酵母感受态的制备(化学法)
毕赤酵母感受态制作及转化
毕赤酵母感受态细胞制作1、GS115活化：100ml三角瓶中装入20ml YPD培养基，接种100ul菌保，过夜活化。
2、转接：500ml三角瓶中装入100ml YPD培养基，取1ml活化菌液接种到100ml YPD培养基中，培养至OD约为1.3-1.5。
3、收菌：将菌放置冰上15min，或者放于4°冰箱冷却。
一般100ml菌液可以制备4份感受态细胞。
将无菌水和过滤除菌的山梨醇（1M）提前置于4°冰箱冷却。
4、用100ml离心管收集菌体，4000rpm/min离心5min去除YPD培养基。
5、用20ml预冷的无菌水洗菌体，4000rpm/min离心5min，重复一次。
6、用20ml预冷的山梨醇洗菌体，4000rpm/min离心5min。
7、每个离心管中加入3ml预冷的山梨醇，重悬菌体。
7、将菌体分装至1.5ml灭菌离心管中，分装4管，4000rpm/min离心5min，弃上清。
8、每管加入80ul预冷山梨醇，重悬菌体，置于冰上待用或加入10%DMSO保存于-80冰箱。
毕赤酵母电击法转化1、将感受态细胞在冰上融化，电转杯和山梨醇在冰上预冷。
2、将80ul感受态细胞与5-10ug线性化质粒混合，转移至0.2cm电转杯中，置于冰上5min。
3、根据电转仪选择合适的程序，进行电击。
4、电击后立即加入500ul预冷的山梨醇，将电击杯中液体全部转移至无菌的1.5ml离心管中，30℃水浴2h。
5、将菌体低转速离心5min，吸出多余上清，留100ul涂板即可。
6、将菌液均匀涂布于His缺陷型培养基，30℃培养1-2天。
要准备灭菌的有：水，1M山梨醇，滤器，大离心管，1.5ml离心管，大小枪头，所有的离心都是低温离心。
酵母感受态细胞的制备
酵母感受态细胞的制备以下是酵母感受态细胞的制备流程：一、基因突变1. 细胞外DNA转化：将基因要进行突变的DNA提取出来，放到细胞外，同时加入一定量的外源DNA去促进转基因的完成；2. 高效增幅：将一定的量外源DNA通过吞噬电穿孔的方法把外源DNA效率的转入细胞内，从而加快基因突变。
二、诱导表达和突变检测1. 选择表达载体：根据要转入突变要表达的基因，选择匹配的表达载体；2. 诱导表达：通过加入不同的诱导因子或者培养条件来促使载体的表达；3. 突变检测：通过筛选、测序和碱基错配检测等方法来检测是否发生了突变。
三、表达筛选1. 抗药基因筛选：对突变的酵母细胞，加入不同程度的抗药性因子，筛选出能够生存的突变细胞；2. 免疫细胞筛选：检验突变后的酵母细胞中能够产生免疫识别和反应细胞因子的存在，因为普遍认为有可能产生免疫细胞的能力。
四、选择迁移1. 抗药性筛选：对抗药性筛选出的突变酵母细胞进行对比，以确定是否能够开花；2. 免疫细胞筛选：通过检测免疫细胞因子的存在，筛选出产生免疫细胞的能力最强的突变细胞，并将其迁移至感受细胞中保存。
五、酵母感受态细胞的制备收尾1. 养殖酵母细胞：选择最佳突变细胞，把其分段离心至细胞密度稀释到一定水平；2. 生长管理：按照不同的培养环境加以调节，保证其正常的增殖和生长；3. 继代培养：当突变酵母细胞进行繁殖增殖后，可以进行继代繁殖，以不断增加细胞数量；4. 收尾清理：当满足实验要求时，对细胞进行收尾，进行清洗和分装，并保存细胞，以便后续使用。
总结：酵母感受态细胞的制备，主要分为基因突变、诱导表达和突变检测、表达筛选、选择迁移、酵母感受态细胞的制备收尾等步骤。
通过这些步骤，可以有效的制备可用于实验的突变的酵母感受态细胞，从而为对基因的研究和开发提供了非常有价值的材料。
酵母感受态制备流程
酵母感受态制备流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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酵母过程自己总结
一．准备过程(定容均用ddH2O)1，葡萄糖溶液用于给培养基提供碳源40%葡萄糖配100ml，即40g葡萄糖定容于100mlddH2O中。
1L培养基需要50ml葡萄糖溶液（葡萄糖溶液灭菌：115度，15分）2，10*LiAc溶液终浓度为1M用乙酸调PH7.5定容后高压灭菌3.10*TE溶液Tris 终浓度0.1M(Hcl调PH7.5)EDTA-Na 终浓度 0.01M二者混合定容后高压灭菌4.Trp—Leu终浓度8g/L（NaOH调PH6.0-6.5）加入Agar（20g/L）灭菌后倒板前加入灭好的55度预热的葡萄糖溶液5.Tre-Leu-His-Ura+3AT与4步骤相同，另3AT终浓度为25Mm6.x-gal solution溶液（注意现用现配）溶液包括 Z buffer 10ml10mg x-gal 溶于100ulDMF （避光）60ulẞ-巯基乙醇其中Z buffer(100ml装)包括Na2HPO4·12H2O 2.147g NaH2PO4·2H2O 0.591g MgSO4·7H2O 0.0246g Kcl 0.075g7.YPAD培养基1LYest extract 10gPeptone 20gDextrose 20gA 100mgAgar 20g(Hcl调PH6.0)二．酵母感受态的制备(MAV203)1.划板挑菌摇菌，30度，16-18小时后扩摇3-5小时，OD值=0.42.室温离心，5分钟，3000g，去上清3，加入一半量得灭菌水，重悬沉淀，再次离心，条件同上4.再用一半量的1*TE/LiAC,重悬沉淀，离心，条件同上5.后再用少量1*TE/LiAC,重悬沉淀，每管分装40-50ul后待转化另25ml1*TE/LiAC包括2.5ml10*TE2.5ml10*LiAC20mlddH2O（一般扩摇1L MAV203可以制备20管左右的酵母感受态）（注意即做即用）三．转化1.将ssDNA放于沸水中10分钟，后放于冰上5分钟，可重复一遍，使其彻底变性2.将感受态 40-50ulssDNA 5ulBD 1-2ulAD 1-2ul以上四种混合与离心管中，轻弹是其充分混合3．将10*TE 300ul10*LiAC 300ul50%PEG3350 2.4ml以上三种混合，取300ul，加入到2中离心管，震荡混匀10秒4.30度200rpm，摇陪30分钟5.42度水浴热激15分钟后放冰上数分钟6.6000-8000g，20-30秒离心后，去上清。
