enzymolog讲义yb-离子交换色谱
离子交换色谱
Ion exchange chromatography,IEC
2018/6/8
内
容
一、离子交换色谱的基本原理
二、离子交换剂的基本性质
三、离子交换介质的选择原则
四、离子交换色谱的基本操作
一、基本原理
1、基本原理
以离子交换树脂等作为固定相，树脂上具有固定离子基 团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的 离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基 团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得 到分离。
（2）阴离子交换剂
阴离子交换树脂是在基质骨架上引入伯胺[-NH2]、仲胺[-NHCH3]、 叔胺[-N(CH3)2]和季胺[-N+(CH3)3]基团后构成的。
2、亲水性离子交换剂
基质为与水亲和力较大的天然或人工的化合物
（1）纤维素离子交换剂
以微晶纤维素为基质，再引入电荷基团构成，最为广泛使用的是 二乙氨基乙基（DEAE-）纤维素和羧甲基（CM-）纤维素。
（2）交联葡聚糖离子交换剂
以交联葡聚糖G-25和G-50为基质，通过化学方法引入电荷而制成 的。
（3）琼脂糖离子交换剂
以交联琼脂糖CL-6B为基质，引入电荷基团而构成。
三、离子交换剂的选择原则
1、离子交换剂的选择
（1）如果被分离物质带正电荷，则选用阳离子交换剂；如果带负
电荷，应选用阴离子交换剂。 （2）强型离子交换剂适用的pH范围很广，用来分离一些在极端pH
2、缓冲液的选择
（1）对于两性蛋白质
+
等电点 蛋 白 质 净 电 荷 吸附阴离子交换剂 pH
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
来说，缓冲液的pH决定
离子交换色谱
色谱分离第一节概述一、色谱的基本概念二、色谱法的分类第二节常规柱色谱分离技术一、常规柱分离技术分类二、装柱方法三、加样方式四、展开与洗脱五、柱填料第三节高效液相色谱第四节吸附色谱一、吸附色谱原理二、吸附色谱影响因素三、吸附色谱填料四、吸附色谱的应用第五节反相色谱一、反相色谱原理二、反相色谱介质三、反相色谱流动相四、反相色谱实验技术五、反相色谱的应用第六节凝胶色谱一、凝胶色谱原理二、凝胶色谱介质三、凝胶色谱实验技术四、凝胶色谱的应用第七节离子交换色谱一、离子交换色谱相关理论二、离子交换色谱介质(离子交换剂)三、离子交换色谱实验技术四、离子交换色谱的应用第八节亲和色谱一、基本原理二、亲和色谱配体三、亲和吸附剂四、亲和色谱实验技术五、亲和色谱的特殊类型六、亲和色谱的应用第九节疏水作用色谱一、疏水作用色谱基本原理二、疏水作用色谱介质三、疏水作用色谱实验技术四、疏水作用色谱的应用第十节模拟移动床色谱一、基本原理二、模拟移动床的应用第十一节超临界流体色谱一、基本原理二、超临界流体色谱法的色谱柱三、超临界流体色谱法的流动相和改性剂四、超临界流体色谱法的应用第十二节高速逆流色谱第四节离子交换色谱离子交换色谱(ion-exchange chromatography，IEC)是发展最早的色谱技术之一。
20世纪30年代人工合成离子交换树脂的出现对于离子交换技术的发展具有重要意义，基于苯乙烯-二乙烯苯的离子交换树脂至今仍是最广泛使用的一类离子交换树脂。
但它并不十分适合对生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等的分离，因为:①树脂交联度太大而颗粒内网孔较小，蛋白质分子无法进颗粒内部，只能吸附在表面，造成有效交换容量很小;②树脂表面电荷密度过大，使蛋白质在其上吸附得过于牢固，必须用较极端的条件才能洗脱，而这样的条件往往易造成蛋白质变性;③树脂的骨架具疏水性，一旦与蛋白质之间发生疏水相互作用，也容易造成蛋白质变性失活。
20世纪50年代中期，Sober和Peterson合成了羧甲基(CM-）纤维素和二乙氨乙基（DEAE-）纤维素，这是两种亲水性和大孔型离子交换剂。
离子色谱法
Conductivity ～ ～
(700µS)
Retention time
NaF
Conductivity Conductivity ～ ～
NaCl
Nround： Na2CO3 / NaHCO3
(700µS)
试剂
淋洗液保存： 淋洗液保存： 使用聚丙烯 左右. 使用聚丙烯(PP)瓶，保存在暗处及 4 ℃左右 （ 通常 瓶 保存在暗处 可以保存6个月 个月） 可以保存 个月） 淋洗液要经常更换 淋洗液要经常更换
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戴安中国有限公司（DIONEX） /
