第五章高效液相色谱法的应用
高效液相色谱法及其应用
高效液相色谱法
基本概念 分离原理 系统结构 分析方法 实际应用
色谱法（Chromatography）
希腊语chroma(色)和graphos(谱)
石
油
1903年
醚
俄罗斯植物学家
Tsweet茨维特
植物色素 玻璃柱 CaCO3 石油醚淋洗
色谱分析法的定义
色谱分析法是一种物理化学 分离方法,其分离原理是：溶于流 动相(石油醚)中的样品(植物色素) 各组分经过固定相 (CaCO3)时，其 与固定相发生吸附、分配、离子吸 引、排阻、亲和等相互作用，且其 作用的大小、强弱不同，导致在固 定相中滞留的时间也不同，从而先 后从固定相中流出，实现了不同组 分的分离。当分离后的组分由流动 相携带进入检测器时，就得到了一 个一个的色谱峰。
• （3）内标物的性质和浓度尽量与预测定峰的接 近。
• （4）内标物是样品中不存在的，与样品各组分、 柱填料和移动相不发生化学反应。
• 根据组分百分含量与其色谱峰面积成正比的 关系进行计算：
HPLC的日常操作条件
最好是恒温、恒湿 温度：15—30℃ 相对湿度<80%
房间应有良好的通风 避免光线直射 远离高电磁干扰、高振动设备
色谱柱的选择应考虑：
➢固定相类型的选择, 主要取决于样品及其分离模式； ➢ 柱填料的结构, 主要指颗粒的形状大小、均匀性、比表 面、平均孔径和孔容等； ➢ 柱规格指柱内径、柱长度和填料粒度
色谱柱的分离效率（简称柱效），可定 量地用理论塔板数N来表示。
柱
效
检
测
次序：尿嘧啶/苯酚/ 4-氯硝基苯/甲苯
用待测组分标准物制备一系列标准溶液，在选定的色 谱条件下取一定体积的标准溶液进样分离，用待测组分的 峰面积对浓度做标准曲线，此标准工作曲线应是通过原点 的直线。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。
高效液相色谱法的应用
在药品分析鉴定的作用
3 在西药鉴别中的应用 在HPLC法中,保留时间与组分的结构和性质有关,是定性的参数,可用于药物的鉴别.如中 国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定:在含量测定项下记录的色谱图中,供试品 主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致.头抱拉定,头孢噻酚钠等头孢类药物以 及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别. 4.在体内药物分析中的应用 HPLC由于测定迅速准确，流动相选择范围广，灵敏度高(10-12 g／mL以上)，填充柱种 类多，且可供选择的检测器也多。所以是实验室研究中一种很好的体内分析方法。在 国内外都很受重视．大多数药物都有紫外吸收，所以最常用的检测器是紫外检测器。 多数药物及内源性物质极性均较大，利用其极性差，可以采用RP-HPLC色谱柱，可获 得良好分离效果。
在药品分析鉴定的作用
1.天然药物分析 天然药物的来源有动物、植物和矿物之分，其中以植物类为主。由于天然药物的化学成 分复杂，其有效成分，可能有一个，也可以有多个，这对于控制药品质量，建立质量标 准来说比较困难，HPLC可通过对天然药物的有效成分进行式，可以判定药材的质量高低。 2..天然药物及复方成药分析 复方制剂、杂质或辅料干扰因素多的品种多采用高效液相色谱法。增免扶正片系由当 归、党参、黄芪（图3）等十几味天然药物精制而成，具有益气生津、活血养血、滋 补肝肾、健脾开胃之功效，主要用于抗缺氧、抗疲劳、抗衰老，长期服用可扶正祛邪 ，提高机体免疫功能，健身强体，益寿延年。该药对心、肝、脾、肾虚、纳差、心脑 血管疾病、神经衰弱、慢性肝炎、脂肪肝等都有较好的防治作用。 由于化学药品的开发费用昂贵，而且毒副作用大，近年来人们已把目光转向自然、民 族传统医药、草药、植物药等天然药物，据世界卫生组织统计，当前全世界60多亿人 口中80％的人使用过天然医药。在全世界药品市场中，天然物质制成的药品已占30％ ，国际上植物药市场份额已达300亿美元，且每年以20％ 以上的速度增长。HPLC分析 必定能为我国传统中医药实现现代化，走向世界提供强有力的技术支持。
