酵母转化
酵母细胞转化
1. 挑取INVScI单菌落于5 mL YPAD培养基的试管中，30℃振荡（约250 rpm)培养过夜，OD600为1-2，取2 mL转入30 mL YPAD的50 mL的三角瓶中，30℃振荡（约250 rpm）孵育直至OD600为0.6（注：高培养密度会导致转化率下降）。
2. 4℃下1500×g离心10 min收集细胞。
3. 用1×TE Buffer ( pH 7.4) 冲洗细胞一次。
4. 用含200 mMLiAc 10-15 mL 的1×TE Buffer 9（无菌）重悬细胞，室温下放置10分钟。
5. 2500g离心收集细胞弃上清。
6. 用含200 mMLiAc的0.5 mL 1×TE Buffer(无菌)重悬细胞，用于转化。
7. 每次转化用上述制备好的感受态细胞溶液100μL。
8. 在含有100μL感受态细胞的离心管中，加入1μg待转化质粒DNA和100μg变性鲑鱼精DNA(salmon sperm DNA)。
9. 加入700μL的1XLiAc/40% PEG-3350/1XTE，彻底混匀。
10. 30℃孵育溶液30 min。
11. 加入88μL的二甲基DMSO，混匀，42℃热激7 min。
12. 高速离心10s，收集细胞。
13. 1mM 1× TE重新悬浮，再次离心，去除上清。
14. 重新加入50-100μL1×TE，混匀，均匀涂抹在筛选平板上。
15. 30℃生长2-3d，观察结果。
解脂耶氏酵母转化过程
-80℃冰箱取出保存的polh菌株，在YPD平板上划线，28℃培养约24小时长出单菌落，挑单菌落到YPD液体培养基（500ml三角瓶，50ml培养基），摇瓶培养约16小时，此时OD600=0.8左右，取其中1ml转接到另一瓶YPD液体培养基中，摇瓶培养5小时左右OD600约0.8，准备做感受态，并转化。
1.离心收集菌体，用ph7.5的TE（改为10ml无菌水）重悬菌体，取1ml到EP管中，10000rpm离心1min，去上清；
2.加600μl 醋酸锂（0.1M pH 6.0）
3.在28℃水浴锅中保温1h；
4.3000rpm离心2min，弃上清；
5.加40μl醋酸锂轻轻悬浮细胞；（轻轻悬浮）
6.40μl的感受态细胞，加2μl ssDNA（重新处理）和3μl转化用的DNA；（轻轻混匀）
7.在28℃水浴锅中保温15min，然后加350μl PEG4000－醋酸锂溶液和16μl DTT;（轻轻混匀）
8. 在28℃水浴锅中保温1h,再加40μlDMSO,39℃热激10min；
加一步：4000rpm,5min离心收集菌体
9.加200μl醋酸锂重悬，再涂在5（2块平板）块选择平板上（120μl（100μl）/平板）
我每次平行做5管，共涂10块平板。
MD平板要倒稍微厚点儿，不要太薄;涂平板时，平板要干。
酵母转化(陈晗俊)..
酵母转化(一)原理：我们采用的是PEG/ LiAc法转化酵母。
PEG是一种高分子聚合物,只有分子量达到3000 左右的PEG才会发挥最大的转化促进作用。
本文使用的PEG分子量为3350 ,实验结果表明促转化效果可以达到103～105cfu/μg 。
PEG在酵母转化中起到在高浓度醋酸锂环境中保护细胞膜,减少醋酸锂对细胞膜结构的过渡损伤,同时促进质粒与细胞膜接触更紧密。
PEG的浓度是务必适宜,这一点很重要。
LiAc可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态,此时它们能够摄取外源性DNA 。
鲑鱼精担体DNA 为短的线形单链DNA ,在转化实验中主要是保护质粒免于被DNA 酶降解;另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA 中发挥协助作用。
在每次使用前务必进行热变性,使可能结合的双链DNA 打开,保证鲑鱼精担体DNA在转化实验体系中以单链形式存在(二)材料、仪器设备及试剂：1.SD 培养基：●YNB： 1.6 g/L●硫酸铵：5g/L●氨基酸：根据质粒的筛选压力选择性添加●调节pH=5.8，121°灭菌15min2.YPDA培养基●胰蛋白胨20g/L●酵母浸膏10g/L●琼脂20g/L(固体)●腺嘌呤15ml 0.2% 腺嘌呤/ L●调节pH =7.5，121°灭菌15min3.0.9%NaCl（w/v）●NaCl: 0.9g●milipore水定容到100ml●灭菌121°，20min4.100%DMSO从试剂瓶中分装到ep管中，500ul每管，室温保存5.10×TE（pH=7.5）：（0.1M Tris-HCl，10mM EDTA）●Tris-HCl 1.211g/100ml●EDTA 0.37g/100ml●调节pH=7.5, 121°，20min6.10×LiAc（pH=7.5）●1M LiAc 10.202g/100ml●用醋酸调节pH=7.5，121°灭菌20min7. 