戴安公司成立于1975年 戴安公司成立于1975年，位于美国硅谷Sunnyvale。 成立于1975 1975年推出了世界第一台商品化的离子色谱， 1975年推出了世界第一台商品化的离子色谱，该项 年推出了世界第一台商品化的离子色谱 革命性的分析技术使得全球化学工作者能够从混合 物中快速分离鉴别出各项离子成分。 物中快速分离鉴别出各项离子成分。 到目前为止戴安各项成熟技术已被大大扩展， 到目前为止戴安各项成熟技术已被大大扩展，包括 离子色谱仪IC 高效液相色谱HPLC IC， HPLC包括毛细管和微 离子色谱仪IC，高效液相色谱HPLC包括毛细管和微 流量液相色谱Nano LC，氨基酸直接分析仪AAA NanoAAA流量液相色谱Nano-LC，氨基酸直接分析仪AAADirect，快速溶剂萃取仪ASE和固相萃取仪Autotrace ASE和固相萃取仪 Direct，快速溶剂萃取仪ASE和固相萃取仪Autotrace 及在线分析仪器等。
泵
检测器
泵液
分离 进样
检测
记录
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与前面提到的高效液相色谱仪器不同 的是： 的是： 离子色谱用的泵是匹克（PEEK,聚醚醚 离子色谱用的泵是匹克（PEEK,聚醚醚 材料衬里的不锈钢泵。 酮 ）材料衬里的不锈钢泵。 离子色谱的流动相一般是缓冲溶液或 者含有少量的有机试剂， 者含有少量的有机试剂，一般称为淋 洗液。 洗液。 离子色谱有抑制器和电导检测器
离子交换柱色谱
12
（二）装柱
A
·加水搅拌——沉降——去微粒——反复操作至上层液透明
·柱底放1-2cm玻璃丝——倒入上述树脂——盖一层玻璃丝
（三）洗脱 ·大多数在水溶液中进行 ·可加入少量有机溶剂，如甲醇、乙醇、乙腈等 ·可用弱酸弱碱缓冲溶液
四、特点及应用 ·特点：设备简单，操作方便，树脂可再生 ·应用：除去干扰离子、测定盐类含量、微量元素的富集、 有机物或生化溶液脱盐、药物生产、抗生素及中草药提取 和水的纯化
·基团：通常含—RO3H、—COOH、—OH、—SH、—PO3H2等 酸性基团
·作用机理：电离H⁺（氢型树脂）或金属离子（盐型树脂） 与溶液中阳离子交换
·酸性强度：强酸型阳离子交换剂、弱酸型阳离子交换剂 R—SO3H>HO—R—SO3H>R—PO3H2>R—COOH>R—OH 例子：磺化苯乙烯、书P258
1
A
离子交换柱色谱法
2
离子交换柱色谱法A
一、分配原理
离子交换剂对各组分亲和力不同——选择系数不同——分离
（一）选择系数：KS=[R⁻X⁺]/[X⁺]
离子交换平衡：
R⁻A⁺+B⁺⇌+R⁻B⁺+A⁺ KA/B =[R⁻B⁺][A⁺]/[R⁻A⁺][B⁺]
KA/B >1：亲和力：B>A KA/B <1：亲和力：B<A
②弱碱性阴离子交换树脂：含—NH2、=NH、≡N
·特点：·对OH⁻的亲和力大 ·只能在酸性介质中与阴离子交换 ·交换容量随溶液PH值而改变
2、离子交换树脂的特性
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A
1）交联度 ·表示离子交换树脂中交联剂的含量，通常以百分比表示
·高交联度树脂：·紧密网状结构，网眼小，刚性较强 ·孔穴较多 ·溶胀较小，吸水量小
13离子交换色谱
2. 离子交换剂的结构与类型
离子交换剂的组成
目前在生产中常用的离子交换剂主要有离子交换树脂和多 糖基离子交换剂，都是由3部分组成：
①不溶性载体，由高分子化合物构成的不溶于水、酸和碱， 也不溶于普通有机溶剂、化学性质稳定的网络状骨架；
②功能基团，大量与载体连接、不能自由移动的活性基团； ③可交换离子，在功能基团上携带的可移动的活性离子。
离子交换色谱
（ion exchange chromatography， IEC）
离子交换色谱
§1 概述 §2 离子交换剂的类型与结构 §3 离子交换色谱的操作过程
§5 应用
1. 概述
历史：早在古希腊时期人们就会用特定的黏土 纯化海水。算是比较早的离子交换法。这些黏 土主要是沸石。
离子交换树脂都是用有机合成方法制成。常用 的原料为苯乙烯或丙烯酸(酯)，通过聚合反应 生成具有三维空间立体网络结构的骨架，再在 骨架上导入不同类型的化学活性基团(通常为酸 性或碱性基团)而制成。
四种基本类型树脂的实用型
3）强碱性阴离子树脂可先转变为氯型，工作时用Cl-交换 其他阴离子，再生只需用食盐水。
4 ）弱碱性树脂生成的盐RNH3 Cl同样易水解。这类树脂 和OH-离子结合能力较强，所以 再生成羟型较容易，耗 碱量少。 强酸性树脂和强碱性树脂在转变成钠型和氯型后， 在使用时就不再有强酸性及强碱性。但它们仍具有这些 树脂的其他典型性能，如强离解性和工作的pH范围宽等。
阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素） 等
阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素 （DEAE纤维素）
离子交换纤维素
2.2.2 离子交换葡聚糖
