pcr实验原理及注意事项
PCR原理与操作
PCR原理与操作PCR（Polymerase Chain Reaction），也称为聚合酶链反应，是一种重要的分子生物学技术。
它是通过体外复制DNA分子来产生大量DNA分子的方法。
PCR技术在基因工程、医学诊断、犯罪现场调查等领域有广泛应用。
PCR技术依赖于DNA分子的核酸扩增过程。
其基本原理可分为三个步骤：变性、引物的结合和延伸。
1.变性：PCR反应开始时，DNA样本被加热至95℃到98℃的高温。
这个高温的作用是将DNA的两个螺旋链分离，使之成为单链DNA。
2.引物的结合：PCR反应中，引物是一段由合成的DNA片段。
引物的序列与待扩增的DNA序列的两端互补。
引物的加入使得单链DNA在较低的温度下重新连成双链结构。
引物被限制性核酸酶进行体外合成。
这个链合成过程是在一个低于变性温度的温度下进行的。
3.延伸：在第二步引物的结合后，加入了一定浓度的DNA聚合酶。
DNA聚合酶能够扩增引物，使得新的DNA链得以合成。
而且PCR反应中还加入了一定浓度的dNTPs（核苷酸三磷酸聚合物），它们是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液。
通过这些反应物，DNA聚合酶能够与引物进行大量的扩增。
PCR操作步骤及注意事项：1.样品准备：a.提取待扩增的DNA，保证DNA纯度和浓度。
b.使用无细菌污染的试剂和消毒的实验室设备。
2.PCR体系准备：a.准备PCR反应液，包括模板DNA、引物、酶、缓冲液、dNTP和盐。
b.根据所需扩增的目标序列和引物设计合适的引物。
c.确保PCR反应液没有污染，防止产生假阳性或假阴性结果。
3.PCR反应设置：a.取合适的PCR管，加入PCR反应液。
b.打开PCR仪，将PCR管放入合适的位置，设置温度和时间参数。
c.检查PCR仪的热盖是否正常工作，以确保反应条件的稳定性。
4.PCR反应：a.将PCR管放入预热PCR仪中，并启动程序。
b.进行PCR循环扩增反应，根据需要进行不同数目的循环。
PCR原理及注意事项
PCR一、PCR的原理PCR;Polymerase Chain Reaction;聚合酶链式反应;由Kary Mullis博士在1985年于美国的PE-Cetus公司工作期间发明..该技术基本原理如下：在模板DNA、primers和4种dNTPs存在下;依赖于DNA polymerase的酶促合成反应..DNA polymerase以单链DNA为模板;借助一小段双链DNA来启动合成;通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合;形成部分双链..在适宜的温度和环境下;DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端退火;并以此为起始点;沿模板5´→3´方向延伸;合成一条新的DNA互补链的过程并依次循环..1.PCR反应的基本成分包括：Templates DNA待扩增DNA、Primers、4种脱氧核苷酸dNTPs、DNA聚合酶和适宜的Buffer对于高GC含量的模板有时加入3% DMSO..类似于DNA的天然复制过程;其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物..2.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后;使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离;成为单链;以便它与引物结合;为下轮反应做准备；②.模板DNA与引物的退火复性：模板DNA经加热变性成单链后;温度降至55℃或60℃左右;引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③.引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶或Phusion DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶的作用下;以dNTPs为原料;靶序列为模板;按碱基互补配对半保留复制原理;合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链;新链又可成为下次循环的模板..3.PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行;使DNA扩增量呈指数上升..反应最终的DNA 扩增量可用Y＝1＋X n计算..Y代表DNA片段扩增后的拷贝数;X表示实际扩增效率;平均约为75%;n 代表循环次数..平均扩增效率的理论值为100%;但在实际反应中平均效率达不到理论值..如果进行30个Cycles;实际扩增倍数往往为106-107理论上以Y=2n计算;为109..