毕赤酵母化学转化
毕赤酵母感受态制作及转化
毕赤酵母感受态细胞制作1、GS115活化：100ml三角瓶中装入20ml YPD培养基，接种100ul菌保，过夜活化。
2、转接：500ml三角瓶中装入100ml YPD培养基，取1ml活化菌液接种到100ml YPD培养基中，培养至OD约为1.3-1.5。
3、收菌：将菌放置冰上15min，或者放于4°冰箱冷却。
一般100ml菌液可以制备4份感受态细胞。
将无菌水和过滤除菌的山梨醇（1M）提前置于4°冰箱冷却。
4、用100ml离心管收集菌体，4000rpm/min离心5min去除YPD培养基。
5、用20ml预冷的无菌水洗菌体，4000rpm/min离心5min，重复一次。
6、用20ml预冷的山梨醇洗菌体，4000rpm/min离心5min。
7、每个离心管中加入3ml预冷的山梨醇，重悬菌体。
7、将菌体分装至1.5ml灭菌离心管中，分装4管，4000rpm/min离心5min，弃上清。
8、每管加入80ul预冷山梨醇，重悬菌体，置于冰上待用或加入10%DMSO保存于-80冰箱。
毕赤酵母电击法转化1、将感受态细胞在冰上融化，电转杯和山梨醇在冰上预冷。
2、将80ul感受态细胞与5-10ug线性化质粒混合，转移至0.2cm电转杯中，置于冰上5min。
3、根据电转仪选择合适的程序，进行电击。
4、电击后立即加入500ul预冷的山梨醇，将电击杯中液体全部转移至无菌的1.5ml离心管中，30℃水浴2h。
5、将菌体低转速离心5min，吸出多余上清，留100ul涂板即可。
6、将菌液均匀涂布于His缺陷型培养基，30℃培养1-2天。
要准备灭菌的有：水，1M山梨醇，滤器，大离心管，1.5ml离心管，大小枪头，所有的离心都是低温离心。
[VIP专享]毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选
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毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备：1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250-300r/min 培养过夜；2. 取100-500µl （≤1:100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜(约20h)，至OD600 达到1.3~1.5；3. 将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min，用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4. 按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬5. 按步骤3 离心，用2-5ml，1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6. 按步骤3 离心，用160µl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul；备注：可将其分装为80 µl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。
比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。
对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。
一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。
✓KM71比GS115生长的要慢。
毕赤酵母都应该是白色菌落的✓对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性?菌种保存：挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1:1加入30%灭菌甘油， -80o C ul/管冻存（一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O重溶。
转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。
建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。
