杜仲组织培养的研究

杜仲组织培养的研究作者：袁云香来源：《湖北农业科学》2012年第02期摘要：为了筛选出杜仲（Ｅｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓ）组织培养的最优培养条件，主要从外植体的选择、基本培养基、植物激素、光照条件、其他理化条件等方面对杜仲愈伤组织的诱导、增殖及分化培养的影响进行了综述，分析了杜仲组织培养过程中常见的问题并提出了解决方案，以期为杜仲快繁体系的建立提供理论依据。

关键词：杜仲（Ｅｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓ）；组织培养；诱导；增殖；再分化中图分类号：Ｓ５６７．１＋９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）02－0228-04Ｒｅｓｅａｒｃｈ oｎＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅｏｆＥｕｃｏｍｍｉａ uｌｍｏｉｄｅｓＹＵＡＮＹｕｎ－xｉａｎｇ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＷｅｉｎａｎＴｅａｃｈｅｒｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｉｎａｎ７１４０００，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｓｅｌｅｃｔｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆＥｕｃｏｍｍｉａ uｌｍｏｉｄｅｓｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ，ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ conditions for Ｅ. uｌｍｏｉｄｅｓｃａｌｌｕｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅ the aspects of ｃｈｏｉｃｅｏｆｅｘｐｌａｎｔｓ，ｂａｓｉｃｍｅｄｉｕｍ，ｐｌａｎｔｈｏｒｍｏｎｅｓ，ｌｉｇｈｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｎｄｏｔｈｅｒｐｈｙｓｉｃａｌａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＴｈｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｃｏｍｍｏｎｐｒｏｂｌｅｍｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｏｆＥ. uｌｍｏｉｄｅｓＯｌｉｖｅｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ．ＴｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｐｒｏｖｉｄｅｄａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｏｎＥ. uｌｍｏｉｄｅｓｒａｐｉｄｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓ；ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ；ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ；ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ杜仲（Ｅｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓ）系杜仲科杜仲属（Ｅｕｃｏｍｍｉａ）植物，为我国特有的经济树种，是一种名贵的药用植物，特别是对血压有双向调节作用，被认为是世界上高效天然降压药物［１］。

杜仲还是一种胶源植物，杜仲胶具有良好的绝缘性、抗酸碱性、热塑性和形状记忆等特点，受到世人的普遍重视［２］。

因此，杜仲作为用材、水土保持、绿化的经济树种，集“一林、一胶、两材、三效益”于一体，应用前景广阔［３］。

由于杜仲是雌雄异株植物，授粉较为困难，种子产量有限，加之自然环境的破坏和长期无计划的采挖，以及扦插繁殖的技术问题还未得到完全解决，使得杜仲的供应十分困难，生产中种苗的数量缺口很大。

组织培养是解决种苗快繁的有效方法之一［４］。

杜仲是组织培养较为困难的一种木本植物。

目前对杜仲愈伤组织的诱导、增殖方面的研究已有一些报道［５］。

本研究在前人工作的基础上，综述了在不同时间采集，以杜仲幼叶、嫩茎及种子无菌苗的下胚轴、子叶、真叶、根为外植体愈伤组织的诱导、增殖、分化及生根的培养基、激素、光照等理化条件，目的在于找出杜仲的愈伤组织诱导、增殖继代、分化及生根的最优培养条件［６］，以期为大规模培养生产杜仲及次生代谢产物奠定基础。

１外植体的选择高等植物几乎所有的器官和组织都可以作为外植体，在合适的时间，选择适宜的苗龄、合适部位的外植体是有效诱导愈伤组织的关键［６］。

同类型的外植体对于诱导产生愈伤组织的难易程度不同，主要是不同的外植体其内源激素是有差别的［７］。

杜仲组织培养多采用植株的幼叶、嫩茎及种子无菌苗的下胚轴、子叶、真叶、根为外植体。

其中，使用频率最高的为茎尖［８］。

１．１外植体的种类据罗丽等［７］的报道，杜仲各种外植体的诱导出愈能力比为下胚轴＞子叶＞幼叶，只要培养基中激素配比适宜，杜仲各类外植体均能诱导产生愈伤组织。

另据李琰等［９］报道，以杜仲无菌苗作为外植体不仅出愈率高，愈伤组织生长旺盛，且不受季节影响，其中以下胚轴作外植体时，诱导率和生长状况最佳；以幼叶作为外植体时，污染小，便于消毒，出愈率也高；而对于茎，虽然诱导率高，但诱导出的愈伤组织不利于继代，且污染率高，诱导率有下降趋势。