反应初期;靶序列DNA片段的增加呈指数形式;随着PCR产物的逐渐积累;被扩增的DNA 片段不再呈指数增加;而进入线性增长期或静止期;即出现“停滞效应”;这种效应称平台期..PCR 扩增效率及DNA聚合酶、PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素与之都有关..大多数情况下;平台期的产生不可避免..二、PCR的种类1.常规PCR2.反转录PCRreverse transcription;RT- PCR先在逆转录酶的作用下;以mRNA为模板;Primer 1常用OligodT引物为引物合成与其互补的cDNAcomplementary DNA;再以cDNA为模板;Primer 2为引物进行PCR反应..常用逆转录酶有AMVavian myeloblastosis virus;酶活最适温度42℃和MMLVmoloney murine leukemia virus; 酶活最适温度37℃..RT-PCR是一种快速简便敏感度极高的检测mRNA转录量或蛋白表达水平的方法..半定量RT-PCR以组织中普遍表达且表达量恒定的管家基因的mRNA表达为对照;将目的基因mRNA 与之一起逆转录成各自cDNA;最后计算它们的比值来达到对mRNA表达半定量的目的..3.实时荧光定量PCRQuantitative Real-time PCR;Q-RT-PCR在PCR反应体系中加入荧光基团SYBP Green 1或Taqman或分子信标等;利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程;最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法..利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化;通过Ct值C 代表Cycle;T代表threshold和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析..Ct值：扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数..荧光阈值是前3-15个循环荧光信号的标准偏差的10倍..用途：绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数;通常用到标准曲线；相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间或不同基因之间的基因表达差异；基因型/等位基因分析;例如SNP检测；转基因生物监测等4.重组PCR又称重叠PCR;overlap PCR：制备杂合基因5.多重PCR又称复合PCR;multiplex PCR两对或两对以上引物在一个反应体系中扩增多条目的基因片段6.不对称PCR：使用浓度相差100倍的正反引物;得到单链DNA7.反向PCR：扩增引物相反方向DNA 序列目的基因之外的序列;从而研究未知序列8.巢式PCRNest PCR：高特异性扩增;一对引物扩全长;一对引物扩内部部分序列此外;还有Touchdown PCR、锚定PCRA-PCR、Allele- specific PCRAS-PCR、单链构型多态性PCRSSCP-PCR和低严格单链特异性引物PCRLSSP- PCR等..。
pcr扩增实验注意事项
pcr扩增实验注意事项PCR扩增实验注意事项PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学研究的技术，可在短时间内迅速扩增DNA片段。
PCR实验的成功与否直接影响实验结果的准确性和可靠性。
为了确保PCR实验的顺利进行，以下是一些值得注意的事项。
实验前的准备工作在进行PCR实验之前，必须进行充分的准备工作。
这包括准备PCR试剂，如引物、模板DNA和聚合酶等，以及实验器材的消毒。
1.引物的设计与选择PCR扩增所需的引物应具有良好的特异性，能够与待扩增的目标DNA序列完全互补。
引物的设计可以借助于计算机软件进行，以确保引物的特异性和扩增效率。
此外，引物的长度应适中，通常选择15-30个核苷酸的长度。
2.模板DNA的准备与稀释模板DNA是PCR扩增的起点，它必须具有足够的纯度和浓度。
在准备模板DNA时，应注意避免DNA的降解和污染。
同时，还需要将模板DNA 稀释到适当的浓度，以确保PCR反应的最佳效果。
3.实验器材的消毒PCR实验需要在无菌条件下进行，以避免外源性DNA的污染。
在实验前，所有的器材和试剂瓶口都必须经过高温消毒，或使用酶切酶或DNase去除潜在的污染。
实验操作步骤实验操作步骤是PCR实验中最关键的部分，任何疏忽都可能导致实验失败或产生虚假结果。
以下是PCR实验中的一些重要操作步骤。
1.反应体系的配制PCR反应体系通常包括引物、模板DNA、dNTPs、聚合酶和缓冲液等组分。