酵母感受态细胞的制备及酵母转化
小 1.5ml 0.1μg 0.1μg 0.1mg 0.1ml 0.6ml 70μl
大 50ml 20-100μg 10-50μg 2-0.5mg 20mg 8ml 60ml 7.0ml
5S(14krpm)
5min (1000×g) 1.0ml1 为自激活 对照； pGADT7- T+pGBKT7-53 阳性对照；pGADT7-T+pGBKT7- lam 阴性对照。 为了检测每一个质粒的转化效率， 100μl 水稀释 1μl 转化子， 用 铺于 SD-Leu 和 SD-Trp 平板上；为了检测共转化效率，按不同比例（1:1000，1:100，1:10）稀释转化子，取 100μl 涂于 SD-Leu-Trp 平板上； 酵母培养基： YPD medium (1L) Dific peptone（可用 OXOID 公司的胰化蛋白胨）20g/L Yeast extract Agar（for plates only） 加蒸馏水 调 pH 6.5 高压灭菌，待冷却到 55℃左右，加 40％的葡萄糖 50ml 至终浓度 2％。 40％葡萄糖：40g 葡萄糖加 60ml 左右的蒸馏水溶解，然后定容至 100ml，过滤灭菌，4℃ 存放。注意，一定不能高压灭菌，因长时间高温会使葡萄糖变黑。 YPDA medium (1L) 在上面的 YPD 培养基中每升加 0.2% 的腺嘌呤半硫酸盐（adenine hemisulfate）15ml 至 终浓度 0.003%，高压灭菌。 0.2% adenine he misulfate： 0.2g 加 100ml 蒸馏水溶解即可。 注 ： 如果需要在 YPD(YPDA) 中 加抗生素 如 kanamycin， 在上面准备 的培养基 中加 50mg/ml 的 Km0.2-0.3ml 至终浓度 10-15mg/L SD medium (1L) 无氨基酸酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids, YNB） Dific 琼脂 10×DO 蒸馏水 浓度为 2％。 注：如果使用固体 DO，1L 中加 0.64g。 下面氨基酸成分是无缺陷 DO 中所需的所有氨基酸：
感受态细胞制备步骤及准备细节
制备感受态1、配制液体培养基（1L体系）：Nacl 10g酵母提取物5gTry 10g加入氢氧化钠调节PH值至中性，放入大烧杯，搅拌混匀；2、100ml 容量瓶：CaCl2 2H2O 0.88gPIPES 0.34g甘油15ml（量筒量）去离子水冲洗量筒和玻璃棒转移至容量瓶中，定容至100ml, 上下颠倒混匀，转移至蓝帽玻璃瓶中。
3、灭菌（20min）：以上配好的两瓶溶液（灭菌时瓶盖不能太紧）；5个5ml的大离心管（黄帽）至于铝饭盒中；1.5ml EP管装满至于铝饭盒中；干净锥形瓶（大且洗净）铝箔封口；两瓶液体灭菌后取出放于4℃，其他放于烘箱烘干待用。
4、于-80℃冰箱上层取一管2ml 菌种，与超净平台上冰浴溶解；5、取8个灭过菌的EP管装满无氨苄的培养液作空白对照；6、剩余培养液倒入锥形瓶中，将融化的菌种倒入，盖上铝箔封口，稍微摇晃混匀，然后放入摇床中摇菌约2hour，菌液出现明显浑浊。
摇床参数设置（200或260r/min）。
（8管空白对照的菌液同样放入摇床摇菌）7、从摇床取出菌液，和空白对照，分别加入两只比色皿测OD值。
OD值在0.3-0.4之间表明摇菌完成。
以下冰上操作：8、将锥形瓶中200ml培养液分装到4个50ml离心管中，冰浴10min；9、4000r/min，8min，去上清，加10mlCaCl2(预冷)，用枪头轻轻吹打离心管壁上沉淀至完全；10、4000r/min，8min，4℃，去上清，加2ml CaCl2冰浴30min；11、4000r/min，8min, 去上清，加2mlCaCl2,120ul分装到1.5mlEP管（-20℃预冷），分装之后立刻-80℃保存。
酵母感受态的制备(化学法)
1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene gl ycol缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0. 5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulD MSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。
质粒载体转化酵母感受态方法
30℃200rpm温育30min 每10min轻拍混匀一次高速离心15s
3.弃上清用1ml 0.9%生理盐水重悬涂于DDO平板上，倒置培养3-5天待长出克隆计算转化率。
4.PEG/LiAc现用现配：
PEG 3350 8ml
10×TE buffer 1ml
10×LiAc 1ml
2.
