糖化酶
我国糖化酶的研究概况
糖化酶是世界上生产量最大应用范围最广的酶类，介绍了糖化酶的结构组成、特性、生产、提取、活力检测以及提高酶活力的研究。
主要的内容包括：一、糖化酶的简介
糖化酶是应用历史悠久的酶类，1 500年前，我国已用糖化曲酿酒。
本世纪2O年代，法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲，并用于酒精生产。
50年代投入工业化生产后，到现在除酒精行业，糖化酶已广泛应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面，是世界上生产量最大应用范围最广的酶类。
糖化酶是葡萄糖淀粉酶的简称(缩写GA或G)。
它是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶。
其主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解a一1，4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像B一淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成B—D一葡萄糖。
对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a一1，6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。
糖化酶也能微弱水解a一1，3连接的碳链，但水解a一1．4糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。
二、糖化酶的结构组成及分类
糖化酶在微生物中的分布很广，在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得，从细菌中也分离到热稳定的糖化酶，人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶。
不同来源的淀粉糖化酶其结构和功能有一定的差异，对生淀粉的水解作用的活力也不同，真菌产生的葡萄糖淀粉酶对生淀粉具有较好的分解作用。
糖化酶是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在60 000 到1 000 000间，通常碳水化合物占4％ 18％。
但糖化酵母产生的糖化酶碳水化合物高达80％，这些碳水化合物主要是半乳糖、葡萄糖、葡萄糖胺和甘露糖。
三、糖化酶的特性
1、糖化酶的热稳定性
在糖化酶的热稳定性机理及筛选热稳定性糖化酶菌株上。
工业上应用的糖化酶都是利用它的热稳定性。
一般真菌产生的糖化酶热稳定性比酵母高，细菌产生
的糖化酶耐高温性能优于真菌。
在50％的淀粉溶液中，70 ℃下酶完全稳定，而且在10％酒精液中仍很稳定。
即使在85℃c下处理l h其酶活性仍保持50％，这种酶不受Ca ，EDTA和α-，β-，γ-环状糊精的影响。
2、糖化酶的pH稳定性
一般糖化酶都具有较窄的pH值适应范围，但最适pH一般为4.5～6.5。
不同微生物菌株产生的糖化酶其耐热性、pH稳定性各不相同。
真菌、细菌产生的糖化酶由于耐热性较高，巴氏灭活处理不能使酶失活，在啤酒生产中易影响终产品的风味。
3、糖化酶的底物特异性
糖化酶对底物的水解速率不仅取决于酶的分子结构，同时也受到底物结构及大小的影响。
许多研究表明，碳链越长，亲和性越大。
但是各糖化酶组分对这些生淀粉的作用能力均小于对可溶性淀粉的作用能力，估计作用能力均降低与酶对底物作用的Km值上升有关。
同时也表明了糖化酶对底物的亲和力，除了与酶本身的结构有关外，还与寡糖链本身的长度有关。
四、酶的发酵生产
1 糖化酶产酶菌种
主要是霉菌，我国多用红曲霉、黑曲霉以及根霉。
根霉以固体发酵为主，红曲霉和黑曲霉多以深层液体发酵生产。
2 生产方法
2.1 黑曲霉固体发酵法
工艺流程：
试管菌种一三角瓶款曲扩大培养一帘子曲种一通风制曲一成品。
2.2 液体深层发酵法
工艺流程：
试管斜面种子一种子扩大培养一发酵一过滤一浓缩一千燥一粗酶剂。
发酵用基质：碳源为玉米粉、甘薯粉等，有机氯源常用玉米浆、豆饼粉和酵母膏等，常用的无机氯源(NH4)2S04、NH4N03和NH3等，无机盐添加MgS04“7H20、KH2PO4等。
菌种不同，产生糖化酶的最适pH值也不同，黑曲霉为4．0～5．0，用黑曲霉生产糖化酶一般控制温度30℃～35℃。