根据实验需要，在计算器或试剂盒说明书的指导下，计算和配制所需的每个组分的量。
2.反应管的装填和密封将配制好的PCR反应体系分装到PCR反应管中，并在反应管盖上加上适当的密封层，如矿物油或矽胶珠。
这样可以防止反应体系的蒸发和污染。
3.反应条件的优化PCR反应需要针对性地进行优化，包括反应温度、循环数和延伸时间等参数。
通过合理调整这些参数，可以最大限度地提高PCR扩增的效率和特异性。
4.防止污染和交叉污染PCR反应对DNA污染非常敏感，因此需要特别注意防止样品之间的DNA 交叉污染。
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
荧光定量PCR是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号的检测来对PCR产物进行实时定量分析的技术。
1. 原理：
荧光定量PCR利用荧光染料或者荧光探针，标记扩增过程中的每一个循环的产物，这些荧光标记的产物在激发光的作用下会发出荧光。
随着反应的进行，PCR产物不断累积，荧光信号也随之增强。
通过对荧光信号的实时监测，可以推断出样本中起始模板的数量。
2. 方法：
主要方法包括探针法、SYBR Green I染料法和分子信标法等。
探针法使用与目标序列特异性结合的荧光探针来标记PCR产物。
SYBR Green I染料法则是利用染料与双链DNA的结合特性，将染料添加到反应体系中，随着PCR产物的增加，染料的荧光信号也增强。
3. 注意事项：
荧光定量PCR对样品纯度要求较高，应避免杂质的干扰。
反应体系中的成分和浓度需要精确控制，以确保实验结果的准确性。
荧光定量PCR的结果解读需要参考标准曲线，以确定未知样本中的目标序列数量。
4. 在临床与科研中的应用：
在临床应用中，荧光定量PCR被广泛用于病原体检测、基因突变分析、遗传病诊断以及癌症研究等。
例如，用于检测病毒如HIV、HBV等的载量，或者检测癌症相关基因的表达水平。
在科研领域，荧光定量PCR可用于基因表达分析、基因组学和表观遗传学研究中。
例如，比较不同组织或细胞类型的基因表达差异，或者研究表观遗传修饰对基因表达的影响。
总的来说，荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量分析方法，对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
rt-pcr的步骤和注意事项
RT-PCR的步骤和注意事项RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA的数量和表达水平。
下面是RT-PCR的基本步骤和一些需要注意的事项。
步骤1.提取RNA：RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。
常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。
2.逆转录：逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。
逆转录反应需要逆转录酶和引物。
在逆转录反应中，RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。
3.退火：将逆转录产生的单链cDNA进行退火，以得到双链cDNA。
退火的温度和时间应根据引物的特异性进行优化。
4.PCR扩增：将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。
PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。
PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。
5.分析产物：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析，以检测和定量RNA的表达水平。
注意事项在进行RT-PCR实验时，有几个注意事项需要遵守：1.RNase污染：RNase是一种可以降解RNA的酶，极易污染实验室环境。
为了避免RNase污染，所有操作前都应使用RNase去除液对实验表面进行彻底清洁，并在操作过程中使用RNase-free的试剂和器具。
2.质控：在RT-PCR实验中应常规进行阴性对照和阳性对照。
阴性对照是用纯水代替RNA模板，而阳性对照是使用已知含有目标RNA的样品。
质控实验的结果应该符合预期，以确保实验的准确性和可靠性。
3.引物设计：引物是RT-PCR实验中非常重要的因素，合适的引物设计可以提高实验的特异性和灵敏度。
引物的选择应避免自身互补性，长度一般为18-24个碱基，GC含量在40-60%之间。
此外，引物的Tm值应相近，以确保PCR扩增的效果。