1.1×TE/LiAc●Tris-HCl 11ml 10×LiAc（pH=7.5）/100ml●EDTA 11ml 10×EDTA （pH=7.5）/100ml●调节pH=7.5, 121°，20min8.50% PEG3350：●PEG3350：50g●已灭菌的milipore水：定容到100m●（可用50°水浴助溶，PEG易吸水，不可灭菌）9.PEG/LiAc：现配现用，在超净台中操作，吸取母液到ep管或50ml离心管中终浓度10mlPEG3350 40% 8ml 50%PEG3350TE buffer 1×1ml 10×TELiAc 1×1ml 10×LiAc10.变性的鲑鱼精DNA(10mg/ml)ipore水，70%酒精棉球，50ml离心管4个，ep管一盒，15ml试管架，50ml试管架，ep管架(三)具体方法：◆A：酵母感受态制备1.从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA平板上划单克隆，30°培养3天左右。
试验总结的几种高效酿酒酵母转化方法
电转法设计方案一:感受态制备：1 .挑一环酵母菌接种于5mLYEPD培养基中，30C、250-300rpm培养过夜；2 .取1mL一级种子分别接种于两瓶50mLYEPD培养基中，30C、250-300rpm培养约16-18h（OD:1.3-1.5）;3 .于4c离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水重悬，可换成较小的离心管；4 .加入1ml,pH7.5,10灯E缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml10*iAc,旋转摇匀，于30度轻轻摇动45min；5 .再加入0.4ml1mol/LDTT,并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min；6 .于4c离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤；7 .2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）；8 .每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70C冰箱保存。
电转化：1 .向感受态细胞中加入约5〜10ug（体积小于10ul）的DNA,用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；2 .擦干电转杯，电击，电击参数：1.5KV,25uF,200欧姆；3 .立即加入1ml预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30c静置1h;4 .离心，弃上清，加入1mLYEPD后，于30C、200rpm培养2h;5 .离心得菌体后，吸除550ul上清液，然后按150ul版进行涂板。
说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。
设计方案二：感受态制备：1 .挑一环酵母菌接种于5mLYEPD培养基中，30C、250-300rpm培养过夜；2 .取1mL一级种子分别接种于两瓶50mLYEPD培养基中，30C、250-300rpm培养约16-18h（OD:1.3-1.5）;3 .于4C,5000rpm,5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬于8ml处理液中（处理液配方：100mMLiAc,10mMDTT,0.6M山梨醇，10mMTris-HCl,pH7.5）,室温静置30min;4 .4C,5000rpm,5min离心收集菌体，用1.5mL1mol/L预冷的山梨醇洗涤三次，离心条件一样；5 .每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山梨醇），最后以80ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70C冰箱保存。
酵母转化手册(译自Yeastmaker
质粒 DNA（浓度、纯度高） 变性的**Yeastmaker 宿主 DNA (10 µg/µl)
Small‐Scale （1.5 ml tube） 100 ng 5 µl
Library‐Scale （15 ml tube） 5–15 µg* 20µl