乙醇沉淀主要步骤如下：1）酶切体系（80ul）中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC，混匀2)-20℃ 20分钟沉淀3)13200rpm，20min，离心后弃上清4)75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清5)37 度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。
毕赤酵母表达经验总结
毕赤酵母表达经验总结甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。
虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。
不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。
其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。
甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。
+++=4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。
=+5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低+++++ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。
毕赤酵母表达蛋白步骤
毕赤酵母表达蛋白步骤一、引言毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种常用的真菌表达系统，被广泛应用于蛋白质的表达和生物技术研究中。
其优势包括高表达水平、易于培养和操作、能够正确折叠复杂蛋白等。
本文将介绍毕赤酵母表达蛋白的步骤。
二、构建表达载体毕赤酵母表达系统的关键是表达载体的构建。
首先，需要选择适合的表达载体，常用的有pPIC6、pPICZα等。
然后，在载体上选择合适的启动子和信号序列，以确保蛋白质能够被正确表达和分泌。
同时，还需要在表达载体上加入选择标记，如His标签、FLAG标签等，以便后续的蛋白质纯化和检测。
三、转化毕赤酵母将构建好的表达载体转化入毕赤酵母中，使其成为表达宿主。
转化方法包括电击转化、化学转化等。
其中，电击转化是常用的方法，通过电击脉冲使毕赤酵母细胞膜发生破裂，使表达载体进入细胞内。
转化后，将细胞培养在选择性培养基上，筛选出带有表达载体的毕赤酵母克隆。
四、表达蛋白经过转化筛选后，得到含有目标蛋白表达载体的毕赤酵母克隆。
接下来，需要将克隆进行培养，在适当的条件下诱导蛋白的表达。
常用的诱导剂包括甲醇、巯基乙醇等，通过加入适量的诱导剂，可以使目标蛋白得到高效表达。
五、蛋白纯化在蛋白表达后，需要进行蛋白纯化，以获得纯度较高的目标蛋白。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
在选择纯化方法时，需要根据目标蛋白的性质和需求进行合理选择。
同时，可以利用加入的选择标记，如His标签，通过亲和层析纯化进行快速高效的纯化。
六、蛋白鉴定和功能分析蛋白纯化后，需要进行蛋白的鉴定和功能分析。
常用的鉴定方法包括SDS-PAGE、Western blot等，可以确定蛋白的分子量和纯度。
功能分析则可以通过生物学实验来进行，如酶活测定、结合实验等，以验证目标蛋白的功能。
七、应用和展望毕赤酵母表达系统在生物技术和蛋白质研究领域有着广泛的应用。
通过该系统，可以高效表达各种蛋白，包括抗体、酶和重组蛋白等。
毕赤酵母转化方法
毕赤酵母转化方法
实验概要
本实验介绍了毕赤酵母电转化方法。
该方法无需产生去壁细胞，是产生毕赤酵母重组子的简便方法。
与去壁细胞效率相似。
实验步骤
1. 细胞准备：
1) 在含5mlYPD 的50ml 离心管中，培养毕赤酵母，30 度过夜。
2) 取0.1-0.5ml 过夜培养物，接种含500ml 新鲜培养基的2L 摇瓶，过夜生长至OD600＝1.3-1.5。
3) 在4 度，1500g离心5min收集细胞，用500ml预冷的灭菌水悬浮细胞。
4) 如上离心，用250 ml预冷的灭菌水悬浮细胞。
5) 如上离心，用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞。
6) 如上离心，用1 ml 预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml。
注意：可冻存80ul 等量的电感受态细胞，但转化效率会下降很多。
2. 转化：
1) 取80ul上述细胞与5-20ug线性化DNA(溶于5-10ulTE)混合，转入预冷的0.2cm 电转杯中。
2) 在冰上放置5min。
3) 根据所使用装置推荐的酿酒酵母参数进行电击。
4) 立即加入1ml 预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中。