4.反应体系：RT-PCR反应体系的准备需要精确的计量。
反应的组分通常包括模板RNA，引物，逆转录酶，逆转录缓冲液，核苷酸混合液，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs和MgCl2等。
pcr 操作中最应该注意的事项
pcr 操作中最应该注意的事项PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
在进行PCR操作时，有一些非常重要的事项需要特别注意，以确保实验的准确性和可靠性。
以下是在PCR操作中最应该注意的事项：1. 实验室操作规范：在进行PCR操作之前，需要做好实验室操作规范的准备工作，包括戴好实验手套、穿好实验服、清洁操作台面等。
避免在实验室中进食、饮水或使用手机等。
2. 检查实验仪器和试剂：在开始PCR实验之前，需要确保PCR仪器的正常运转和试剂的完整性。
检查PCR仪器的温控系统、离心机的转速、试剂的保质期等，确保实验条件的准确性。
3. 建立阳性和阴性对照：在每次PCR实验中，都要包括阳性对照和阴性对照，以验证实验的准确性。
阳性对照应包括已知的阳性样品，而阴性对照则应该是未添加DNA模板的反应混合物。
4. 采用单独的PCR实验室：为了避免PCR实验中的污染，最好在专门的PCR实验室中进行实验，避免与其他实验室中的DNA样品混合。
5. 严格控制实验条件：在PCR实验中，需要严格控制实验条件，包括温度、时间、试剂比例等。
确保PCR反应体系的均匀混合、温度梯度的准确性和反应时间的精确控制。
6. 避免污染：PCR实验非常容易受到外源DNA的污染，因此需要避免在实验室中的DNA样品和PCR产物的交叉污染。
实验中应该使用滤器枪头、一次性试剂盒等措施，避免污染的发生。
7. 定期维护PCR仪器：PCR仪器的维护对实验的准确性非常重要。
定期清洁PCR仪器的加热盖、检查温度控制系统的准确性、更换磁力搅拌器的磁子等，确保PCR仪器的正常运转。
8. 标记实验样品：在进行PCR实验时，需要对实验样品进行正确的标记，包括样品的编号、实验日期、PCR程序名称等。
避免实验样品的混淆和实验结果的不准确。
9. 注意PCR产物的保存和处理：PCR产物的保存和处理对实验结果的可靠性有着重要的影响。
pcr的操作及注意事项
PCR的操作及注意事项一、PCR简介PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学实验技术，用于扩增特定的DNA片段。
PCR技术的广泛应用，使得其操作和注意事项变得尤为重要。
本文将介绍PCR的操作步骤以及需要注意的事项。
二、PCR的操作步骤1. DNA提取首先，需要从样本中提取目标DNA。
常用的提取方法包括酚氯仿法、热碱法和商业DNA提取试剂盒。
在提取DNA的过程中，应注意减少污染，保持工作区域清洁。
2. PCR反应液的配制将PCR反应液的各种试剂按照实验方案的要求配制好，主要包括模板DNA、引物、dNTPs、缓冲液和聚合酶。
保持试剂的新鲜和纯净，避免重复冻融。
3. PCR反应的设置将PCR反应液分装到反应管中，可根据需要设置多个反应管。
注意反应管的密封性，避免样品蒸发和污染。
同时，设定PCR反应的温度程序，包括变性、退火和延伸的温度和时间。
4. PCR反应的程序将反应管放入PCR仪中，启动PCR程序。
确保PCR仪的温度控制准确可靠，保持反应过程的稳定性。
根据目标DNA片段的大小，调整PCR的循环次数，一般为25-35个循环。
5. PCR产物的分析PCR反应结束后，可以通过各种方法对PCR产物进行分析，常用的方法包括琼脂糖凝胶电泳和DNA测序。
分析结果能够验证PCR扩增的特异性和产物的纯度。
三、PCR操作的注意事项1. 高品质的DNA模板PCR反应的成功与否与DNA模板的质量有很大关系。
因此，在进行PCR实验前，应确保使用高质量的DNA模板，如通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。
2. 引物的设计和质量PCR反应中使用的引物应具有较高的特异性和准确性。
在设计引物时，应避免引物间的互补性，以免出现非特异扩增。
同时，引物的质量也很重要，选择高纯度的引物可以提高PCR反应的成功率。
3. 操作区域的消毒与隔离为了避免PCR反应过程中的污染，应定期对实验区域进行消毒，如操作台面、工作台和仪器表面。
聚合酶链式反应(PCR)基本原理
四、PCR实验中应注意的事项
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采取以下措施有助于防止污染和结果的假阳性： 1、隔离不同操作区； 2、分装试剂； 3、严格实验操作； 4、严格按无菌操作的原则进行PCR所有操作等。
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聚合酶链反应（PCR）