离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形 成的具有多孔三维空间网状结构和离子交换功能 基团的多糖衍生物（Sephadex G）
离子交换法课件
离子交换法课件
生物分离过程的一般流程
原料液
细胞分离(离心，过滤)
路线一 细胞－胞内产物
路线二 清液－胞外产物
路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲)
复性
细胞破碎 碎片分离
路线一A
粗分离(沉淀/膜过滤/萃取)
纯化(离子交换/层析/吸附
脱盐(凝胶过滤、超滤) 浓缩(超滤)
精制(结晶、干燥)
离子交换法课件
离子交换法概述
离子交换树脂的发展
离子交换树脂的出现已有近80年的历史. 离子交换树脂发展史上的3个重要阶段 • 1933年Adams和Hofms发明了缩聚类酚醛型阳、
阴离子交换树脂, • 二战及二战后期离子交换树脂大发展
1939年德国法本公司和1941年美国的树脂产品和 化学品公司先后开始工业生产， 在第二次世界大战中，美国获得了苯乙烯系和丙 烯酸系加聚型离子交换树脂合成的专利。它开创 了当今离子交换树脂离制子交造换法方课件法的基础。
和弱酸性树脂一样，其交换能力随pH变化而变化，pH 越低，交换能力越大。
离子交换法课件
二. 离子交换树脂的分类
5 四类树脂的特性比较
①活性功能团： a 强酸阳树脂 －SO3H
OH
－PO
OH
H
－PO
OH
b 弱酸阳树脂 －COOH； 酚羟基
c 强碱性阴树脂(季胺) 强碱 I 号： CH3
－N＋－CH3
离子交换法课件
1）大孔离子交换树脂
凝胶型树脂
外观半透明 空隙小 直径小于30A 孔由链－链距离造成 溶胀空隙 均相结构 干燥/非水溶剂/浓电解质 中空隙会倒塌
大网格树脂
不透明 空隙大 直径2001000A 孔由链-链距离+致孔剂造成 溶胀空隙＋永久空隙 非均相结构 空隙是固有的，不会消失
离子交换色谱ppt课件
垂直装柱，严防气泡和断层。
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当所用的交换剂与待分离物质各组分之间亲和力差 不多而需要交换剂体积较大时，以增加柱长为宜， 使待分离组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增 加。柱的直径与高度比以1:20左右为宜。
如采用离子强度较大的洗脱液梯度洗脱时，以选用 粗而短的柱子为宜，因为当柱上洗脱液的离子强度 高到足以完全取代被吸附离子时，这些被置换的离 子则以同洗脱液等速率向下移动，如果柱细长，就 增加了脱附离子扩散的机会。
3
2、平衡常数
离子交换反应和其他化学反应一样，完全服从质量作用定律，且 离子交换剂与溶液中的离子或离子化合物所进行的离子交换反应 是可逆的。 阳离子交换剂RA，在溶液中解离出阳离子A+与溶液中的阳离子B+ 发生可逆交换反应：RA+B+ ⇋RB+A+
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，离子交换剂的 选择性可用平衡常数K表示：
1、离子交换剂应具备高度的不溶性，保证在各种溶剂 中不会发生溶解； 2、具备稳定的理化性质，不能因物理化学变化而发生 分解； 3、具有较大的表面积或疏松的孔状结构，确保交换离 子自由地发生扩散和交换。
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离子交换剂
1、疏水性离子交换剂
与水亲和力较小的人工合成树脂 （1）阳离子交换剂 阳离子交换树脂具有酸性基团，电荷基团带负电，反离子带正电， 可与溶液中的阳离子或带正电荷的化合物进行交换反应。 （2）阴离子交换剂 阴离子交换树脂是在基质骨架上引入伯胺[-NH2]、仲胺[-NHCH3]、 叔胺[-N(CH3)2]和季胺[-N+(CH3)3]基团后构成的。
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（三）样品上柱、洗脱和收集 （1）上柱 （2）洗脱 IEC中的洗脱是至关重要的一步，从交换剂上把被吸附 的物质洗脱下来，有两种方法：一种是增加离子强度， 置换出被吸附的离子；另一种是改变pH，使被吸附的 离子解离度降低，减弱其对交换剂的亲和力而被脱附。 （3）收集 用部分收集器分部收集，收集体积一般为柱体积的 1%~2%。
离子交换色谱法分析化学
离子交换色谱法分析化学离子交换色谱法是一种常用的分离和分析方法，广泛应用于化学、生物、环境等领域。
该方法基于离子交换剂与样品中离子之间的相互作用，实现对目标化合物的分离和分析。
本文将介绍离子交换色谱法的基本原理、实验操作步骤以及在化学分析中的应用。
一、离子交换色谱法的基本原理离子交换色谱法利用离子交换剂作为固定相，通过与样品中离子之间的相互作用，实现分离目标化合物。