高效液相色谱方法及应用
高压输液泵及梯度洗脱装置
一、高压输液泵 高压输液泵可以分为以下两类： 1．恒流泵：可输出恒定体积流量的流
动相。 （1）注射式泵（又称注射式螺杆泵） （2）往复型泵 2．恒压泵：恒压泵又称气动放大泵，
一类是选择性检测器，如紫外一可 见分光光度检测器；
另一类是通用型检测器，如示差折 光检测器。
(1)紫外一可见分光光度检测器。
如今此技术已在分析咖啡中的黄嘌泠、调料中的核苷酸及核苷、果汁中的有机酸、米中的维生素、牛奶中的维生素D等都对食品营养价 值提供有效数据。 热不稳定物、离子型化合物及高聚物的分离及测量有困难，致使其应用受到了很大的限制。 又如止痛药或退烧药也可用此法分离并测得各组分的含量。 染料厂排出废水中的苯胺等。 用液相色谱分析简便迅速。 分析食品中的有毒成分，如苹果中农药萘乙酸、稻米中的黄曲霉素、鱼体中的有机汞等。是输出恒定压来自的泵。二、梯度洗脱装置
1．梯度洗脱（gradient elution）又称 停流进样是在高压泵停止供液、体系压力下降的情况下，将样品直接加到柱头。
一、与经典液相色谱法比较
为梯度淋洗或程序洗脱。在同一个分析 用离子交换柱和缓冲游泳梯度淋洗。
多种不同性能的配位体键联在固相基体上 分析食品中的有毒成分，如苹果中农药萘乙酸、稻米中的黄曲霉素、鱼体中的有机汞等。
高效液相色谱法的特点
一、与经典液相色谱法比较 经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装
填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经 色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱 入口压力低，仅有低柱效，分析时间冗长。
高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填 在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵 进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散 速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效 和高分离能力。
高效液相色谱分析技术的应用
高效液相色谱分析技术的应用在当今社会中，高效液相色谱分析技术已经成为了化学研究中不可或缺的重要工具。
它可以用来分离、检测和定量各种化合物，是一个通用的分析方法。
在医药、环保、食品和农业等领域，高效液相色谱分析技术都有着广泛的应用，如下所述。
1. 医药研究高效液相色谱分析技术在生物医药领域中有着非常广泛的应用。
例如，它可以用来检测蛋白质、核酸和药物等生物大分子，分析药品的质量和含量，探测药物中残留的有害物质等。
这些都是基础医学、临床医学和制药工业中必不可少的步骤。
2. 环保工程高效液相色谱分析技术也可以应用在环保领域中。
例如，它可以用来检测水、空气和土壤中的重金属、有机化合物和细菌等污染物，帮助人们找到环境污染的原因和来源，进而采取相应的治理措施。
这些工作可以保障人们健康和环境的可持续发展。
3. 食品行业高效液相色谱分析技术在食品行业也有着广泛的应用。
例如，它可以用来分析食品中的营养成分、添加剂、防腐剂、色素等物质，检测食品中的微量有害物质和重金属等。
这些分析结果可以保证食品质量和安全。
4. 农业科技高效液相色谱分析技术不仅可以应用在生物医药、环保和食品等领域，也可以用于农业科技。
例如，它可以用来检测农产品中的农药残留、重金属含量和污染物等，分析土壤中的养分和微生物等。
这些都可以为农业科技发展提供数据和支持。
总之，高效液相色谱分析技术在各个领域中都有着广泛的应用前景。
但是，同时也需要注意分析技术的精度和可靠性，以及对环境和健康的影响。
在未来的发展中，应该注重提高技术水平、完善检测标准和加强科学技术的应用。
【培训课件】高效液相色谱法的应用
