pcr实验原理及注意事项

PCR疑难解答

当PCR结果不甚满意时,首先检查以下几方面并遵照执行:

将PＣＲ反应得试管与反应板紧贴、

当酶反应混合物以70℃“热启动"开始循环时,切记在加入酶后稍微振荡一下,因为在0。2—m ｌ得PCR管中不能均匀传热。ﻫ不要随意减少dNTＰ得用量,它就是一个系统得因素,必须与其它成份保持平衡。ﻫ对于有问题得PCR反应,例如模板得量少,模板不纯与环状模板等,先尝试加Ｔａｑ酶前得体系进行预变性,后加模板进行正常PＣＲ扩增。ﻫ没有扩增产物:

在提供MgCl2缓冲液中,以0、25mmoｌ／L为梯度增加MgCl2浓度;无ＭgCl２得缓冲液以0、5mmol/L为梯度增加MgCｌ2浓度。ﻫ泳道中出现模糊条带,如果ＤNＡ模板中存在R ＮA,则按上述提示浓度补加MgＣl2,因为在PCR反应中可能缺少游离得Ｍg２+。ﻫ检查退火温度与变性条件,如果有需要得话,可降低退火温度。ﻫ检查模板与引物得用量。ﻫ增加循环次数与／或模板ＤＮA得用量。ﻫ泳道中出现模糊条带: ﻫ减少循环次数或模板DNA得用量。ﻫ提高退火温度,但不要超过６8℃。

重新设计引物或设计更长得引物。

其她值得注意得条件:

建议使用0、2—ｍｌ薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。

最佳反应体积为50ml,推荐用30mｌ矿物油覆盖(对盖子加热得PCR仪可以不加)。ﻫ大多数反应中,0、75ml(0。5～1ml)得酶量在大多数情况下可以得到满意得结果。

建议使用1.75mｍol／ＬMgCｌ2∶３5０mmol/L dNＴP或2.２5mmｏl/L MgCｌ2∶5０0mmol/ＬdNTＰ组合得混合物、然而要得到最佳结果,优化Mg２＋得浓度就是必需得。ﻫ基因组DNＡ模板得质量显著影响PＣR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA 得长度。DNＡ片段长度可以超过50kb,传统得基因组DNＡ能扩增片段至10kb。

要扩增更长得片段应使用超纯或高分子量得ＤＮA。请查阅高分子量ＤNＡ提取操作过程相关文献、ﻫ降低二级结构与引物二聚物形成得可能性、进行长片段PCR扩增时,引物长度一般为2４～34个核苷酸,溶点在６0～68℃间。使用这类引物可提高PCR反应得退火温度来增加反应得特异性。这点非常重要,长片段扩增得效果往往受到非特异性短片段优先扩增得影响。ﻫ变性:第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间(9４℃下进行２0—-30秒),除非模板中富含ＧC,则95℃下变性３0秒。这可以防止DNA脱嘌啉与链断裂,对于所需扩增得基因组DＮＡ片段终长度超过12kb时,应该尽可能得降低变性温度。

延伸:68—－72℃下进行延伸操作。ﻫ循环延伸:尽量采用循环延伸得条件,若PCR仪无此功能,则必须增加延伸得时间,例如在扩增１0kb片断时,延伸时间用10分钟替代原来得８分钟、

长片断PCR系统扩增得片断其3’—末端带有一个突出得Ａ,因此建议采用Ｔ／A克隆。若要进行平端可隆,可用Ｋｌenow酶与T4 DNＡ多聚酶将PCＲ产物补平后再进行、

测序时因酶得混合物带有3’→5’外切酶活性,用Sanger方法进行测序不能产生均一得(染色体)带型。

在无菌得0。5ml或0.2mｌ离心管中按下列操作程序加样:

ﻫ反应物加样顺序体积(μl) 终浓度

去离子水1 2９、4

1０×Bufｆer B 2 5 １×

10×PCRＢufｆer成分:

Ｔｒis-ＨＣl pH８。5 １00 mＭ

KCｌ5０0 ｍM

MｇCl15 mM

ﻫ4×dNＴP混合物 3 5 各20０μmol／L

MgCl2 4 ３１。５mmｏl/Ｌﻫ有义引物５2、６0.25μmoｌ/Ｌ

反义引物６ 2.60。25μｍｏl／Ｌﻫ模板720.1μg

TaqDＮA聚合酶８０.4 1unitﻫ

2. 用微量可调加样器与一次性Tip向每一管中加50μｌ矿物油。每加一管换一次Tip、

3、振荡每只管,然后短暂离心。

4、将管放到预热得热循环中,按下列程序开始循环:ﻫ预变性９４℃４分钟1次

变性9４℃1分钟ﻫ退火37—６5℃１分钟

延伸72℃1分钟ﻫ循环30次ﻫ

终延伸７2℃7分钟1次

保存４℃

讨论

１、假阴性,不出现扩增条带

PCR反应得关键环节有①模板核酸得制备,②引物得质量与特异性,③酶得质量,④PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板:①模板中含有Tａq酶抑制剂,②在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。③模板核酸变性不彻底。在酶与引物质量好时,不出现扩增带,有可能就是模板核酸提取过程出了毛病,可使用阳性对照得DNA模板配合检查模板质量。

酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析就是否因酶得活性丧失或不够而导致假阴性。ﻫ引物:引物质量、引物得浓度、两条引物得浓度就是否对称,就是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散得常见原因、有些批号得引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率得不对称扩增,对策为:①选定一个好得引物合成单位。②引物得浓度不仅要瞧OＤ值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带得亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PＣR有可能失败,应与引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏,导致引物变质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等、ﻫＭg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCＲ扩增效率影响很大,浓度过高可降低ＰCR扩增得特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使ＰCＲ扩增失败而不出扩增条带。ﻫ反应体积得改变:通常进行PCR扩增采用得体积为20ul、30ｕl、50ul、或100uｌ,应用多大体积进行PＣR扩增,就是根据科研与临床检测不同目得而设定,在做小体积如20ul后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败、ﻫ物理原因:变性对ＰCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率,退火温度过高影响引物与模板得结合而降低ＰＣR扩增效率。有时还有必要用标准得温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内得变性、退火与延伸温度,这也就是ＰCR失败得原因之一、

靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增就是不会成功得、

ﻫ2、假阳性

出现得PCＲ扩增条带与目得靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。ﻫ引物设计不合适:选择得扩增序列与非目得扩增序列有同源性,因而在进行PＣR扩增时,扩增出得