（* For example, use 5 µg of bait + 10 µg of prey for yeast two‐hybrid library cotransformation. ）
50 µl 500 µl 30 min
600 µl 2.5 ml 45 min
6. 加入 DMSO，轻柔混匀
20 µl
160 µl
7. 在 42℃水浴锅中温浴
（注意：期间 Small‐Scale 每隔 5 min，Library‐Scale 每隔 10 min，轻轻倒混几次）
15 min
20 min
本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需 word 版本请发送站内信。
B． 方法：转化酵母感受态细胞 1. 材料 Yeastmaker Yeast Transformation System 2 酵母感受态细胞(Section 6.A) PEG/LiAc (Section 4) 0.9% (w/v) NaCl DMSO 2. 将下列组分加入到已经预冷的无菌离心管中，混合均匀。
酵母转化的原理
酵母转化的原理
酵母转化指的是酵母菌体内发生的一系列生化反应，将底物转化为产物的过程。
其原理是酵母菌体内的酶作用下，将底物分解为较小的分子或化合物，进而合成新的产物。
酵母转化的具体过程包括底物的吸附、底物与酵母酶的结合、催化反应、产物的释放等。
其中，底物吸附与酵母酶的结合是酵母转化的第一步，在这一步中，底物需要与酵母酶发生亲和作用，才能进一步发生催化反应。
催化反应是酵母转化的核心步骤，酵母酶将底物分解为较小的分子或化合物，从而形成新的产物。
催化反应的速度受到多种因素的影响，如底物浓度、酵母酶浓度、反应温度、反应pH等。
在酵母转化的过程中，产物的释放同样是十分关键的一步。
产物必须及时地从酵母菌体中释放出来，以避免在酵母菌体内积累过多的产物，影响酵母菌体的生长和发育。
总之，酵母转化是一种复杂的生化过程，是酵母菌体内多种酶协同作用的结果。
了解酵母转化的原理，对于优化酵母发酵、提高发酵产物的质量和产量等方面具有重要的作用。
- 1 -。
酵母电转化
在精编分子生物学实验指南上有一部分讲到了酿酒酵母，电转化具体过程如下：1）将转化用酵母菌株的单菌落接种于5ml YPD培养基中，30度过夜培养至饱和。
2）转化前一天晚上，在装有500ml YPD培养基的2L无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液，于30度剧烈振摇，直到细胞密度达1*10的8次方（OD600约为1.3-1.5）。
3）于4度4000g离心收获培养细胞，细胞用80ml无菌水重悬。
为了增加细胞对电击的感受性，继续步骤4。
如果不需要可接步骤64）加入10ml，pH7.5，10*TE缓冲液，摇晃均匀，再加入10ml10*乙酸锂，旋转摇匀，于30度请请摇动45min5）加入2.5ml 1 mol/L DTT,并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min6）将酵母菌悬液稀释在500ml水中，洗涤3次，每次以4000-6000g于4度离心沉淀细胞，依次重悬细胞，所用的溶液如下：第一次沉淀：250ml冰冷的水第二次沉淀：20-30ml冰冷的1mol/L山梨醇第三次沉淀：0.5ml冰冷的1mol/L山梨醇最终的OD600应为约2007）电转化：在无菌冰冷的微量离心管中加入40ul 酵母菌细胞和小于等于100ng 待转化的DNA（体积小于5ul），混匀。
转移至冰冷的电转槽中，接下来按照你的电穿孔仪的说明操作就可以啦。
8）往电击槽中加入1ml冰冷的1mol/L山梨醇，轻轻吹吸混匀9）直接涂布在山梨醇选择培养基平板上，于30度培养3-6天，直到平板上出现菌落。
步骤7-8可能会因电转仪的不同而有所不同。
其实用乙酸锂法也很方便的。
在一本酵母操作的实验手册上还看到了一个lazy-bones的转化实验方法，按照它做下来也得到了菌落。
酵母感受态细胞的制备及酵母转化
小 1.5ml 0.1μg 0.1μg 0.1mg 0.1ml 0.6ml 70μl
大 50ml 20-100μg 10-50μg 2-0.5mg 20mg 8ml 60ml 7.0ml
5S(14krpm)
