高灵敏小鼠白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书
人白细胞介素6(IL-6)定量检测试剂盒(ELISA)
仅供科研使用，不得用于临床检验。
人白细胞介素6（IL-6）定量检测试剂盒（ELISA）说明书【产品名称】通用名称：人白细胞介素6（IL-6）定量检测试剂盒（ELISA）英文名称：Human Interleukin-6（IL-6）ELISA KIT【包装规格】48人份/盒，96人份/盒【预期用途】仅供科研使用，定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中人白细胞介素6（IL-6）的浓度。
【检验原理】本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。
在预包被抗人白细胞介素6（IL-6）抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入人白细胞介素6（IL-6）校准品和待测样本，再加入另一株HRP标记的抗人白细胞介素6（IL-6）抗体（酶标抗体），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-酶标抗体的夹心复合物。
加底物A 和B，底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中人白细胞介素6（IL-6）的浓度正相关。
拟合校准品曲线，可以计算出样本中人白细胞介素6（IL-6）的浓度。
【主要组成成分】主要成分校准品浓度依次为：320、160、80、40、20、0 pg/ml。
校准品已经通过测试，结果表明HBs抗原阴性，HIV1、HIV2和HCV抗体阴性，由于不存在一种试验方法能够完全保证没有这些物质，本品必须按照具有潜在的感染性进行处理，处理过程应当遵循通用的安全措施。
需要但未提供的材料及耗材1、酶标仪2、精密移液器及一次性吸头3、蒸馏水4、洗瓶或者自动洗板机5、37℃水浴锅或恒温箱6、500ml量筒7、无粉一次性乳胶手套8、质控品（可从蓝图生物科技产品研发系统中选择）【储存条件及有效期】1、2-8℃保存，切勿冷冻，有效期6个月。
2、开封使用后，包被微孔板放入带有干燥剂的自封袋中，密闭自封袋，并将全部试剂放回2-8℃冰箱。
白细胞介素6(IL-6)测定试剂盒(电化学发光免疫分析法)产品技术要求lztk
白细胞介素6（IL-6）测定试剂盒（电化学发光免疫分析法）适用范围：该试剂盒用于体外定量测定人体血清样本中白细胞介素6（IL-6）的含量。
1.1产品型号/规格：50人份/盒、100人份/盒。
1.2主要组成试剂盒由磁分离试剂（M）、试剂a（Ra）、试剂b（Rb）和定标品（IL-6-Cal）(选配）组成。
组成及含量如下：2.1 外观2.1.1 试剂盒各组分应齐全、完整、液体无渗漏；2.1.2 磁分离试剂摇匀后应为棕色含固体微粒的均匀悬浊液，无明显凝集、无絮状物；2.1.3 其它液体组分应澄清，无异物，沉淀物或絮状物；2.1.4 包装标签应清晰、无磨损、易识别。
2.2 空白限应不大于1.5pg/mL。
2.3 准确度用IL-6国际标准品（89/548）进行检测，其测量结果的相对偏差应在±10%范围内。
2.4 线性在[5.0，5000.0]pg/mL范围内，线性相关系数（r）应不小于0.9900。
2.5 精密度2.5.1 分析内精密度在试剂盒的线性范围内，浓度为（30.0±6.0pg/mL）和（500.0±100.0pg/mL）的样品检测结果的变异系数（CV）应不大于8%。
2.5.2 批间精密度在试剂盒的线性范围内，用3个批号试剂盒分别检测浓度为（30.0±6.0pg/mL）和（500.0±100.0pg/mL）的样品，检测结果的变异系数（CV）应不大于15%。
2.6 效期末稳定性本产品效期为15个月，试剂盒在2～8℃下保存至有效期末进行检测，检测结果应符合2.1、2.2、2.3、2.4、2.5.1的要求。
2.7 溯源性依据GB/T21415-2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》的要求，定标品溯源到IL-6国际标准品（89/548）。
小鼠白介素6试剂盒的实验原理和操作步骤
小鼠白介素6试剂盒的实验原理和操作步骤实验原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被白介素6(IL-6)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的白介素6(IL-6)呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。
操作步骤：1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；3. 样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
注意事项1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。
所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。
使用后立即冷藏保存试剂。
2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。
在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。
温育过程中不要让微孔干燥掉。
3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。
4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。
5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6. 在储存和温育时避免强光直接照射。
7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。
8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。
任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。
四正柏生物 小鼠IL-6 ELISA试剂盒说明书
REV20190712仅供研究，不用于临床诊断。
客服热线: 400-7060-959﹡技术支持邮箱: **************公司官网: 目录简介 ........................................................................................................................................................... - 3 -检测原理 ................................................................................................................................................... - 3 -试剂盒组分 ............................................................................................................................................... - 4 -储存条件 ................................................................................................................................................... - 5 -其他实验材料(不提供，但可协助购买) : ............................................................................................. - 5 -注意事项 ................................................................................................................................................... - 5 -样本收集处理及保存方法 ....................................................................................................................... - 6 -试剂准备 ................................................................................................................................................... - 6 -操作步骤 ................................................................................................................................................... - 8 -操作流程图 ............................................................................................................................................... - 8 -操作要点提示 ........................................................................................................................................... - 9 -结果判断 ................................................................................................................................................... - 9 -结果重复性 ............................................................................................................................................. - 10 -灵敏度 ..................................................................................................................................................... - 10 -特异性 ..................................................................................................................................................... - 10 -参考文献 ................................................................................................................................................. - 10 -该产品由北京四正柏生物科技有限公司研制。
白细胞介素6中文说明书 (3)
白细胞介素6中文说明书
白细胞介素6（Interleukin-6，简称IL-6）是一种蛋白质
分子，属于细胞因子家族中的一员。
它在人体中起着重要
的免疫调节作用。
IL-6来源于多种细胞，包括T细胞、B细胞、单核细胞等。
它的产生受到多种刺激因素的调控，如细菌感染、病毒感染、组织损伤等，这些刺激因素可以激活免疫细胞产生IL-6。
IL-6可以作用于多种细胞靶点，包括免疫细胞、神经系统
细胞、肠道上皮细胞等。
它在免疫系统中起到促炎症和抗
炎症的双重作用。
一方面，IL-6能够促进免疫细胞的增殖
和分化，增强免疫应答；另一方面，IL-6还能够抑制炎症
反应和细胞凋亡，起到保护作用。
IL-6在疾病过程中也发挥着重要的调节作用。
它参与了多
种炎症性疾病的发生和发展，如类风湿关节炎、系统性红
斑狼疮等。
此外，IL-6还与肿瘤的生长和转移、神经系统
疾病的发生和发展等相关。
在临床上，IL-6已经成为某些炎症性疾病的重要治疗靶点。
一些IL-6抗体药物已经被开发出来，用于治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等疾病。
总的来说，IL-6是一个重要的免疫调节因子，它在免疫系
统中起着关键的作用。
对于了解IL-6的功能机制和调控途径，有助于我们进一步理解它在疾病发生和发展中的作用，并提供新的治疗策略。
大鼠白细胞介素-6(IL-6)说明书
大鼠白细胞介素-6（IL-6）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T3pg/ml-120pg/ml使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆及相关液体样本中白细胞介素-6（IL-6）含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠白细胞介素-6（IL-6）水平。
用纯化的大鼠白细胞介素-6（IL-6）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入白细胞介素-6（IL-6），再与HRP标记的白细胞介素-6（IL-6）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的白细胞介素-6（IL-6）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠白细胞介素-6（IL-6）浓度。
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
小鼠 IL-6 Elisa试剂盒
2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；
Beijing BLKW Biotechnology Co., Ltd. Tel:010-57158602/52872342 blkwbio@
3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除；
4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。
Hirano, T. et al. (1986) Nature 324:73.
