小鼠转基因研究方法共68页文档
转基因小鼠的构建
转基因小鼠的构建
转基因小鼠的构建主要涉及到显微注射法或利用DNA转座子系统提高转基因的表达阳性率。
以下是具体的步骤：
1.准备阶段：选择适合构建转基因小鼠的受体小鼠，如7~8周龄雌性小鼠，并进行相应的生理调整，
如注射PMSG和HCG。
2.受精卵的获取：通过手术从供体小鼠的输卵管中取出受精卵，并在适当的培养条件下进行培养。
3.转基因操作：在显微镜下，将线性化的外源DNA片段或构建到转座子质粒中的外源待表达的DNA
片段，通过显微注射法直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到小鼠基因组中。
4.受体小鼠的准备：将受体小鼠麻醉后，进行受精卵的移植。
5.转基因小鼠的筛选和鉴定：通过PCR等方法对转基因小鼠进行筛选和鉴定，确认外源基因已经成
功整合到小鼠基因组中，并且能够过量表达。
需要注意的是，转基因小鼠的构建过程需要高度的专业知识和技术，同时还需要遵守相关的伦理和法规。
因此，在进行转基因小鼠的构建前，需要充分了解相关的知识和技术，并遵循相关的规定和指导原则。
《利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠及其检测》范文
《利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠及其检测》篇一一、引言随着生物医学技术的不断发展，转基因动物模型在生物学、医学等领域的应用越来越广泛。
血管内皮生长因子（VEGF）是一种重要的生长因子，对血管生成具有促进作用。
VEGF164是VEGF家族中的一种亚型，具有较高的生物活性。
本文旨在介绍利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠的方法，并对其检测进行详细阐述，以期为相关研究提供参考。
二、材料与方法1. 材料（1）实验动物：选用C57BL/6J小鼠作为转基因实验动物。
（2）质粒：含有VEGF164基因的质粒。
（3）显微操作设备：显微操作仪、显微注射针、显微操作台等。
2. 方法（1）构建转基因载体：将VEGF164基因克隆到适当载体上，构建转基因载体。
（2）显微注射：将构建好的转基因载体显微注射到小鼠受精卵的原核中。
（3）筛选阳性小鼠：通过PCR等方法筛选出阳性小鼠。
（4）繁殖与鉴定：将阳性小鼠进行繁殖，并对后代进行基因型鉴定和表达检测。
三、原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠1. 转基因载体的构建首先，将VEGF164基因克隆到适当的载体上，构建转基因载体。
这一步骤需要使用分子生物学技术，如PCR、酶切、连接等。
2. 显微注射将构建好的转基因载体显微注射到小鼠受精卵的原核中。
这一步骤需要在显微操作仪的辅助下进行，注射针需要精确地定位到受精卵的原核中，将转基因载体注入其中。
3. 筛选阳性小鼠通过PCR等方法筛选出阳性小鼠。
这一步骤需要对注射后的小鼠进行基因组DNA提取，然后进行PCR扩增和检测，以确定是否成功地将VEGF164基因整合到小鼠基因组中。
四、VEGF164转基因小鼠的检测1. 基因型鉴定对繁殖出的后代进行基因型鉴定，确定其是否为转基因阳性小鼠。
这一步骤同样需要进行PCR扩增和检测。
2. 表达检测对转基因阳性小鼠进行表达检测，以确定VEGF164基因在小鼠体内的表达情况。
转基因小鼠研究进展
转基因小鼠的研究进展1 转基因小鼠技术发展以往的转基因技术是将外源基因导入原核细胞或真核细胞来研究基因的表达调控与基因的功能。
但基因在离体单个细胞中的功能并不一定能代表基因在整体中的功能。
因为在一个复杂的动物个体中，众多的基因彼此之间在功能上并不是孤立的，而是相互关联、相互影响的。
而且，一个基因在单一细胞中的表达究竟会对整个机体的生理功能产生什么作用也必须在整体水平来研究。
从60年代开始，生命科学研究人员就试图找到一种恰当的方法，将特定的基因导入发育中的哺乳动物体内，以便研究基因的功能及调控规律。
到70年代中期，几种将外源基因导入早期哺乳动物胚胎的方法逐步建立起来，从而为建立转基因小鼠奠定了基础。
1982年，美国学者Palmiter将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵，所生7只子代小鼠中有6只生长加快，体重明显增加，这就是所谓的“超级小鼠”(supermouse)诞生了。