五、糖化酶成品的提取工艺
1、成品糖化酶可分为液体酶和固体酶2种，而固体酶的制备方法又可分为盐析
法、有机溶剂沉淀法和附吸法等，采用一条合理的提取工艺，可制备系列酶产品以满足不同行业的需求及降低成本。
具体流程如下：
2、目前国内对液体酶产品采用的浓缩方法有2种，一种为依靠热源来蒸发产品中的水分。
另一种为利用渗透膜超滤除去产品中的水分。
比较上述2种方法，前者设备投资大、耗能多；而后者投资少、耗能低，且操作简单、清洗方便、维修及更换成本低，产品收率高。
渗透膜超滤浓缩方法，絮凝工艺是提取工艺中最关键的一步，直接决定板框过滤等工序的工作与产品的质量。
渗透膜超滤浓缩法流程如下：
六、糖化酶活力测定方法
目前检测糖化酶活力最普遍的方法是用淀粉作底物，通过测定被酶分解产生葡萄糖的含量来定量分析糖化酶的活力。
但针对一些特殊情况还有另外一些方
法，如复合糖化酶中作为底物的淀粉同样能被其他类型酶制剂所分解，要是用麦芽糖作底物，相比淀粉底物方法而言，麦芽糖只能被糖化酶专一分解。
还有在筛选高活力糖化酶菌株时，采用Starch—PAGE电泳活性染色法，就可既简便、准确、灵敏，又可节约大量试剂。
1、用淀粉底物法测定糖化酶活力
1.1方法原理
糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4葡萄糖苷键生成葡萄糖。
葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力。
1.2 酶活力定义
lg固体酶粉（或1mL液体酶)于40℃、pH4.6的条件下，l h分解可溶性淀粉，产生lmg葡萄糖，即为一个酶活力单位，以U／g(U／mL)表示。
2、用麦芽糖底物法测定糖化酶活力
2.1 方法原理
糖化酶水解麦芽糖生成D-葡萄糖。
生成的葡萄糖可通过与葡萄糖脱氢酶反应而测得，葡萄糖脱氢酶（GlucDH)试剂中加入变构酶可将α-D-葡萄糖转化成β-D-葡萄糖。
在GlucDH的作用下，β-D-葡萄糖与NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)发生反应生成NADH，后者即等于葡萄糖初始浓度，可用于分光光度法在340nm 测定其数值。
2.2 酶活力定义
麦芽糖20 eeL，pH4．30，反应温度37℃，反应时间30min下，每分钟裂解1 p,mol麦芽糖所需酶量。
3、快速检测糖化酶活力的电泳活性染色方法
根据糖化酶能水解淀粉的性质，采用Starch—PAGE，在分离胶中加入淀粉作为糖化酶的作用底物，电泳结束后，在醋酸钠缓冲液中浸泡适当时间，使糖化酶所在部位胶板中的淀粉被酶解，其余部分的淀粉依然存在，碘液染色后，糖化酶存在的部位是无色透明的，没有被水解的部位被染成蓝色。
经实验证明胶板中的淀粉浓度6％，醋酸钠的浸泡时间3 h-4 h，碘染时间1 min为宜。
采用Starch—PAGE电泳活性染色筛选高活力糖化酶菌株，活性染色区带的透明程度与酶液的活力呈正相关性，区带越透明，表明酶活力越高。
七、提高糖化酶活力的研究
几十年来我国科研工作者为提高糖化酶的活力进行了不懈的努力，常规的物理及化学诱变的方法仍然是方便有效的途径。
主要成就有：
1、黑曲霉AN一149菌进行自然分离、紫外线和NTG的复合诱变处理，得到了一株高产糖化酶的菌株WG-93，经30L发酵罐试验，酶活力达29 kU／mL（糖化酶生产发酵水平为12 kU／ml)。
2、对生淀粉糖化菌黑曲霉S一1原生质体采用(k1=260 am，入：=266 nm)能量为8 n1J的激光直接照射，得到高酶活力的生粉糖化酶突变株，比出发株酶活力平均提高37．4％，最高突变株酶活力达到74．5 U／L，比出发株提高91％。
3、以黑曲霉523原生质体为对象，经激光、紫外线和亚硝基胍复合诱变，选育出生淀粉糖化酶高产突变株黑曲霉NL一3，其生淀粉酶活力为156 U／mL。
八、糖化酶研究的展望
虽然糖化酶的研究已经达到很高的水平了，但是仍有许多问题尚待进一步探索。
如：
糖链在糖化酶活性、稳定性及构象状态中所起的作用，进一步阐明糖化酶的多型性原因及糖化酶的热稳定性机制。
提高糖化酶的活力，利用诱变、DNA重组技术或其他方法获得优良菌株，提高糖化酶基因在受体菌中的表达水平等，进一步优化糖化酶纯化工艺及保存条件；另一方面，诱变筛选耐热糖化酶产生菌或克隆耐热糖化酶基因，将是一个重要方向，因为耐热糖化酶在发酵业的应用将会大大降低能源消耗，从而降低生产成本，将给糖化酶在工业中的应用开辟更为广阔的前景。