• • • • 一、PCR的概念； 二、PCR的基本原理； 三、PCR反应条件的优化； 四、PCR操作的注意事项。
• 一、概念：
• 聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）扩增技术，即体外试管内DNA的扩增， 以高特异性、高灵敏度、高效率及忠实性等特 点，在生命科学研究领域产生着巨大的影响。
• 引物设计遵循下列原则：
• ①引物长度一般为15～30个核苷酸。
• ②引物中碱基的分布尽可能随机，尽量避免多 聚嘌呤或多聚嘧啶。
• ③引物内避免存在互补序列，以免折叠形成发 夹结构。
• ④两引物间不应存在互补序列，尤其是避免3′ 端的互补重叠。 • ⑤引物与非特异扩增序列的同源性<70%。 • ⑥引物的3′端碱基一定要与模板互补配对；而 5′则可相对不严，甚至还可做一些修饰。
1、变性 • 通过加热至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键 断裂，形成单链DNA，作为反应的模板。
• 2、退火 • 将温度降至引物的 Tm 值左右或以下（比 Tm 低 5℃，通常为 55 ～ 65℃），引物与 DNA 模 板互补结合，形成杂交链。
• 3、延伸 • 在DNA聚合酶（一种耐热的DNA聚合酶）的 作用下，于70～74℃以引物3′端为起始 点按5′→3′方向使DNA新链延伸。
• 上述三步为一个循环，每一循环的产物作 为下一个循环的模板，如此经过 25 － 30 个 循环，可使新生的DNA片段得以扩增。
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PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时,首先检查以下几方面并遵照执行:将PＣＲ反应得试管与反应板紧贴、当酶反应混合物以70℃“热启动"开始循环时,切记在加入酶后稍微振荡一下,因为在0。
2—m ｌ得PCR管中不能均匀传热。
ﻫ不要随意减少dNTＰ得用量,它就是一个系统得因素,必须与其它成份保持平衡。
ﻫ对于有问题得PCR反应,例如模板得量少,模板不纯与环状模板等,先尝试加Ｔａｑ酶前得体系进行预变性,后加模板进行正常PＣＲ扩增。
ﻫ没有扩增产物:在提供MgCl2缓冲液中,以0、25mmoｌ／L为梯度增加MgCl2浓度;无ＭgCl２得缓冲液以0、5mmol/L为梯度增加MgCｌ2浓度。
ﻫ泳道中出现模糊条带,如果ＤNＡ模板中存在R ＮA,则按上述提示浓度补加MgＣl2,因为在PCR反应中可能缺少游离得Ｍg２+。
ﻫ检查退火温度与变性条件,如果有需要得话,可降低退火温度。
ﻫ检查模板与引物得用量。
ﻫ增加循环次数与／或模板ＤＮA得用量。
ﻫ泳道中出现模糊条带: ﻫ减少循环次数或模板DNA得用量。
ﻫ提高退火温度,但不要超过６8℃。
重新设计引物或设计更长得引物。
其她值得注意得条件:建议使用0、2—ｍｌ薄壁管。
厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。
最佳反应体积为50ml,推荐用30mｌ矿物油覆盖(对盖子加热得PCR仪可以不加)。
ﻫ大多数反应中,0、75ml(0。
5～1ml)得酶量在大多数情况下可以得到满意得结果。
建议使用1.75mｍol／ＬMgCｌ2∶３5０mmol/L dNＴP或2.２5mmｏl/L MgCｌ2∶5０0mmol/ＬdNTＰ组合得混合物、然而要得到最佳结果,优化Mg２＋得浓度就是必需得。
ﻫ基因组DNＡ模板得质量显著影响PＣR反应。
因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA 得长度。
DNＡ片段长度可以超过50kb,传统得基因组DNＡ能扩增片段至10kb。
要扩增更长得片段应使用超纯或高分子量得ＤＮA。
请查阅高分子量ＤNＡ提取操作过程相关文献、ﻫ降低二级结构与引物二聚物形成得可能性、进行长片段PCR扩增时,引物长度一般为2４～34个核苷酸,溶点在６0～68℃间。
使用这类引物可提高PCR反应得退火温度来增加反应得特异性。
这点非常重要,长片段扩增得效果往往受到非特异性短片段优先扩增得影响。
ﻫ变性:第一步变性在94℃下进行2分钟。
在循环过程中尽可能缩短变性时间(9４℃下进行２0—-30秒),除非模板中富含ＧC,则95℃下变性３0秒。
这可以防止DNA脱嘌啉与链断裂,对于所需扩增得基因组DＮＡ片段终长度超过12kb时,应该尽可能得降低变性温度。
延伸:68—－72℃下进行延伸操作。
ﻫ循环延伸:尽量采用循环延伸得条件,若PCR仪无此功能,则必须增加延伸得时间,例如在扩增１0kb片断时,延伸时间用10分钟替代原来得８分钟、长片断PCR系统扩增得片断其3’—末端带有一个突出得Ａ,因此建议采用Ｔ／A克隆。
若要进行平端可隆,可用Ｋｌenow酶与T4 DNＡ多聚酶将PCＲ产物补平后再进行、测序时因酶得混合物带有3’→5’外切酶活性,用Sanger方法进行测序不能产生均一得(染色体)带型。