“超级小鼠”的建立成功轰动了整个生命科学界，科学家们对此表现出浓厚的兴趣，许多实验室竞相开展这方面的研究工作，因此转基因小鼠技术迅速发展，不断完善。
转基因小鼠技术兴起于60年代，至80年代中期逐渐成熟。
其中关键的技术是实现外源基因的导入及整合，这一技术的发展到目前已经历了四个阶段。
1.1第一阶段：实现外源基因的导入1974年，Jaenisch等用显微注射法将SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。
这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。
以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵中的转移，并能遗传给后代。
在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。
这一阶段转基因技术的共同特点是导入的外源基因是随机整合的。
这种随机整合的外源基因可能是单拷贝的，也可能是多拷贝的。
外源基因整合的结果可能会有几种情况出现：①能够有效地表达，且不影响动物的发育以及正常的生理功能。
一种过表达nlrp3的转基因小鼠模型及其构建方法和应用
一种过表达nlrp3的转基因小鼠模型及其构建方法和
应用
一种过表达Nlrp3的转基因小鼠模型及其构建方法和应用，涉及基因工程技术、动物模型构建及应用，特别涉及一种过表达Nlrp3的转基因小鼠模型及其构建方法和应用。
转基因小鼠模型构建方法，包括以下步骤：
1. 设计并合成包含目的基因Nlrp3的DNA序列的质粒载体；
2. 将合成的质粒载体注射到小鼠受精卵中；
3. 将注射了质粒载体的受精卵移植到代孕母鼠体内；
4. 代孕母鼠产下幼崽后，提取幼崽的基因组DNA进行PCR检测，筛选出
转基因小鼠。
通过上述方法，可以成功构建出过表达Nlrp3的转基因小鼠模型。
该模型可以用于研究Nlrp3基因在疾病发生和发展中的作用，为疾病治疗和药物研发提供有价值的实验动物模型。
同时，该模型还可以用于评估和筛选针对
Nlrp3基因的治疗方法和药物。
以上内容仅作参考，您可以通过相关资料进一步了解有关该技术的详细信息。
转基因小鼠在生命科学中的研究进展毕业论文
转基因小鼠在生命科学中的研究进展毕业论文1 转基因小鼠技术概述自其诞生以来的30多年里，转基因动物技术经过世界各国生物学家们的不懈努力，已经成为一项非常成熟的技术手段，极大的促进了相关生命科学领域研究进展，至今已经取得了辉煌的成就并且在不断得到改进和发展[2]。
转基因技术运用于动物育种的研究始于70年代，经过近30多年的研究和不断发展，取得了突破性进展。
1974年Jaenish和MintzIZI[3]通过微注射法向移植前的小鼠注射SV40病毒DNA，后在实验小鼠部份细胞中检测到该病毒的DNA，首次成功获得转基因小鼠，虽然该转基因小鼠传代的几率小。
随着科学技术的不断进步，在1976年，Jaenish又通过反转录病毒感染小鼠的胚胎，将目标基因组整合到实验鼠中得到了能传代的转基因小鼠；1980年,Gordon等[1]首先用受精卵原核注射法,将疱疹病毒基因SV40DNA段和PBR32DNA段分别注射到小鼠原核期的胚胎中,获得了相应的转基因小鼠。
1982年美国科学家Palmiter将大鼠生长激素基因导人小鼠受精卵后，获得了首批被称为“硕鼠”的转基因动物[4]。
1985年，Hanahan等将SV40T抗原基因与大鼠胰岛素启动子(RIP)体外整合后导入小鼠早期胚胎细中，构建了SV40T抗原基因转基因小鼠，在小鼠体内检测到特异性T抗原，T抗原表达时间的早晚影响转基因小鼠对T抗原的免疫应答：胚胎早期表达T抗原的小鼠对SV40T抗原发生免疫耐受，胰腺组织正常；胚胎晚期表达T抗原的小鼠体内产生抗自身胰岛B细胞的抗体，出现自身免疫性糖尿病[5]。
近年来，随着现代分子生物学和转基因动物技术的日臻完善，转基因小鼠及其他转基因动物逐渐成为现代医学及其他学科研究中的一个十分重要的工具。
纵观此间发展历程，转基因动物带来的不仅仅是一种全新的药物生产模式，极大地降低生物药品的成本和投资风险，为人类社会带来了新的经济增长点，如今的动物乳腺反应器生产的药物占所有基因工程药物的95％，带来了巨大经济效益，潜藏巨大的市场价值，相信随着应用的不断革新，其必将逐渐形成具有高额利润的新兴产业。
转基因小鼠制备
1. 基因准备2. 实验用鼠的饲养小鼠品系的选择需结合实验要求，如果必须使用规定的品系，则可按规定或特定要求进行。