5min (1000×g) 1.0ml1 为自激活 对照； pGADT7- T+pGBKT7-53 阳性对照；pGADT7-T+pGBKT7- lam 阴性对照。 为了检测每一个质粒的转化效率， 100μl 水稀释 1μl 转化子， 用 铺于 SD-Leu 和 SD-Trp 平板上；为了检测共转化效率，按不同比例（1:1000，1:100，1:10）稀释转化子，取 100μl 涂于 SD-Leu-Trp 平板上； 酵母培养基： YPD medium (1L) Dific peptone（可用 OXOID 公司的胰化蛋白胨）20g/L Yeast extract Agar（for plates only） 加蒸馏水 调 pH 6.5 高压灭菌，待冷却到 55℃左右，加 40％的葡萄糖 50ml 至终浓度 2％。 40％葡萄糖：40g 葡萄糖加 60ml 左右的蒸馏水溶解，然后定容至 100ml，过滤灭菌，4℃ 存放。注意，一定不能高压灭菌，因长时间高温会使葡萄糖变黑。 YPDA medium (1L) 在上面的 YPD 培养基中每升加 0.2% 的腺嘌呤半硫酸盐（adenine hemisulfate）15ml 至 终浓度 0.003%，高压灭菌。 0.2% adenine he misulfate： 0.2g 加 100ml 蒸馏水溶解即可。 注 ： 如果需要在 YPD(YPDA) 中 加抗生素 如 kanamycin， 在上面准备 的培养基 中加 50mg/ml 的 Km0.2-0.3ml 至终浓度 10-15mg/L SD medium (1L) 无氨基酸酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids, YNB） Dific 琼脂 10×DO 蒸馏水 浓度为 2％。 注：如果使用固体 DO，1L 中加 0.64g。 下面氨基酸成分是无缺陷 DO 中所需的所有氨基酸：
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酵母转化方法步骤
1.YPD固体培养基
Yeast Extract：10 g；Peptone：20 g；葡萄糖：20 g；Agar：20 g
2.1M LiAc
LiAc：10.2 g；加水到100 ml
高压蒸汽灭菌，4℃保存。
100 mM的LiAc只需将1M LiAc稀释10倍即可。
3.50% PEG3350（50% W/V）
4.鲑鱼精DNA（2 mg/ml）
i.鲑鱼精DNA：2 mg；加TE缓冲液至10 ml
ii.振荡溶解后用注射器剧烈抽吸30-40次，沸水浴20分钟后马上置于冰上降温，分装100 μl到1.5ml离心管中-80℃保存。
5.SD-Trp培养基（1L, pH
6.8）
无氨基氮源（含硫胺酸）：6.7g；葡萄糖：20g；-Trp DO supplement：0.74g。
调节pH，121℃高压灭菌20分钟。
酵母热激转化
1.将酵母XK1-35在YPD固体培养基划线活化，3-4天菌落长到直径大约2-3 mm
待用（菌落平板可放在4℃冰箱保存2至3周）。
2.将单菌落挑到含有50 ml YPD的100 ml三角瓶中，30℃, 220 rpm摇12 h。
3.用分光光度计测量OD值到1.0（即5×107个/ml）,吸取5ml培养液加入到含有
45 ml YPD的100 ml三角瓶中，终浓度约为5×106个/ml。
4.置于30℃摇床中，200rpm摇至OD值为0.4-0.6（即2-3×107个/ml），约用时3小
时（2.5小时测一次OD值防止浓度摇过）。
5.将OD值为0.4-0.6的培养物转移到预冷的50ml的离心管中，置于冰上冷却15
分钟，3000g离心5分钟。
后面用到的试剂和仪器都要预冷，所有操作都要在冰上或者4℃。
6.倒掉上清液，加入30 ml预冷的无菌水并将酵母悬浮，同上步离心。
7.倒掉上清液，将酵母悬浮于1 ml 100 mM的LiAc中并转移到一个预冷2 ml无
菌离心管中。
8.高速离心15秒，吸出多余的LiAc。
9.悬浮细胞到终体积500 μl（约2×109个/ml），其中大约需加入400 μl 100mM的
LiAc。
可加DMSO到中浓度7%分装50μl后置于-80℃保存，但转化效率会降低。
10.将分装的50 μl酵母感受态细胞，15秒高速离心后将多于LiAc吸出。
11.按照下列顺序小心加入“转化混合液”：
i.240 μl50%PEG
ii.36 μl1M LiAc
iii.25 μl鲑鱼精DNA（2mg/ml）
iv.酶切载体和插入片段各0.5-1ug（摩尔数比值为，载体：插入片段=1：3-5）。
注意50%的PEG必须第一个加入已防止高浓度LiAc对酵母细胞的伤害，鲑鱼精DNA起担体DNA的作用可以促进载体和插入片段进入酵母感受态细胞。
12.剧烈涡旋每个反应管直到完全混匀，通常要1到2分钟。
13.置于30℃水浴，保温30分钟。
14.转移到42℃水浴中，热激20-40分钟。
15.8000 rpm离心15秒，除去转化混合液。
16.吸取600 μl无菌水到每个反应管中，用枪吹打悬浮。
17.吸取200 μl转化液涂选择性平板，此处用SD-trp平板，大约2到3天后长出转
化子。