5) 分成200-600ul等份，涂于MD 或RDB平板上。
6) 在30 度孵育平板至克隆产生，筛选Mut /Muts表型。
毕赤酵母转化方案
毕赤酵母转化方案引言毕赤酵母（Baker’s Yeast）是一种常见的酵母菌，广泛用于食品加工和发酵过程中。
毕赤酵母可以将碳源转化为二氧化碳和乙醇，从而实现食品发酵和面团膨胀。
本文将介绍毕赤酵母的转化方案，包括酵母培养、酵母转化条件以及转化效果的评价。
酵母培养在进行毕赤酵母的转化实验之前，首先需要进行酵母的培养。
以下是酵母培养的步骤：1.将酵母菌存活液取出适量转移到含有酵母培养基的培养皿中。
2.用无菌棉签在培养皿上划线，以便观察酵母生长情况。
3.将培养皿封闭并置于恒温摇床中，在适当的温度下培养酵母。
酵母转化条件酵母的转化条件对于转化效果具有重要影响。
以下是常见的酵母转化条件：温度酵母转化的温度是一个重要的参数，常用的温度范围为25-40摄氏度。
不同温度下酵母的代谢和生长速率不同，因此选择合适的转化温度可以提高转化效率。
pH值pH值是影响酵母生长和代谢的另一个重要参数。
酵母转化的pH范围通常为4-7，在这个范围内酵母的生长和代谢能力较强。
溶氧量溶氧量是影响酵母转化效果的另一个因素。
较高的溶氧量可以促进酵母的生长和代谢，提高转化效率。
因此，在实验过程中应保证适当的氧气供应，通过搅拌或通气的方式提高溶氧量。
传质条件传质条件（如搅拌速度、传质面积等）也会对酵母转化效果产生影响。
适当的搅拌可以保证培养液中养分的均匀分布，提高转化效率。
同时，增加传质面积（如使用气泡或转子发酵罐）可以增加酵母与培养基之间的接触面积，促进转化反应进行。
转化效果评价转化效果通常通过酵母的生长情况、代谢产物的生成以及发酵过程的监测来进行评价。
1.酵母的生长情况可以通过观察培养液中的酵母颗粒的数量和大小以及液体的浑浊度来判断。
较好的转化效果应该能够促使酵母迅速生长和繁殖。
2.代谢产物的生成是评价转化效果的重要指标之一。
对于毕赤酵母来说，主要的代谢产物是二氧化碳和乙醇。
可以通过气体检测仪或化学分析方法来测定其生成量，以评估转化的效果。
毕赤酵母LiCl 转化方法
实验概要本文介绍了毕赤酵母LiCl 转化方法。
该程序是电转化的替代方法。
转化效率为102-103cfu/ug线性化DNA。
实验原理主要试剂溶液准备：不能用醋酸锂，一定要用氯化锂1. 用无菌去离子蒸馏水配制1M LiCl，过滤除菌，用无菌水稀释2. 用无菌去离子蒸馏水配制50%PEG(3350)，过滤除菌，存于盖紧的瓶中3. 用TE(10mM Tris-HCl pH8.0，1.0mM EDTA)溶解2mg/ml 变性断裂鲑鱼精DNA，存于-20度主要设备实验材料实验步骤1. 细胞准备：1) 在50mlYPD 中培养毕赤酵母至OD600＝0.8-1.0(约108个/ml)。
2) 收集细胞，用25ml灭菌水洗涤，室温1500g离心10min。
3) 去除水，用1ml 100mM LiCl 重悬细胞。
4) 将细胞悬液转至1.5ml 离心管中。
5) 最大转速沉淀细胞15s，用吸头吸去LiCl。
6) 在400ul 100mM LiCl中悬浮细胞。
7) 将50ul细胞悬浮液移到1.5ml离心管中，每次用一管，现做现用，不要置于冰上或-20度保存。
2. 转化：1) 煮沸单链DNA 5min，快速放于冰水中使变冷，后置于冰上。
注意：载体DNA不需要在每次用之前都煮，在-20 度保存等份少量样品，每次解冻一管，用3-4 次后再煮。
2) 取上面第7步中细胞，离心去除LiCl。
3) 每个转化样品，按顺序加入下列试剂，PEG 可保护细胞免受高浓度LiCl的有害作用240ul 50%PEG，36ul 1M LiCl，25ul 2mg/ml 单链DNA，溶解于50ul灭菌水中的质粒DNA(5-10ug)。
4) 剧烈涡旋细胞沉淀至完全混匀(1min)。
5) 在30 度孵育30min(不要摇动)。
6) 在42 度水浴热击20-25min。
7) 6000-8000rpm离心，将转化溶液转移走。
8) 用1ml 灭菌水重悬细胞沉淀。
酵母感受态的制备(化学法)
1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene gl ycol缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0. 5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulD MSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。
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（化学转化）
如果没有电转仪，LiCl转化是一种可供选择的方法，转化率是102到103cfu/ug。