糖化酶酿酒方法是什么-
糖化酶酿酒方法是什么?糖化酶同时也被称为葡萄糖淀粉酶，用于做酒精或者是味精等原料，也可以用来制作啤酒或者是白酒等多种酒类，根据比例可以经过蒸煮加工后冷藏，加入糖化酶可以制作成酒，或者是白酒，糖化酶是属于比较安全的食品，对人体来说比较安全，不会对身体产生副作用。
使用方法酒精工业：原料经蒸煮冷却到60℃，调pH值至4.0-4.5左右，加糖化酶，参考用量为80-200单位/克原料，保温30-60分钟，冷却后进入发酵。
淀粉糖工业：原料经液化后，调pH值到4.0-4.5左右，冷却到60℃，加糖化酶，参考用量为100-300单位/克原料，保温糖化。
啤酒工业：在生产“干啤酒”时在糖化或发酵前加入糖化酶，可以提高发酵度。
酿造工业：在白酒、黄酒、曲酒等酒类生产中，以酶代曲，可以提高出酒，并应用于食醋工业。
其他工业：在味精、抗菌素、柠檬酸等其他工业应用时，淀粉液化冷却到60℃，调pH4.0-4.5，加糖化酶，参考用量100-300单位/克原料。
使用优点1、糖化酶对设备没有腐蚀性，使用安全。
使用糖化酶工艺简单、性能稳定、有利于各厂的稳定生产。
2、使用糖化酶对淀粉水解比较安全，可提高出酒率，麸曲法能减少杂菌感染，节约粮食可降低劳动强度，改善劳动条件。
3、使用糖化酶有利于生产机械化，有利于实现文明生产。
注意事项本品使用时最适pH4.0-4.5，淀粉糖和味精生产时应先调pH，后加酶糖化。
用酶量随原料、工艺不同而变化，要缩短糖化时间需增加用量。
淀粉质原料必须与酶充分接触，接触面积大，时间长，效果好。
间歇糖化要搅拌充分，连续化必须流量均匀。
温度需严格控制60℃-62℃，保温时温度均匀，严禁短期高温。
运输、贮存本品对温度、光线、湿度都很敏感，运输贮存时尽可能做到避免曝晒、高温、潮湿、保持清洁、阴凉和干燥，能低温保存更好。
糖化酶酶活力测定原理糖化型淀粉酶(即淀粉一1，4一葡萄糖苷酶，简称糖化酶)能将淀粉从分子链非还原性末端开始，分解a一1，4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。
α-淀粉酶
α-淀粉酶在结构上的相似性使人们相信它们具有相似的 催化机制。McCarter、Davies均提出α-淀粉酶的催化过 程包括三步，共发生2次置换反应。第一步，底物某个 糖残基要先结合在酶活性部位的-1亚结合位点，该糖基 氧原子被充当质子供体的酸性氨基酸(如Glu)所质子化;第 二步，-1亚结合位点的另一亲核氨基酸(如Asp)对糖残基 的Cl碳原子进行亲核攻击，与底物形成共价中间物，同 C 时裂解Cl-OR键，置换出底物的糖基配基部分;第三步， 糖基配基离去之后，水分子被激活(可能正是被刚去质 子化的Glu所激活)，这个水分子再将Asp的亲核氧与糖残 基的C1之间的共价键Cl-Asp水解掉，置换出酶分子的Asp 残基，水解反应完成。在第二次置换反应中，如果进攻 基团不是水分子，而是一个带有游离羟基的糖(寡 糖)ROH，那么酶分子的Asp残基被置换出后，就发生了 糖基转移反应而非水解反应。
在米曲霉的Taka-淀粉酶A(TAA)中，在活性部 位发现有三个酸性氨基酸残基，Asp206， Glu230，Asp 297，定点突变研究发现它们 是催化所必需的氨基酸。研究发现TAA中这 三个催化所必需的氨基酸在其它的α-淀粉酶 以至于α-淀粉酶家族中也是共有的。
Tonozaka(1993)通过对不同来源的37个α-淀粉酶基因分支酶基因，异 淀粉酶基因等进行同源序列的比较，微生物与动物和植物产生的α-淀 粉酶的氨基酸序列之间的同源性不超过10%，但发现这些淀粉酶有 ABCD四个区域有高度的保守性，推测这些保守区域与其底物的结合 或催化中心有关。 尽管不同来源的α-淀粉酶在氨基酸序列上是不同的，但它们却共同拥 有相同的基本次级结构，如(β/α)8结构(亦称之为TIM－桶)——由8个螺 旋包围8个β-折叠组成的筒状结构。该结构被认为具有催化能力的结 构。 YJanec k，S.通过对α-淀粉酶家族研究发现大部分α-淀粉酶除了含有 八个(β/α)桶状结构的催化中心(domain A)外，还包括domains B、C和 D。其中domain B具有三个β折叠和三个α螺旋，长度和结构随来源的 不同而变化。Domain C区是催化区域后面的区域，主要由β折叠组成， 该区被认为有保护催化中心疏水氨基酸的稳定性的作用。 另外，有一些α-淀粉酶包含一个没有催化功能的淀粉结合位点(starchbinding domain)。 此外，几乎所有α-淀粉酶都是金属酶，每个酶分子至少含有一个钙离 子，钙离子使酶分子保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定 性。