在无菌得0。
5ml或0.2mｌ离心管中按下列操作程序加样:ﻫ反应物加样顺序体积(μl) 终浓度去离子水1 2９、41０×Bufｆer B 2 5 １×10×PCRＢufｆer成分:Ｔｒis-ＨＣl pH８。
5 １00 mＭKCｌ5０0 ｍMMｇCl15 mMﻫ4×dNＴP混合物 3 5 各20０μmol／LMgCl2 4 ３１。
５mmｏl/Ｌﻫ有义引物５2、６0.25μmoｌ/Ｌ反义引物６ 2.60。
25μｍｏl／Ｌﻫ模板720.1μgTaqDＮA聚合酶８０.4 1unitﻫ2. 用微量可调加样器与一次性Tip向每一管中加50μｌ矿物油。
每加一管换一次Tip、3、振荡每只管,然后短暂离心。
4、将管放到预热得热循环中,按下列程序开始循环:ﻫ预变性９４℃４分钟1次变性9４℃1分钟ﻫ退火37—６5℃１分钟延伸72℃1分钟ﻫ循环30次ﻫ终延伸７2℃7分钟1次保存４℃讨论１、假阴性,不出现扩增条带PCR反应得关键环节有①模板核酸得制备,②引物得质量与特异性,③酶得质量,④PCR 循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板:①模板中含有Tａq酶抑制剂,②在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。
③模板核酸变性不彻底。
在酶与引物质量好时,不出现扩增带,有可能就是模板核酸提取过程出了毛病,可使用阳性对照得DNA模板配合检查模板质量。
酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析就是否因酶得活性丧失或不够而导致假阴性。
ﻫ引物:引物质量、引物得浓度、两条引物得浓度就是否对称,就是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散得常见原因、有些批号得引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率得不对称扩增,对策为:①选定一个好得引物合成单位。
②引物得浓度不仅要瞧OＤ值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带得亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PＣR有可能失败,应与引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏,导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等、ﻫＭg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCＲ扩增效率影响很大,浓度过高可降低ＰCR扩增得特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使ＰCＲ扩增失败而不出扩增条带。
ﻫ反应体积得改变:通常进行PCR扩增采用得体积为20ul、30ｕl、50ul、或100uｌ,应用多大体积进行PＣR扩增,就是根据科研与临床检测不同目得而设定,在做小体积如20ul后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败、ﻫ物理原因:变性对ＰCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率,退火温度过高影响引物与模板得结合而降低ＰＣR扩增效率。
有时还有必要用标准得温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内得变性、退火与延伸温度,这也就是ＰCR失败得原因之一、靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增就是不会成功得、ﻫ2、假阳性出现得PCＲ扩增条带与目得靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。
ﻫ引物设计不合适:选择得扩增序列与非目得扩增序列有同源性,因而在进行PＣR扩增时,扩增出得PCR产物为非目得性得序列。
靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。
需重新设计引物。
靶序列或扩增产物得交叉污染:这种污染有两种原因:一就是整个基因组或大片段得交叉污染,导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决:①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
②除酶及不能耐高温得物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