离子交换剂是一种具有交换基团的功能性材料，通过基团与样品中离子进行交换，从而实现对目标化合物的分离。
根据不同的交换基团和固定相材料，离子交换色谱法可应用于不同类型化合物的分离和分析。
二、实验操作步骤1、准备实验仪器和试剂，包括色谱柱、流动相、样品溶液等。
2、将离子交换剂填充至色谱柱中，制成固定相。
3、将样品溶液注入进样器中。
4、开启泵，使流动相通过色谱柱，将样品中的离子与固定相中的交换基团进行交换。
5、通过检测器对分离后的离子进行分析和检测。
6、根据峰高、峰面积等参数计算目标化合物的含量。
三、离子交换色谱法在化学分析中的应用1、有机酸和碱的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定有机酸和碱的含量，如乳酸、柠檬酸、苯胺等。
通过选择合适的离子交换剂和流动相，可实现高分辨率分离和准确测定。
2、金属离子的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定金属离子，如钠、钾、钙、镁等。
通过选择含有适当功能基团的固定相，可实现对不同金属离子的分离和分析。
3、环境样品的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定环境样品中的阴、阳离子，如水样、土壤样品的分离和分析。
通过优化实验条件，可实现高分辨率分离和准确测定。
4、生物样品的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定生物样品中的离子，如氨基酸、多肽等。
通过选择合适的固定相和流动相，可实现高分辨率分离和准确测定。
5、其他领域的应用：离子交换色谱法还可应用于化学合成、药物分析、食品分析等领域。
通过选择合适的固定相和流动相，可实现对不同类型化合物的分离和分析。
离子交换色谱展示课件
——运用与分析
主讲：许先融
编辑：
资料搜集：刘佳娜 李春凤 甘权贤
资料整理：李扬帆 刘雁
08中药分析与鉴定（1）班
基本原理：
• 离子交换色谱
（ion exchange chromatography，IEC）
以离子交换树脂作为固定相，树脂上具 有固定离子基团及可交换的离子基团。当流 动相带着组分电离生成的离子通过固定相时， 组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可 逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而 得到分离。
被置换的洗脱剂的数目；
以离子交换色谱快速纯化 8 一 淀粉酶为例
研究探讨离子交换色谱
1.0 摘要：
• 高纯度的 8 一淀粉酶可作为酶试剂 ,研究生物作 用的特性、酶反应机理,测定 生化反应的平衡常数。
本研究利用合成的强阴离子交换柱很好地分
离了a- 淀粉酶粗品,其活性 回收率高达96%, 比活性达388ug/mg蛋白质纯度提高30倍。 此法的研究成功 为大规模制备高纯度 a- 淀 粉酶提供了一个新工艺路线。
离子交换色谱
谢
ห้องสมุดไป่ตู้
谢
08中鉴1班
学习交流PPT
2
离子交换色谱的运用：
• 主要用于分离离子或可离解的化合物，包括氨 基酸，多肽，核酸，核苷等各种生物大分子。
学习交流PPT
3
分离纯化生物大分子
Po+ZDo=Pb+ZDb
Po:流动相中溶质的浓度； Pb:填料表面上被吸附的溶质浓度; Do:流动相中洗脱剂的浓度； Db:填料表面上洗脱剂的浓度； Z:蛋白质在吸附过程中从填料表面上
效率的影 响可归结为离子交换平衡
的移动,这种色谱行为表明该固定相 具有典型的阴离子交换特性 ,符合离 子交换色谱的洗脱规律。但在
离子交换色谱
离子交换色谱一、实验原理：离子交换层析Ion Exchange Chromatography简称为IEC是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法;离子交换层析中,基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成;带有正电荷的称之阴离子交换树脂;而带有负电荷的称之阳离子树脂;离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化;由于蛋白质也有等电点,当蛋白质处于不同的pH条件下,其带电状况也不同;阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,所以这类蛋白质被留在柱子上,然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施,将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来;结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