主要过程为：
取过夜活化培养的菌液按1：1000接种于15ml新鲜的YPD液体培养基，30℃培养至OD600达到0.8-1.0；4℃，4500rpm离心5分钟，用8ml冰预冷的无菌水洗涤菌体，倾除洗涤液，用1mL ，4℃，4500rpm离心5分钟，沉淀用50μl冰预冷的100mmol/L LiCl悬浮，最后定容至80-90ml。
LiCl转化取适量单链鲑精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上备用，取上述制备好的感受态细胞12
000rpm，离心15s，吸弃LiCl溶液，按顺序依次加入
50%PEG 240ml
1mmol/L LiCl 36 ml
单链鲑精DNA 25ml
线性化质粒DNA 10 ml (约10mg)
用吸头反复吹打，使细胞沉淀与加入的溶液混匀，30℃静置温育30min，42℃热击20-25min，4500rpm离心10min，吸弃转化液，细胞沉淀加1ml
YPD培养基于30℃200 rpm培养2-4hr，取转化混合液100ml涂布含100µg/mL ZeocinTM
的YPDS平板，30℃培养2-3天。
LiCl 转化方法
作为电转化的替代方法，在线性化DNA条件下，转化效率介于102~103cfu/ug 之间
溶液：
1M LiCl 用无离子水溶解，过滤除菌。
（稀释使用无菌水。
）
50% PEG 3350 无离子水溶解，过滤除菌，密封保存
2mg/ml变性的鲑精DNA片段（10mM Tris-HCl，pH 8.0,10mM EDTA）-20℃保存。
准备感受态细胞：
1.在50ml YPD中，培养至OD600 在0.8~1.0之间（大约108个/ml）。
2.收集细胞，用25ml无菌水洗涤，1500g室温离心10min。
3.重悬细胞于1ml 体积的100mMLiCl中，将悬液转移至1.5ml离心管中。
4.使用最大转速离心15s，吸去LiCl上清。
5.重悬细胞于400ul体积的100mMLiCl中。
6.每个转化组取50ul细胞悬液置于1.5ml离心管中，立即使用。
勿要存于冰上或冻存于
-20℃。
转化：
1.取1ml单链DNA鲑鱼精标准煮沸5min，后快速于冰上降温并存于冰上。
注意：不需要
也不推荐在每次使用前煮沸载体DNA。
分装冻存于-20℃，并且每使用3-4次后再次煮沸更加适宜。
2.离心上面步骤6的细胞，吸去残留的LiCl。
3.每次转化都要向细胞中顺次加入下列试剂。
PEG可以保护细胞不会因高浓度的LiCl而受
到损伤。
I.240 ul50% PEG 3350
II.36 ul 1M LiCl
III.25 ul 2mg/ml 单链鲑鱼精DNA
IV.质粒DNA（5~10ul）溶于50ul无菌水中。
4.涡旋各管，直到细胞混合均匀（约1min）。
5.将离心管在30℃静置孵育30min。
6.42℃水浴热激20~25分钟。
7.细胞6000-8000rpm离心.
8.重悬于1ml YPD培养基中，30℃静置孵育、
9.1~4小时后，涂于含有合适Zeocin浓度（100ug/ml~ 1000ug/ml）的平板上，30℃培养
2~3天。
聚乙二醇法（PEG1000）
试剂：
1.BufferA：1M 山梨醇，10mM N-二(羟乙基)甘氨酸（pH8.35），3% 乙二醇（100ml）
2.BufferB：40%PEG 1000，0.2M N-二(羟乙基)甘氨酸（pH8.35）50ml
3.BufferC：0.15M NaCl，10mM N-二(羟乙基)甘氨酸（pH8.35）。
过滤除菌，存于-20℃。
4.DMSO，-70℃保存。
5.YND平板：0.67%YNB，2% 葡萄糖，2%琼脂（0.5L或25个平板）。
方法：Klebe et al. (9)
1.制备感受态细胞
1从平板上挑取新鲜的毕赤酵母单菌落，接种至10ml YPD中摇床培养过夜。
2将过夜培养的菌种再次接种至100ml YPD培养基中，接种时的OD600=0.1，培养至达到0.5~0.8。
3 收集培养液，室温2000g离心后用50ml Buffer A洗一次。
4 重悬细胞于4ml Buffer A中，分装至1.5ml离心管中，每管0.2ml。
每管加入11ul DMSO，
混合，后快速冰冻于液氮中。
5 将感受态储存于-70℃。
2.转化
1 将总量50ug的DNA（总体积不超过20ul）直接加入冰冻的感受态细胞中。
包括转运
DNA（40ug 变性的鲑鱼精DNA）以及小于1ug的样品DNA，以增加转化效率。
2 样品37℃水浴5min，其间轻柔混合一到两次。
3 水浴结束后向每管中加入1.5 Buffer B。
彻底混合
4 30℃水浴1h
5 2000g室温离心10min，用1.5ml Buffer C轻柔重悬
6 再次离心，轻柔重悬细胞于0.2ml Buffer C中
7 将每管涂布于筛选平板上，培养3~4天。