糖化酶活性检测试剂盒说明书__微量法UPLC-MS-4240
糖化酶活性检测试剂盒说明书微量法UPLC-MS-4240100T/48S试剂名称规格保存条件提取液液体70mL×2瓶2-8℃保存试剂一粉剂×2瓶2-8℃保存试剂二液体18mL×1瓶2-8℃保存标准品粉剂×1支2-8℃保存溶液的配制：1、试剂一：临用前取1瓶加入10mL提取液，充分混匀后沸水浴直至溶解（约10min），2-8℃保存4周；2、标准品：10mg无水葡萄糖，临用前加1mL提取液溶解为10mg/mL的葡萄糖标准品备用，2-8℃保存两周；糖化酶，即葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），又称γ-淀粉酶。
糖化酶是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶，主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解α-1,4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解α-1,6糖苷键由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。
多应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸，甘油，淀粉糖等工业中，是我国重要的工业酶制剂之一。
糖化酶将可溶性淀粉生成葡萄糖，碱性条件下，葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸共热后生成红棕色化合物，在540nm 处有最大光吸收，在一定范围内葡萄糖的量与反应液颜色深浅成正比，以此测定糖化酶的活力。
Soluble Starch Glycosylase GlucoseGlucose+3,5-Dinitrosalicylic Acid3-Amino-5-Nitrosalicylate（540nm）注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、恒温水浴锅、研钵/匀浆器，超声破碎仪、冰和蒸馏水。
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1.按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
糖化酶活力测定
糖化酶活力测定1.定义1g固体酶粉（或1ml液体酶），于40℃、pH值为4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为1个酶活力单位，以u/g（u/ml）表示。
2.原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。
葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算酶活力。
3.试剂和溶液（1）乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH为4.6）。
称取乙酸钠（CH3COONa·3H2O）6.7g，溶于水中，加冰乙酸（CH3COOH）2.6ml，用水定容至1000ml。
配好后用pH计校正。
（2）硫代硫酸钠标准溶液（Na2S2O3，0.05mol/L）。
（3）碘溶液（1/2I2，0.1mol/L）。
（4）氢氧化钠溶液（NaOH，0.1mol/L）。
（5）200g/L可溶性氢氧化钠溶液。
（6）硫酸溶液（2mol/L）。
（7）20g/L可溶性淀粉溶液。
（8）10g/L淀粉指示液。
4.仪器和设备恒温水浴锅、秒表、比色管、玻璃仪器。
5.步骤（1）待测酶液的制备称取酶粉1～2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶1.00ml），先用少量的乙酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中。
沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（估计酶活力在100～250u/ml范围内），摇匀。
通过4层纱布过滤，滤液供测定用。
（2）测定于甲、乙两支50ml比色管中，分别加入可溶性淀粉25ml及缓冲液5ml，摇匀后，于40℃恒温水浴中预热5min。
在甲管（样品）中加入待测酶液2ml，立刻摇匀，在此温度下准确反应30min，立刻各加入氢氧化钠溶液0.2ml，摇匀，将两管取出迅速冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2ml，吸取上述反应液与空白液5ml，分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶液10ml，再加氢氧化钠溶液15ml，摇匀，密塞，于暗处反应15min。
关于糖化酶的应用
关于糖化酶的应用
1．我们的糖化酶活力是100000单位/毫升（国标法测的），杰能科和诺维信的糖化酶酶活的测定是由他们自己的方法测的，我们用国标法测定过他们酶活，杰能科和诺维信均为10万单位以上。
单独的糖化酶讲，诺维信的敲除了转甘酶基因，没有转苷酶活性。
杰能科的有较低的转甘酶活性，我们的和杰能科相同。
2．糖化的要求和标准;
1).糖化酶的选择：有二种糖化酶；1，单独糖化酶（如我们的糖化酶）2，
复合糖化酶(糖化酶加普鲁兰酶)。
2）底物的浓度：淀粉液化时的淀粉浓度在30%--35%（质量分数）左右。
3）酶的添加量：酶添加量大可以加快糖化速度，缩短糖化时间。
单独糖化酶的作用结果使其葡萄糖的DX值最高只能达到95%左右，再配合普鲁兰酶的复合糖化酶其DX值也不会超过97%。
单独用糖化酶增加用量只能缩短糖化时间，因为转苷酶也增大，其逆反应也增加了。
4）糖化时间控制：糖化时间由酶的添加量决定。
合理的糖化时间是给酶和淀粉充分反应时间将淀粉彻底分解，时间太短，酶没有充分作用糖化不彻底DX值不高；时间太长，葡萄糖的逆反应增强，产率也下降。
试验证明：考虑葡萄糖产率和酶制剂成本，糖化时间控制在36—48小时为好。
糖化结束立即灭酶，终止反应，抑制逆反应，达到稳定DX值目的。
以上资料来源于杰能科公司段钢老师
供参考，结合工厂实际，即设备、工艺、产品目标等条件应用。
杨建国。
糖化酶
酶活测定方法
▪ 亚碘酸盐法（碘量法） ▪ 费林法 ▪ 3，5—硝基水杨酸法（DNS法） ▪ 葡萄糖氧化酶发（NOVO法分光光度测定
淀粉葡萄糖苷酶） ▪ （补）用萃取化学公司法测定淀粉葡萄糖
苷酶
参 酶 酶 其生 影 糖 发 目 国 菌 概 考 活 的 应淀 响 化 酵 前 内 株
本
文 测 分 用粉 酶 酶 生 的 外 的 念 节
献 定 离 的糖 活 的 产 用 研 发 方 和 研化 力 一 工 途 究 现 和 法 纯 究酶 的 般 艺 （ 情 及
内 容
（ 化 （菌 因 性 （ 了 况 生 特
了 了种 素 质 了 解 （ 产
解 解选
解）了应征
） ）育
） 解用
（ 回 顾
、 性 质 及
参考文献：
• ５．郑集 陈钧辉 著，普通生物化学（第 三版），高等学校教材，（２００３）
• ６．王镜岩 朱圣庚 徐长法 著，生物化 学（第三版 上），高等教育出版社， （２００４）
糖化酶的酶活
在40℃，PH5.5条件下，1小时分解可溶性 淀粉产生1毫克葡萄糖所需的酶量定义为一个 糖化酶酶活力单位，以mg/g.h表示。
糖化酶的一般性质
1、最适pH为4-Байду номын сангаас；最适反应温度为50-60℃ 2、根据不同来源的糖化酶水解淀粉限度分为
根霉型糖化酶： 可以水解淀粉至100%，属于这种糖化酶产生菌
如
德氏根霉（Rh.delemar）、拟内孢霉等。
黑白霉型糖化酶：水解淀粉至80%便终止作用，属于这种糖化酶 产生菌如黑曲霉、宇佐美曲霉、泡胜曲霉、米 曲霉、河自根霉等。
原理：糖化酶可以水解淀粉１,4-α-糖苷键或
糖化酶活力测定
3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液 5ml，缓慢加入0.1N NaOH溶液 5ml ，(注意： 加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧 化C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的 NaIO3 和NaI ,使测定结果偏低) 摇匀，在暗处 放置15min后加入1N硫酸2ml；