来;反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来;离子交换层析是用离子交换剂作固定相,利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法;即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程;带电荷量少,亲和力小的先被洗脱下来,带电荷量多,亲和力大的后被洗脱下来;二、实验设计离子交换剂；缓冲液；洗脱剂具体操作：1、离子交换介质的选择：考虑目的分子的大小,目的分子会影响其接近介质上的带电功能集团；功能集团的强弱,目的分子稳定,选择强交换介质;对于大多数纯化步骤来说,建议开始的时候使用强离子交换柱,可在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围;对于一个已知等电点的蛋白质,可根据其等电点来选择;如果选用阴离子交换剂,使用缓冲液的pH值应高于该蛋白质等电点,因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净负电荷,可与阴离子交换剂结合;如果选用阳离子交换剂,缓冲液的pH值应低于该蛋白质的等电点,因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净正电荷,可与阳离子交换剂结合;对于一个未知等电点的蛋白质,可以先选择一个阴离子交换剂,再选择一个中性的pH缓冲液,将蛋白质样品透析至,然后过阳离子交换柱,根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pH;如果目的蛋白再穿过液中,说明目的蛋白在此pH条件下带正电荷,可将缓冲液升高一个pH,将蛋白质样品透析纸,然后再过阴离子交换柱,根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pH;以此类推,直至目的蛋白能够结合在阴离子交换柱上为止,也可用阳离子交换剂作类似的选择,不过要注意,pH的改变应向减小的方向进行;功能集团的强弱一般情况下,在分离等电点pH为6-9的目的分子,尤其是当目的分子不稳定时,需要较温和的色谱条件才会选用弱交换介质;流动相缓冲液的选择：离子交换色谱的流动相必须是有一定离子强度的并且对pH有一定缓冲作用的溶液；阳离子交换剂应选择阴离子缓冲液,可用柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐等；阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液,可用乙二胺、Tris等；起始缓冲液浓度应尽可能低,这样可使色谱柱上吸附更多的分离物质;2、色谱柱的选择通常选择粗短柱,即高径比小的色谱柱;离子交换分离蛋白质是依靠吸附强弱不同,发生吸附时蛋白质会优先结合在色谱柱的上部,如果柱子过长,增加了从吸附位置到收集位置的流程距离,容易增加样品扩散,导致峰值增加3、折叠预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒,以保证有较好的均匀度,对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤;溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理,使之成为带H+或OH-的交换剂型;阴离子交换剂常用"碱-酸-碱"处理,使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用"酸-碱-酸"处理,使最终转为-H-型交换剂;洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度;已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡;为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层,要适当加压装柱,同时使柱床压紧,减少死体积,有利于分辨率的提高;柱子装好后再用起始缓冲液淋洗,直至达到充分平衡方可使用;5、折叠加样与洗脱及洗脱组分的收集和分析加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度,所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围,同时要注意离子强度应低,可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的;样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前,以离心法除去;为了达到满意的