小规模1.5ml 注意事项
yeastmaker Carrier DNA 5μl
PEG/LiAc500μl 轻轻混匀
质粒DNA 100ng 轻轻混匀
酵母感受态50μl
30℃200rpm温育30min 每10min轻拍混匀一次DMSO 20μl 轻轻混匀
42℃热激15min 每5min轻拍混匀一次高速离心15s
弃上清用1ml09生理盐水重悬涂于ddo平板上倒置培养35天待长出克隆计算转化率
质粒载体转化酵母感受态方法
质粒载体转化酵母感受态方法:
一、材料
1.酵母感受态细胞
2.PEG/LiAc
3.0.9%生理盐水
4.DMSO5.YPDBiblioteka 养基6.Carrier DNA
二、方法
1.变性Carrier DNA：沸水浴5min后马上冰浴10min，使用前重复一次。
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1、毕氏酵母氯化锂转化法
（1）试剂
1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）
50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）
2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存
注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；
（2）感受态毕氏酵母的制备
接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；
收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；
重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；
离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；
按50ul/管分装，立即进行转化；
注：不要将感受态酵母菌冰浴；
（3）毕氏酵母的转化
煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；
将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；
对于每一个转化，按以下顺序加入：
50% PEG3350 240ul
1M LiCl 36ul
2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul
5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul
剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；
30℃水浴孵育30min；
42℃水浴热休克20～25min;
6000～8000rpm离心收集酵母菌体；
重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；
1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；
2、毕氏酵母PEG1000转化法
（1）试剂
缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene gl ycol
缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35
缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35
未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存
注：
缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;
将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;
（2）待转化毕氏酵母的制备
接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;
挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；
取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0. 5～0.8；
室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；
重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulD MSO，混合后迅速于液氮中冷冻，
-70℃保存
（3）毕氏酵母的转化
将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；
37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；
取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；
30℃水浴孵育1h；
室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；
离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；
将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；
3、毕氏酵母电转化法
（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备
取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。
取100ul菌液接种于200ml液体LB培养基中。
37℃，200 rpm，培养16～18小时。
灭菌500 ml离心管，4℃，4000 rpm，20 min。
得菌体沉淀。
弃上清，菌体用10％甘油重悬并洗涤。
重复洗涤3次。
第三次离心后，弃绝大部分上清，留下约1ml 液体用于重悬菌体。
从制得得感受态细胞中，取200ul于灭菌EP管中，加入连接反应产物5ul，混匀，不要产生气泡，在冰上放置5min。
将混匀后得200ul菌液移入电击杯中。
使用电击穿孔仪进行转化，设置为电压2500 V，时间 5 ms。
电击后，往电击杯中加入800ul SOC培养基，冲洗出菌体，转移至灭菌1.5 ml EP 管中。
37℃，150 rpm ，轻摇45～60 min。
取全部均匀涂布于含Zeocin 25 ug/ml 的LLB－Zeocin平板上，正放，待涂布液不在流动，37℃培养12～16小时。
（2）线性化质粒DNA对Pichia pastorisGS115的转化
取新鲜制备的（或－70℃冻存的）感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻；
1）将100μl菌体移出至一新的无菌Eppendorf管中，加入5－20μg线性化质粒（5～10μl），轻弹混匀，尽数吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中；
2) 转化杯置于冰浴中5～10分钟，保持低温。
3) 电穿孔转化电击条件：电压：1500V；电阻：400Ω；电容：25μF；脉冲时间：10 mS；一次电击。
4) 电击后，马上在电击转化杯中加入1ml 4℃预冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液枪吹打均匀，置于冰浴中；
5) 取30℃烘至表面半干的MD培养基平板，在超净工作台上无菌操作涂布平板，400μl/板。