Beijing BLKW Biotechnology Co., Ltd. Tel:010-57158602/52872342 blkwbio@
ELISA Kit for the Quantitative Analysis of Mouse IL-6
Introduction
Interleukin 6 (IL-6) is a multifunctional protein that plays important roles in host defense, acute phase reactions, immune responses, hematopoiesis and differentiation of nervous system. The IL-6 gene product is a single chain protein with a molecular mass ranging from 21 to 28 kDa, depending on the cellular source.IL-6 proteins are expressed by variety of cells, such as T cells, macrophages, fibroblasts, hepatocytes, vascular endothelial cells. Since IL-6 plays a wide variety of biological functions, it is also known as interferonβ2 (IFN-β2), B cell stimulating factor-2 (BSF-2), hybridoma growth factor, hepatocyte stimulating factor, cytotoxic T-cell differentiation factor, or macrophage & granulocyte inducer (MGI-2A).
Elabscience
（本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断！）产品货号：E-UNEL-M0070产品规格：96T*5/96T*15Elabscience®未包被小鼠白介素6(IL-6)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书Uncoated Mouse IL-6(Interleukin 6) ELISA Kit使用前请仔细阅读说明书。
如果有任何问题，请通过以下方式联系我们：销售部电话************，************技术部电话************具体保质期请见试剂盒外包装标签。
请在保质期内使用试剂盒。
联系时请提供产品批号(见试剂盒标签)，以便我们更高效地为您服务。
用途该试剂盒用于体外定量检测小鼠血清、血浆样本中IL-6浓度。
试剂盒组成及保存试剂体积以实际发货版说明书为准。
相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些，请在使用时量取而非直接倒出。
其他所需试剂ELISA辅助组分试剂盒(Ancillary Reagent Kit，货号：E-ELIR-K001)：包含完成96T*5规格ELISA实验的全套辅助试剂。
或有其他实验需求，可单独购买以下辅助试剂产品：或自行配制指标通用性辅助试剂。
(注：下列配方均为各试剂的基础组分，可根据实验需求和实验结果对配方进行优化)●包被液：1xCBS●封闭液：1xPBS，保护性蛋白●洗涤液：3%Tris●样本稀释液：1xPBS, 保护性蛋白●抗体/酶结合物稀释液：1xPBS, 保护性蛋白●终止液：5%硫酸试验所需自备物品1.酶标仪(450 nm波长滤光片)2.高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL3.37℃恒温箱4.双蒸水或去离子水5.吸水纸6.加样槽样品收集方法(具体处理方法可参考官网：/List-detail-241.html) 1.血清：全血样品于室温放置1小时或2-8℃过夜后于2-8℃，1000×g离心20分钟，取上清即可检测。
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高灵敏小鼠白细胞介素-6（IL-6）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书金益柏试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆样本中白细胞介素-6（IL-6）含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠白细胞介素6（IL-6）水平。
用纯化的小鼠白细胞介素6（IL-6）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入白细胞介素6（IL-6），再与HRP标记的白细胞介素6（IL-6）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的白细胞介素6（IL-6）呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠白细胞介素6（IL-6）浓度。
试剂盒组成：样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA、者柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5.组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。
（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为90pg/mL，60 pg/mL ，30 pg/mL，15 pg/mL，7.5 pg/mL）。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。
在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。
测定应在加终止液后15分钟以内进行。
注意事项：1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
试剂盒性能：1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。
2.批内与批间应分别小于9%和11%检测范围：5 pg/mL -100 pg/mL保存条件及有效期：1.试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月Mouse Interleukin 6Drug NamesGeneric Name：Mouse Interleukin 6（IL-6） ELISA Kit.PurposeThis kit allows for the determination of IL-6 concentrations in Mouse serum, blood plasma, ａnd other biological fluids..Principle of the assayThe kit assay Mouse IL-6 level in the sample, use Purified Mouse IL-6 antibody to coat microtiter plate wells, make solid-phase antibody, then add IL-6 to wells, Combined IL-6 antibody which With HRP labeled , become antibody - antigen - enzyme-antibody complex, after washing Completely, Add TMB substrate solution,TMB substrate becomes blue color At HRP enzyme-catalyzed, reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution ａnd the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm. The concentration of IL-6 in the samples is then determined by comparing the O.D. of the samples to the standard curve.Materials provided with the kitSpecimen requirements1.serum- coagulation at room temperature 10-20 mins，centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.2.plasma-use suited EDTA, citrate or heparinized plasma as ananticoagulant,mix 10-20 mins ,centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.3.Urine-collect sue a sterile container, centrifugation 20-min atthe speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again. The