用于转基因实验的小鼠根据其作用可分为供体鼠、受体鼠、结扎公鼠、种质公鼠。
供体鼠是提供受精卵的母鼠，为了得到更多的受精卵，通常要对其进行激素注射；受体鼠是用于胚胎移植的假孕母鼠，以后生育转基因小鼠；结扎公鼠是有交配能力，但没有繁殖生育能力的公鼠；种质公鼠用于与供体母鼠配种。
本项试验将全部应用C57/BL6 ×DBA杂交的F1代小鼠。
转基因实验需要定期提供相当数量的母鼠作为受精卵供体和假孕母鼠，以及一批相对稳定的正常公鼠与结扎输精管的公鼠（简称结扎公鼠）。
这些鼠可由实验动物中心提供，在实验前做好这些鼠与转基因相关的管理与饲养。
2.1 供体鼠一般说来，杂交子一代鼠较纯系鼠产卵多，受精卵显微注射后两细胞分裂率较高，产仔较好。
作为供体母鼠的种系，自然产卵数与超排卵数均应较高。
一般用4～6周产仔更多但卵细胞膜脆性较大，在操作过程中易破裂；而6周以后母鼠产卵逐渐减少。
2.2 受体鼠（即假孕母鼠）母鼠在正常发情期与结扎公鼠交配即产生假孕母鼠，假孕母鼠作为显微注射后受精卵的受体及其后代的养母。
这种母鼠以6周龄至5个月龄较适宜，体重最好大于20克。
母鼠一般4～5天为一个发情周期，因此在1个较大的母鼠群中约有20～25％进入发情期，如进入发情母鼠数与结扎公鼠数相近，可将每个公鼠笼内放1只母鼠；如母鼠数显著多于公鼠，可于每个公鼠笼内放2～3只母鼠。
也可不考虑发情期，随机将每个公鼠笼内放2～4只母鼠。
一般准备较多的假孕母鼠以防移卵失败。
未使用的假孕母鼠可在阴栓产生两周后重复使用。
2.3 结扎公鼠结扎公鼠与母鼠交配以后产生假孕母鼠和供体母鼠。
用作母鼠假孕的结扎公鼠需8周龄以上，对种系无特殊要求。
在作正式实验以前，每只结扎公鼠至少需要和3只母鼠交配，使母鼠只产生阴栓而均不怀孕，方可投入正式实验。
结扎公鼠可每晚与母鼠交配，但最好是隔日一次。
《利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠及其检测》范文
《利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠及其检测》篇一一、引言随着生物医学技术的不断发展，转基因动物模型在生物学、医学和药理学等领域的应用越来越广泛。
其中，原核显微注射技术作为一种有效的基因编辑手段，已被广泛应用于制备转基因小鼠等动物模型。
血管内皮生长因子（VEGF）是一种重要的生长因子，能够促进血管生成，对于治疗多种疾病具有潜在的应用价值。
因此，本文旨在探讨利用原核显微注射技术制备VEGF164转基因小鼠的方法及其检测技术。
二、实验材料与方法1. 实验材料（1）小鼠胚胎干细胞；（2）VEGF164基因；（3）显微操作设备；（4）培养基等实验试剂。
2. 实验方法（1）构建VEGF164转基因载体：将VEGF164基因插入到载体中，构建成转基因载体。
（2）显微注射：将转基因载体显微注射到小鼠受精卵的原核中。
（3）胚胎移植：将注射后的胚胎移植到假孕母鼠体内，让其代孕。
（4）筛选阳性小鼠：通过PCR等技术筛选出阳性小鼠。
（5）检测VEGF164的表达：通过Western blot、免疫组化等技术检测VEGF164在小鼠体内的表达情况。
三、实验结果与分析1. 转基因小鼠的制备通过显微注射技术，成功将VEGF164基因导入小鼠受精卵中，并成功获得了转基因小鼠。
经过胚胎移植和筛选，最终得到了阳性小鼠。
2. VEGF164的表达检测通过Western blot和免疫组化等技术，检测了VEGF164在小鼠体内的表达情况。
结果显示，转基因小鼠的血管内皮细胞中VEGF164的表达明显高于野生型小鼠，表明VEGF164基因已经被成功表达。
3. 分析与讨论本实验利用原核显微注射技术成功制备了VEGF164转基因小鼠，并通过多种技术手段检测了VEGF164的表达情况。
实验结果表明，该技术具有较高的可行性和可靠性，为进一步研究VEGF164的功能和作用机制提供了重要的动物模型。
同时，该研究也为其他转基因动物的制备提供了重要的参考。
两种转基因小鼠生长繁殖方法的研究
！ ＝ 箜
实
验
室
科
学
第１ ６卷
第 ３期
２ ０ １ ３年 ６月
ＣＮ１ ２—１ ３ ５ ２ ／Ｎ
Ｌ ＡＢＯＲＡＴＯＲＹ Ｓ Ｃ ］ ＥＮＣＥ
Ｖｏ １ ． １ ６ Ｎｏ ． ３ Ｊ ｕ ｎ ． ２ ０ １ ３
两 种 转 基 因小 鼠生 长 繁殖 方 法 的 研 究