此外，邱晓芳等［１０］用杜仲无菌苗不同组织作为外植体，得出与上胚轴相比子叶更不易产生褐化，较容易进行稳定的继代；子叶和上胚轴均有利于诱导出疏松的愈伤组织，而上胚轴所诱导的愈伤组织质地非常疏松似乎更有利于作细胞悬浮培养。

可见，以胚轴作为外植体不仅诱导率高且不易褐化，愈伤组织生长茂盛稳定，是最优选择。

１．２外植体大小、接种方式及采样时期在杜仲组织培养过程中，不同接种方式的出愈率明显不同。

李琰等［９］的研究表明，对不同外植体：将真叶、子叶切成０．５ｃｍ×０．５ｃｍ方块，下胚轴和根切成０．７ｃｍ长的段进行接种；将幼茎切成０．７ｃｍ长段，幼叶切成０．５ｃｍ×０．５ｃｍ的方块接种方式为佳。

其中以幼茎为外植体，茎段的大小和接种方式以０．７ｃｍ长度横放方式诱导效果最好。

外植体的采用时期：田间材料幼叶取样时间以３月中旬为好，幼茎的取材时间以４月中旬前为最佳。

２培养基的选择培养基是植物组织培养的物质基础，也是愈伤组织能否成功的重要因素之一，愈伤组织能否形成，一方面取决于培养基材料本身的性质，另一方面也取决于培养基的种类和成分，因此要根据不同的外植体以及不同的培养目的选择合适的培养基［６］。

杜仲组织培养常用的培养基有ＭＳ、Ｂ５、ＬＳ、Ｗｈｉｔｅ、１／２ＭＳ、Ｎ６等，其中以ＭＳ使用最多，初代培养中占８３．３％，继代培养也有６６．７％，而６６．７％的生根培养基采用的是１／２ＭＳ［８］。

２．１诱导培养基研究表明，Ｂ５培养基更有利于松散愈伤组织的形成，更适合作继代或悬浮培养；而ＭＳ培养基对子叶及上胚轴愈伤组织的诱导率均为最强，且不易于褐化；相比之下１／２ＭＳ培养基诱导的愈伤组织结构致密、生长缓慢、褐化严重，不利于诱导出疏松的愈伤组织［１０］。

２．２增殖培养基关于继代培养的研究，何泼等［１１］在ＭＳ、Ｂ５、ＬＳ、Ｗｈｉｔｅ、１／２ＭＳ、Ｎ６培养基上进行继代培养，结果表明，ＭＳ培养基虽然在诱导时效果很好，但它不适于愈伤组织的继代培养，愈伤在接种到该培养基上后生长缓慢，增长率较低，有的接种后不久会褐化死亡；而Ｂ５培养基最适合于愈伤组织的继代培养，继代后愈伤组织生长旺盛，增长率最高；此外Ｎ６培养基的效果也较好。

但据黄勇等［12］报道，ＭＳ培养基更适合于杜仲愈伤组织的继代培养，这可能是由于培养基上所加生长调节物质有所不同，或者与外植体种类也有一定的关系。

另有李琰等［１］以ＭＳ、ＬＳ、Ｂ５、Ｎ６、Ｈ、Ｎｉｔｓｃｈ、Ｗｈｉｔｅ、ＷＰＭ为基本培养基，进行不同培养基对杜仲嫩茎及幼叶愈伤组织诱导的研究；以ＭＳ、ＬＳ、Ｂ５、Ｎ６、Ｈ、Ｎｉｔｓｃｈ、Ｗｈｉｔｅ、１／２ＭＳ为基本培养基，进行不同培养基对杜仲嫩茎及幼叶愈伤组织继代培养的研究。