测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰–爱 农法（ＳＰ法） 、Schoorl法（ＤＵ法）和 对硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）等方法。 本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。糖 化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下进行 反应,反应生成得葡萄糖用次碘酸钠法定量测 定。以单位时间内分解α–１，４糖苷键生 成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。当酶 的反应条件不相同时,酶活力单位定义也有所 差别。糖化酶的最适pH范围是4～5,最适应温 度范围是50～60℃。
因此，1mol葡萄糖与1molI2 相当。
6.析出的;2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
没有葡萄糖的情况
1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O
2、NaIO在碱性条件下发生歧化反应:
3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 3、总反应
6.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
三、试剂与器材
1.糖化酶试剂； 2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角
瓶、pH计、电子天平； 3.试剂
2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋 酸缓冲液； 0.1N碘液；0.1N氢氧化钠溶液； 1N硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶液；0.5% 淀粉指示剂。
糖化酶
六 糖化酶成品提取及测定
1 糖化酶的提取
• 成品糖化酶可分为液体酶和固体酶 2 种, 而固体酶的制备方法又可分为盐析法、有机溶 剂沉淀法和附吸法等。
• 目前国内对液体酶产品采用的浓缩方法有 2种,一种为依靠热源来蒸发产品中的水分, 另 一种为利用渗透膜超滤除去产品中的水分。前 者设备投资大、耗能多; 而后者投资少、耗能 低, 且操作简单、清洗方便、维修及更换成本 低, 产品收率高。
4 糖化酶在食醋酿造中主,具
有多菌种低温混合发酵的特点。传统酿醋工艺
存在着酒母培养条件差、酒母质量不稳定、原
料淀粉利用率低、出醋率低、高温季节生产不
稳定等诸多生产技术难题。
• 在发酵工艺中应用耐高温酒用活性干酵母 和糖化酶,活性干酵母具有耐高温、耐酸、抑 制杂菌能力强的特性,能够保证食醋夏季生产 的正常进行,不仅降低了原材料的消耗,而且显 著提高了淀粉利用率和出醋率,具有较好的经 济效益。
3 糖化酶在黄酒酿造中的应用
传统的黄酒酿造主要使用活性干酵母作为 糖化发酵剂,依然存在产酒率低的普遍问题。 将糖化酶应用于黄酒生产,由于糖化力高、发 酵快,使生产周期大大缩短,并使出酒率有很大 提高。这样,既节约了原料,又降低了成本,提 高了经济效益。研究结果表明,糖化酶的加酶 量为0.02%,最适温度为32℃,最适pH值为4.6, 主发酵期缩短2～3天,后发酵期缩短10～60天, 出酒率高达92.07%,是传统法的3.1～4.6倍。
1 糖化酶在白酒酿造中的应用
我国传统白酒的生产用固态发酵法,大多 使用淀粉质原料,一般以曲为糖化剂,成本高、 产酒率低。原因是因为淀粉质原料的糖化不完 全所致,而糖化是发酵的基础,因而糖化不好就 成了影响出酒率的首要问题。随着白酒工业的 发展,利用糖化酶代替部分曲,以提高出酒率, 降低生产成本,已被众多白酒企业普遍采用。 尤其近几年活性干酵母的出现,更使糖化酶在 白酒中的用量飞速增长。
9 糖化酶活力测定
（2） C（Na2S2O3）=0.05mol/L 硫代硫酸钠标准滴定溶液
配制：
称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3· 5H2O)13g和碳酸钠0.1g（硫代硫酸 钠溶液在pH9-10时最稳定）溶于煮沸后冷却的蒸馏水中（无CO2）， 定容至1000mL，即得0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封 保存，配制后应放置一星期标定使用。