Operation of Hydrothorax ａndcerebrospinal fluid Reference to it.4.cell culture supernatant-detect secretory components, collectsue a sterile container, centrifugation 20-min at the speed of2000-3000 r.p.m. remove supernatant,detect the composition ofcells, Dilut cell suspension with PBS（PH7.2-7.4）, Cellconcentration reached 1 million / ml, repeated freeze-thaw cycles, damage cells ａnd release of intracellular components,centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. removesupernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.5.Tissue samples- After cutting samples, check the weight,add PBS（PH7.2-7.4）, Rapidly frozen with liquid nitrogen, maintainsamples at 2-8℃ after melting,add PBS（PH7.4）, Homogenized by hand or Grinders, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant.Assay procedure1.Dilute ａnd add sample to Standard: set 10 Standard wells on the ELISA plates coated, add Standard 100μl to the first ａnd the second well, then add Standard dilution 50μl to the first ａnd the second well, mix; take out 100μl form the first ａnd the secondwell then add it to the third ａnd the forth well separately. thenadd Standard dilution 50μl to the third ａnd the forth well ,mix ; then take out 50μl from the third ａnd the forth well discard, add 50μl to the fifth ａnd the sixth well ,then add Standard dilution 50μl to the fifth ａnd the sixth well, mix ; take out 50μl from the fifth ａnd the sixth well ａnd add to the seventh ａnd the eighth well, then add Standard dilution 50μl to the seventh ａnd the eighth well ,mix ; take out 50μl from the seventh ａnd the eighth well ａnd add to the ninth ａnd the tenth well, add Standard dilution 50μl to the ninth ａnd the tenth well, mix , take out50μl from the ninth ａnd the tenth well discard（add Sample 50μl to each well after Diluting ,（density: 90 pg/mL,60 pg/mL,30pg/mL,15 pg/mL,7.5 pg/mL）2.add sample：Set blank wells separately （blank comparison wells don’t add sample ａnd HRP-Conjugate reagent, other each step operation is same）. testing sample well. add Sample dilution 40μl to testing sample well, then add testing sample 10μl （sample final dilution is 5-fold）, add sample to wells , don’t touch the well wall as far as possible, and Gently mix.3.Incubate: After closing plate with Closure plate membrane ,incubate for 30 min at 37℃.4.Configurate liquid: 30-fold （or 20-fold）wash solution diluted 30-fold （or 20-fold） with distilled water ａnd reserve.5.washing：Uncover Closure plate membrane, discard Liquid, dry by swing, add washing buffer to every well, still for 30s then drain, repeat 5 times, dry by pat.6.add enzyme：Add HRP-Conjugate reagent 50μl to each well, except blank well.7.incubate：Operation with 3.8.washing：Operation with 5.9.color：Add Chromogen Solution A 50ul and Chromogen Solution B to each well, evade the light preservation for 15 min at 37℃10.Stop the reaction：Add Stop Solution50μl to each well, Stop the reaction（the blue color change to yellow color）.11.assay：take blank well as zero , Read absorbance at 450nm after Adding Stop Solution ａnd within 15min.Important notes1.The kit takes out from the refrigeration environment should bebalanced 15-30 minutes in the room temperature, ELISA platescoated if has not use up after opened, the plate should be stored in Sealed bag.2.washing buffer will Crystallization separation, it can beheated the water helps dissolve when dilute . Washing does notaffect the result.3.add Sample with sampler Each step, And proofread its accuracyfrequently, avoids the experimental error. add sample within 5 min, if the number of sample is much , recommend to use Volley .4.if the testing material content is excessively higher （Thesample OD is bigger than the first standard well ）,please dilute Sample （n-fold）, Please diluente and multiplied by the dilution factor.（×n×5）.5.Closure plate membrane only limits the disposable use, to avoidcross-contamination.6.The substrate evade the light preservation.7.Please according to use instruction strictly, The test resultdetermination must take the microtiter plate reader as a standard.8.All samples, washing buffer ａnd each kind of reject shouldaccording to infective material process.9.Do not mix reagents with those from other lots.。