结果表明，ＭＳ培养基有利于杜仲幼茎愈伤组织的诱导，而Ｂ５培养基不仅对叶的愈伤组织诱导有利，对茎和叶愈伤组织的继代培养也是最理想的。

３激素的选择３．１愈伤组织的诱导和增殖试验表明，没有添加植物激素的培养基上，杜仲愈伤组织继代生长很差，单独使用ＮＡＡ的生长速度不如ＮＡＡ与ＢＡ配合使用。

ＢＡ的最优使用量范围为１．０～３．０ｍｇ／Ｌ，ＮＡＡ的最优使用量范围为０．５～４．０ｍｇ／Ｌ。

比较可见，在以ＭＳ培养基（０．８％琼脂＋３％蔗糖）上附加２．０ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．５ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ有利于杜仲愈伤组织的诱导；以Ｂ５培养基（０．８％琼脂＋３％蔗糖）上附加１．０ｍｇ／ＬＮＡＡ＋１．５ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ，有利于愈伤组织的增殖［１１］。

据黄勇等［１２］的报道，以杜仲幼茎为外植体，接种于附加ＮＡＡ、２，４－Ｄ、ＫＴ、６－ＢＡ及其组合的ＭＳ培养基上，均能产生愈伤组织，但附加２，４－Ｄ的培养基上愈伤组织容易褐化，其他均可正常生长，附加０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．５ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋１．０ｍｇ／ＬＫＴ的培养基适合愈伤组织的增殖培养。

３．２芽的诱导和增殖芽的诱导形成使用的激素有ＢＡ、ＮＡＡ、ＩＢＡ、ＢＡＰ、ＩＡＡ、ＫＴ等，ＢＡ和ＮＡＡ 2种激素在从愈伤上诱导芽时通常需要混合使用，ＢＡ的最优使用量范围为０．５0～２．２５ｍｇ／Ｌ，ＮＡＡ的最优使用量范围为０．０５～０．５0 ｍｇ／Ｌ［８］。

根据李岩等［５］的报道，在含有０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．８ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ的ＭＳ培养基中，杜仲胚轴可直接诱导产生不定芽，诱导率达到４７％，为较优培养方案。

李琰等［2］以ＭＳ为基本培养基，在添加０．０５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．５ｍｇ／ＬＢＡ或者０．１ｍｇ／ＬＩＢＡ＋０．５ｍｇ／ＬＢＡ的培养基中，腋芽的诱导和生长较好；继代增殖培养以０．５ｍｇ／ＬＢＡ＋０．０１ｍｇ／ＬＮＡＡ的ＭＳ培养基丛芽数量最多，增殖系数最高。

可见，不同浓度的ＢＡ和ＮＡＡ混合使用对芽的诱导与增殖有显著促进作用。

３．３根的诱导杜仲生根培养所需激素有ＮＡＡ、ＩＢＡ、ＧＡ等３种激素，以ＩＢＡ的效果最好，其适合浓度为１．５～２．０ｍｇ／Ｌ［８］。

据报道，只用Ｗｈｉｔｅ培养基，不添加激素也可以生根［８］。

李岩等［５］研究表明，在生根培养中，附加１．５ｍｇ／ＬＩＢＡ＋２０ｇ／Ｌ蔗糖的１／２ＭＳ培养基效果最好，生根率达到９１．７％。

另有王东良等［４］报道，以１／３ＭＳ附加０．１ｍｇ／ＬＫＴ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ也有生根现象，生根率１８％。

比较可知，采用１／２ＭＳ培养基材料的生根率明显高于采用１／３ＭＳ培养基材料的生根率，且较低浓度的盐离子有利于根的分化。

４光照条件光对愈伤组织的生长既有促进作用也有抑制作用，杜仲的愈伤组织培养中，光照条件以１２ｈ光照１２ｈ暗培养最好。

黑暗中和１２ｈ光照条件下愈伤组织的增长量相似，但颜色差异较大。

在生理生化特征和分化能力上这些形态不同的愈伤组织也有很大的差异，其在次生代谢产物的含量方面是否有差异尚需进一步研究［１３］。

何泼等［１１］分别采取黑暗２４ｈ／ｄ、光照１２ｈ／ｄ、自然光３种不同光照方法进行光照对愈伤组织增长影响的试验，结果表明，３种不同光照方式下愈伤组织的增长率并无太大差异，但光照１２ｈ／ｄ条件下培养的愈伤组织更易做进一步的继代培养，而连续黑暗培养２４ｈ／ｄ时的增长率略低。

另外光照对杜仲愈伤中次生代谢物的积累有明显影响，杨振堂等［１４］报道，光照有利于愈伤中杜仲胶的积累，与自然光下相比，杜仲胶的总生产率较高。