第九型淀粉酶（一类酶）：将淀粉水解成麦芽 糖或葡萄糖，包括以下几种：
淀粉 β-淀粉酶： 淀粉-β-1，4-麦芽糖苷酶 淀粉
糖化酶： 淀粉-α-1，4-葡萄糖糖苷酶
麦芽糖
淀粉 异淀粉酶： 淀粉-1，6-葡萄糖苷酶（真菌淀粉酶） 麦芽糖
葡萄糖
概述
糖化酶是由曲霉优良菌种（Aspergilusniger）经深层发酵 提炼而成。糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶，它能把淀粉从非 还原性未端水解α-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢 水解α-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。 本产品广泛用： 生产白酒、黄酒、酒精、啤酒；用于以葡萄糖作发 酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵； 生产各种规格的葡萄糖。 总之，凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上，都 可适用。
（4）分别取上述反应液与空白液各5mL，放入 250mL碘量瓶中，准确加入C(1/2 I2)=0.1mol/L标 准碘液10mL，再加入0.1mol/L氢氧化钠15mL，摇 匀，暗处放反应15min。 （5）取出，加入c（1/2H2SO4）= 2mol/L 硫酸溶液 2mL，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至淡黄色时， 加入几滴0.5%淀粉指示剂，继续滴定至无色为终 点。
目的
学习糖化型淀粉酶（或液体曲酶）活力的 测定方法 了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的 指导意义
糖化酶活力测定
糖化酶活力测定1.原理固体曲中糖化酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）能将淀粉水解为葡萄糖，进而被微生物发酵，生产酒精。
糖化酶活力高，淀粉利用率就高。
可溶性淀粉经糖化酶催化水解产生葡萄糖，用斐林试剂法测定。
2.试剂（1）20g/L 可溶性淀粉溶液：准确称取绝干计的可溶性淀粉2g（准确至0.001g），于50mL烧杯中，用少量水调匀后，倒入盛有70mL沸水的烧杯中，并用20mL 水分次洗涤小烧杯，洗液合并其中，用微火煮沸到透明，冷却后用水定容至100mL，当天配置使用。
（2）2.5g/L葡萄糖溶液（3）斐林试剂（4）乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH4.6）a.2mol/L 乙酸溶液：取118mL冰乙酸，用水稀释至1000mL。
b.mol/L 乙酸钠溶液：称取272g乙酸钠（CH3COOH·3H2O），溶于水并稀释至1000mL。
将a，b等体积混合，即为pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
（5）0.5mol/L H2SO3 溶液：量取28.3mL 浓硫酸，缓慢倒入水中并稀释至1L。
（6）1 mol/L NaOH 溶液。
3.测定步骤（1）5%干曲浸出液制备称取相当于5g的干曲的曲粉（准确至0.01g）［曲粉量（g）=5×1/（1－水分含量）］，置于250mL烧杯中，加水（90－5×水分%）mL，缓冲液10mL，在30℃水浴中浸出1h，每隔15min 搅拌1次。
然后用干滤纸过滤，弃去最初5mL，接收50mL澄清滤液备用。
（2）糖化液制备吸取20g/L 可溶性淀粉溶液50mL于100mL容量瓶中，在35℃水浴保温20min 后，准确加入酶浸出液10mL，摇匀并立即计时，在35℃水浴中准确保温1h。
立即加入3mL 1mol/L NaOH 溶液，以停止反应。
再冷却到室温，用水定容至刻度线。
此时溶液应呈碱性。
空白液制备：吸取20g/L 可溶性淀粉溶液50mL于100mL容量瓶中，在35℃水浴保温20min后，先加入3mL 1mol/L NaOH 溶液，再准确加入酶浸出液10mL，摇匀并立即计时，在35℃水浴中准确保温1h。