分离效果,上样量要适当,不要超过柱的负荷能力;柱的负荷能力可用交换容量来推算,通常上样量为交换剂交换总量的1%-5%;折叠洗脱：已结合样品的离子交换前,可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱,也可同时改变pH与离子强度;为了使复杂的组份分离完全,往往需要逐步改变pH或离子强度,其中最简单的方法是阶段洗脱法,即分次将不同pH与离子强度的溶液加入,使不同成分逐步洗脱;由于这种洗脱pH与离子强度的变化大,使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱,纯度较差,不适宜精细的分离;最好的洗脱方法是连续梯度洗脱,两个容器放于同一水平上,第一个容器盛有一定pH的缓冲液,第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液,两容器连通,第一个容器与柱相连,当溶液由第一容器流入柱时,第二容器中的溶液就会自动来补充,经搅拌与第一容器的溶液相混合,这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化;第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算:C=C2-C2-C11-VA2/A1式中A1、A2分别代表两容器的截面积:C1、C2分别表示容器中溶液的浓度;V为流出体积对总体积之比;当A1=A2时为线性梯度,当A1>A2时为凹形梯度,A1>A2时为凸形梯度;洗脱时应满足以下要求:①洗脱液体积应足够大,一般要几十倍于床体积,从而使分离的各峰不至于太拥挤;②梯度的上限要足够高,使紧密吸附的物质能被洗脱下来;③梯度不要上升太快,要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态;目的物的过早解吸,会引起区带扩散;而目的物的过晚解吸会使峰形过宽;洗脱馏份的分析按一定体积5-10ml/管收集的洗脱液可逐管进行测定,得到层析图谱;依实验目的的不同,可采用适宜的检测方法生物活性测定、免疫学测定等确定图谱中目的物的位置,并回收目的物;洗脱组分的收集和分析：通常色谱柱下端连接一个紫外检测器,用于检测蛋白质组分的洗脱过程,而后又连接着部分收集器,用于收集洗脱液;6、离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生;如离子交换纤维素可用2mol/:NaCl淋洗柱,若有强吸附物则可用LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生,也可用乙醇洗涤,其顺序为：LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水;保存离子交换剂时要加防腐剂;对阴离子交换剂宜用%氯已定洗必泰,阳离子交换剂可用乙基硫柳汞%;有些产品建议用%叠氮钠;三、举例：离子交换层析法分离氨基酸原理：所用样品为天冬氨酸和组氨酸的混合液,分别属酸性氨基酸、碱性氨基酸,用强酸型阳离子交换树脂Dowex50,在一定洗脱条件下洗脱,将它们分离;组氨酸pH>10,天冬氨酸.器材：层析柱,沸水浴等试剂：Dowex50；LNaOH；柠檬酸缓冲液；氨基酸混合液；茚三酮混合液目数：离子交换树脂的颗粒直径大小Dowex50为20-50目Dowex20 840µmDowex50 297µmDowex100 149µm代表二乙烯苯的百分含量操作：1、层析：将Dowex50装柱后,用LNaOH清洗树脂5分钟,再用柠檬酸缓冲液平衡10分钟;方法同凝胶层析法加样5-6滴;当样品进入树脂后,加入柠檬酸缓冲液洗脱加样后立即收集,每管收集3ml控制流速15滴/分钟;当第一峰一出现,换用LNaOH作洗脱液,直至第二峰收集完毕;用柠檬酸缓冲液再平衡10分钟,再生;2、检测：从第二管起每收集管中加入茚三酮显色液,充分混合,沸水浴15分钟,自来水冷却,观察氨基酸与茚三酮的显色反应,若生成紫色混合物,则说明收集到氨基酸;四、离子交换色谱的优缺点：优点：1、具有开放性支持骨架,大分子可以自由进入和迅速扩散,故吸附容量大；2、有亲水性,对大分子的吸附不太牢固,用温和条件即可洗脱,不致引起蛋白质变性和酶的失活；3、多孔性、表面积大、交换容量大、回收率高,可用于分离和制备;缺点：由交换层析介质决定,不同蛋白质相互分离效果也不确定,这种分离也易造成各蛋白峰的重叠,造成分离纯度的下降;四、离子交换色谱的优缺点：优点：1、具有开放性支持骨架,大分子可以自由进入和迅速扩散,故吸附容量大；2、有亲水性,对大分子的吸附不太牢固,用温和条件即可洗脱,不致引起蛋白质变性和酶的失活；3、多孔性、表面积大、交换容量大、回收率高,可用于分离和制备;缺点：由交换层析介质决定,不同蛋白质相互分离效果也不确定,这种分离也易造成各蛋白峰的重叠,造成分离纯度的下降;。