转 基 因小 鼠 脑 片 检测 可 见 在 不 同的 年 龄 段 均 有 相 应 荧 光 蛋 白 的表 达 。 结 论 ：在 Ｓ Ｐ Ｆ环 境 下 采 用 近亲 交 配 繁殖 法 培 育 转 基 因 小 鼠是 成 功 的 。 关 键 词 ：转 基 因小 鼠 ；生 长 繁 殖性 能 ；血 液 生 化 指 标 ；荧 光 蛋 白 中 图分 类 号 ： Ｒ 一 ３ ３ 文献标识码 ： Ａ ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ ２ — ４ ３ ０ ５ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ３ ． ０ ０ ８
席 晓霞 ，白德 成 ，魏虎 来 ，吴 润
（ １ ． 兰州 大学 基 础 医学院 ，甘 肃 兰州
摘
７ ３ ０ ０ ０ ０；２ ． 甘肃 农业 大 学 动 物 医学 院 ，甘 肃 兰 州 ７ ３ ０ ０ ７ ０ ）
要 ： 目 的 ：对 两 种 转 基 因 小 鼠 的 生 长 繁 殖 方 法 进 行 研 究 。 方 法 ： 在 Ｓ Ｐ Ｆ环 境 下 ，用
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｏ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｅ ： Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｏ ｎ ｇ ｒ ｏ ｗ ｔ ｈ ａ ｎ ｄ ｒ ｅ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｇ Ｆ Ｐ ａ ｎ ｄ Ｙ Ｆ Ｐ ｌ ｆ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｔ ｍ ｉ ｃ ｅ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ： Ｉ ｎ
转基因小鼠原理
转基因小鼠原理
转基因小鼠是通过将外源基因导入小鼠的基因组中，使其具备某种特定的基因表达或功能。
下面将介绍转基因小鼠的原理。
转基因小鼠的制备主要包括以下步骤：
1. 外源基因的选择：根据研究的需要，选择具有特定表达或功能的外源基因。
这些基因可以来自于同一物种的其他个体，也可以来自于不同物种。
外源基因通常与标记基因（如荧光蛋白）连在一起，以便在小鼠体内进行检测或追踪。
2. 载体构建：将外源基因插入到合适的载体中。
这个载体通常是一个环状DNA，能够在细菌中进行复制。
载体还包括选择
性标记基因，用于筛选带有外源基因的细菌。
3. 载体的导入：将构建好的载体导入到干细胞中。
这一步通常通过细菌转化或化学方法实现。
被导入的载体被融合到小鼠的染色体中，成为其基因组的一部分。
4. 选代与筛选：经过导入外源基因的干细胞进一步进行培养和筛选，确保外源基因被稳定地遗传给后代。
5. 建立转基因小鼠系：通过转基因小鼠的选择性繁殖，建立稳定的转基因小鼠系。
这些小鼠在其体细胞中都带有外源基因。
通过以上步骤，转基因小鼠就能够被制备出来。
这些小鼠可以被用于研究基因与某种生理或疾病相关的功能和表达。
转基因
小鼠的制备对于科学研究、药物开发和疾病治疗等领域具有重要意义。
可诱导性组织特异性转基因小鼠构建技术原理
可诱导性组织特异性转基因小鼠构建技术原理
制作转基因小鼠最常用的一种方法是DNA原核显微注射。
DNA 原核显微注射是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。
使用PiggyBac系统DNA显微注射，制备的转基因鼠基因表达阳性率为常规质粒DNA显微注射的2倍以上！
可诱导性/组织特异性转基因小鼠
将构建的广泛表达启动子-lox-stop-lox-转基因载体通过显微注射制备组织特异性转基因小鼠模型，转基因在正常情况下并不表达，只有与相应的组织特异性表达Cre/CreERT2小鼠杂交后，因Stop终止序列在特定的组织中被去除，从而达到转基因在诱导性/特定组织中特异性表达的目的。
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Conventional Knock out
Mutation of Lmx1b in mice
In forelimb, dorsal feature (hair follicles) is replaced by ventral one (footpads).
