酵母转化（By HMM）
1.取50mL YPD液体培养基于100mL已灭菌的三角锥形瓶中，从中吸取1mL培养基于已灭菌的管，挑单克隆接种于1mL YPD培养基中，吹吸混匀（可再vortex继续混匀）后转移至50mL 的YPD液体培养基中，过夜培养约11h45min；
PS: 晚上21:15开始准备，21:30接种完毕开始摇菌。
（30℃ 250rpm）。
2.第二天早上9:15开始准备，取出1mL菌液用于测OD600，用1mL YPD培养基作为Blank. 9:30测完。
PS: a.要求OD600在至之间。
b.测完OD后打冰盒，将ssDNA置于冰上融化。
3.将菌液分装在2支50mL离心管（蓝色，无菌）中（锥形瓶留用），2500Xg常温离心5min.弃上清于之前的锥形瓶中，各用1mL灭菌ddH2O重悬转移至管中，共水洗两次，再各用1mL 灭菌ddH2O重悬后转移至同一个5mL无菌EP管中，吹吸混匀置于冰上。
PS：a.离心期间将灭菌水置于65℃烘箱中预热，将所需平板置于30℃培养箱中预热。
b.为避免菌液浓度差异，故将重悬后的菌液混匀，因重悬后体积大于2mL，因此转移至5mLEP管中，也可在2mL EP管中混匀后分装出一部分在一个管中。
4.待ssDNA溶化后根据所需量在无菌管中分装几管，各100uL（有助于煮沸后迅速冷却）。
PS: a. ssDNA要尽量多出一些，煮沸和转移过程中均有损失。
b.看ssDNA快融化时即可打开水浴锅，中频煮沸（800即可），煮沸ssDNA时用最低频120.
5.将ssDNA沸水浴5min, 然后迅速冰浴5min;
PS：a.重复沸水浴5min与冰浴5min可提高转化效率。
b.冰浴ssDNA时将50％PEG与1M LiOAc也置于冰上。
6.在超净台中配制mix，vortex混匀。
PS: 50 % PEG特别粘稠，在分装时容易损失，因此配制mix时要注意量要足够。
7.每支转化中分装300ul mix,100ul 酵母悬浮液。
PS:分装酵母悬浮液前要注意吹吸混匀。
8.加入plasmids，单转为; 双转为+. Vortex 1 min混匀。
9.42℃水浴45min.
10. 700Xg离心5 min，用枪头吸走上清，用% NaCl重悬菌液。
根据所需涂的平板个数确定重悬液的体积（可调整）。
1个平板：100uL重悬液：100uL涂板；
2个平板：150uL重悬液：75uL涂板；
3个平板：150uL重悬液：50uL涂板。
11.Parafilm膜封口，30℃培养3至4天。
PS：单转效率为：105. 培养基要稍厚一些，在实验台上冷却使其平板厚度均匀。