③必要时,在加标本前,反应管与试剂用紫外线照射,以破坏存在得核酸。
二就是空气中得小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定得同源性、可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PＣR产物,而导致假阳性得产生,可用巢式PCR 方法来减轻或消除。
ﻫ3、出现非特异性扩增带ﻫPCR扩增后出现得条带与预计得大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带得出现,其原因:一就是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二就是Mｇ2+离子浓度过高、退火温度过低,及ＰCR循环次数过多有关。
其次就是酶得质与量,往往一些来源得酶易出现非特异条带而另一来源得酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增、其对策有:①必要时重新设计引物。
②减低酶量或调换另一来源得酶、③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。
④适当提高退火温度或采用二温度点法(９3℃变性,65℃左右退火与延伸)、ﻫﻫ４.出现片状拖带或涂抹带ﻫPCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶得质量差,dNTP浓度过高,Mg２+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。
其对策有:①减少酶量,或调换另一来源得酶。
②减少dNTＰ得浓度。
③适当降低Mg2+浓度。
④增加模板量,减少循环次数。
PCR技术类似于ＤNＡ得天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补得寡核苷酸引物。
PCR由变性-—退火-—延伸三个基本反应步骤构成:①模板DＮA得变性:模板DＮA 经加热至93℃左右一定时间后,使模板ＤＮＡ双链或经PＣR扩增形成得双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DＮA与引物得退火(复性):模板ＤNＡ经加热变性成单链后,温度降至5５℃左右,引物与模板DNA单链得互补序列配对结合;③引物得延伸:DNA模板-—引物结合物在TaqDNＡ聚合酶得作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新得与模板DNA链互补得半保留复制链重复循环变性-—退火—－延伸三过程,就可获得更多得“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环得模板。
每完成一个循环需2~４分钟,2～３小时就能将待扩目得基因扩增放大几百万倍。
到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板得拷贝、PＣR得三个反应步骤反复进行,使DＮA扩增量呈指数上升。
反应最终得DＮＡ扩增量可用Y=(１＋Ｘ)n计算。
Y代表DNA片段扩增后得拷贝数,Ｘ表示平(Ｙ)均每次得扩增效率,ｎ代表循环次数。
平均扩增效率得理论值为100％,但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期,靶序列DNA片段得增加呈指数形式,随着PＣR产物得逐渐积累,被扩增得DNＡ片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应",这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNＡ聚合酶PCR得种类与活性及非特异性产物得竟争等因素、大多数情况下,平台期得到来就是不可避免得。
ﻫPＣR扩增产物可分为长产物片段与短产物片段两部分。
短产物片段得长度严格地限定在两个引物链5’端之间,就是需要扩增得特定片段。
短产物片段与长产物片段就是由于引物所结合得模板不一样而形成得,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补得DNA为模板,引物就是从3'端开始延伸,其5’端就是固定得,3’端则没有固定得止点,长短不一,这就就是“长产物片段”。
进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成得链(即“长产物片段")结合、引物在与新链结合时,由于新链模板得５'端序列就是固定得,这就等于这次延伸得片段３'端被固定了止点,保证了新片段得起点与止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致得“短产物片段”。