(Chen et al., Nat. Genetics, 2019)
containing both neo and tk
Selection for neor positive
Selection for TK negative
ES cells with homologous recombination
4 、将基因敲除ES细胞注射入囊胚，形成嵌合胚胎，得到嵌合 体小鼠，而后筛选培育阳性子代小鼠。
negative selection
1. HSV-tk：单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因，该基因产物
可分解单核苷酸类似物(ganciclovir)生成毒性产物，产生自 杀效果
同源重组时：Tk-基因丢失，ES细胞存活 随机整合时：Tk-基因存在，ES细胞死亡
2. DTA (diphtheria fragment A) : 不用给药
Endonuclease technology for genome engineering. Two components:
(1) a guide RNA (2) an endonuclease, CRISPR associated (Cas) nuclease, Cas9.
Other methods in gene Knock out
ENU-based mutagenesis
N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) was developed as an efficient mutagen that would cause point mutations and small deletions in mice.
It easy to design closely spaced DNA markers for mapping of mutations.
The Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR): RNA-Guided
基因敲除的基本程序
1 、构建打靶载体 Targeting vector
1）同源序列 Homologous arms 2）打靶载体常含两种筛选标志
Neor HSV-tk
positive selection neor ：新霉素抗性基因，neor基因存在于打靶载体内，当
重组（同源或随机整合）后，ES细胞能在含新霉素G418的 培养液中生长
Cre mice 转基因小鼠，Cre在特定细胞内 表达
同时表达目的基因（A）和Cre的 细胞内的A基因被敲除，其他细胞 表达的A基因不受影响
Raphe nuclei-specific deletion of Lmx1b
(functional Cre examination with Rosa26 reporter mice )
2、将载体导入ES细胞
Targeting vector introduced by electroporation
Targeting gene
Homologous recombination
3. 筛选进行了同源重组的ES细胞
ES Cells
Recombinants with random insertion-
based
在体 in vivo与离体 in vitro 描述性报告 vs 机理研究报告
研究设计：假说(可能性)—验证—总结(论文)
小鼠基因敲除和转基因
这两项技术是用来制备目的基因失活和表达的小鼠。 优势：在体研究基因的功能。
应用和意义：
– 使得遗传学、肿瘤学、免疫学、发育生物学等学科取得 了惊人的进步，这些研究潜在的商业性价值不可估量。
基因敲除（knock out ）和基因敲入（ knock in）
KO过程也称基因打靶(gene targeting)，利用 DNA同源重组，在基因组中的某一特定部位进 行定点的基因置换，用无功能基因替换目的 基因或Delete目的基因。
根据需要（如验证A与B在功能上有某种关 联），在敲除基因A时，将有功能的基因B放 在A基因的位置，即A是KO，B是Knock in。
CreER位于胞浆内，不具有活性；在tamoxifen存在情况下，转位入核发挥作用。
(Song et al., PlosOne)
Lmx1b is required for 5-HT expression in Adult Brain
5-HT immunostaining tph2 immunostaining
Lmx1b is essential for development of 5-HT+ neurons
(Ding et al., Nat. Neurosci., 2019)
Conditional knock out (CKO) (Tissue- or cell type-specific)
条件
Floxed miceபைடு நூலகம்目的基因（A）被两个LoxP位点包绕
(Dai et al., PNAS, 2019)
Mating
viable
CKO mice lose essentially all 5-HTergic neurons in the brain
Time-control CKO
(Dai et al., J Comp Neurol, 2019)
Generation of Pet1-CreER mice
Transgene and gene knockout in studying gene functions
丁玉强
dingyuqiangvip.163
研究基因功能的两个策略
功能缺失(Loss of function)： KO, CKO, RNAi 获得功能(Gain of function)：Transgenic, virus-