流速和柱温均可适当改变，以适应测定的需要。 如含量测定时，可适当加大流速和提高柱温；柱温 降低和流速降低均可对分离效果提高。顺便提及： 同样的测定条件，不同公司生产的色谱柱C18柱， 出峰时间都有可能相差很大。这十分正常。目前国 外已基本采用一根色谱柱对一个产品，特别是一些 特殊的柱型，质量标准中均详细注明。国内虽做不 到，但可在色谱条件上下工夫，以适应不同的色谱 柱型号，即后面即将讲到的方法认证中的系统耐用 性。
该仪器分析。 分离效率高：复方分析、辅料干扰时等情况下，
更显示其威力。 速度快：一般出峰时间均在30min以内。这里需
要强调的是，通常采用流速为1.0ml/min，柱温 30~40℃的测定条件。一般含量测定、溶出度可调 整为出峰时间快一些，有关物质测定一般调整的慢 一些，最好10~15min左右出峰为好。
3
HPLC仪的一般操作
1. 几大仪器生产厂商的介绍和使用下来的体会。 包括国内目前可以生产的部件；根据自己工作需 要购买某一品牌。 2. 流动相的配制（梯度洗脱）和处理（过滤膜） 3. 柱子的安装。 4. 操作顺序 5. 平衡时间、色谱柱清洗！ 6. 如有气泡，如何处理。
4
（1）分析生化样品、血液制品和手性色谱柱时，最好加一 预柱以保护。 （2）配备柱温箱，以保证试验的重现性和降低柱压等 （3）最好能配一电脑和国产软件。不要用积分仪。 （4）压力不稳时，绝大多数情况是有气泡混入。应排除。 （5）试验后色谱柱冲洗。 （6）色谱柱不用、存放时，两头柱塞一定塞住，否则容易 挥发干损伤柱子。 （7）建立仪器使用登记本。 （8） 仪器维修 培养一位同志
8
灵敏度高：可检测物质达10-9μg左右，一般最低检测 浓度均可达10-1~10-3μg/ml（进样体积10~20μl）。这是 紫外测定无法匹敌的。有些浓度非常低的，紫外检测不 到或者说紫外无法测定的，应用HPLC法均可得到满意 的解决！并可通过使用不同的检测器，测定不同物质， 或再提高测定灵敏度。
第五章高效液相色谱法
数据处理系统
打开工作站，选择工作通道 编辑方法文件，设置方法名称、运行时间及定量方法 输入路径名、样品名、操作者等 样品分离完成后，记录谱图文件名和色谱峰峰高、峰面积和保留值等
2019/7/25
四. 液相色谱固定相
1.液-固色谱固定相
种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：5～10 μm；
（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响
小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。
2019/7/25
气相色谱中的固定相原则上都可以用于液相色谱，其选 用原则与气相色谱一样。
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但 在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的 工作，一般很少自行制备。
2019/7/25
光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
2019/7/25
二极管阵列检测器
样品池 D2 / W 灯
光栅
每一组分可在每一波 长处得到一吸光度值
二极管阵列
二极管阵列检测器的优点
1）采集三维谱图 2）峰纯度检验 3）光谱库检索 4）可以发现单波长检测时未测到的峰
2019/7/25
2. 液-液色谱固定相
（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
高效液相色谱法在药物分析中的应用
高效液相色谱法在药物分析中的应用引言：药物分析是研究药物有关品质、特性和性能的科学，为解决药物的质量控制、卫生监督、疗效评价等问题提供重要依据。
高效液相色谱法（HPLC）作为一种广泛应用的分析技术，被广泛用于药物分析领域。
本文将介绍HPLC的原理、分类、样品前处理以及在药物分析中的应用。
一、高效液相色谱法的原理高效液相色谱（HPLC）是依据溶质在液相中的分配行为，通过使用高压将流动相以高流速通过填充在色谱柱中的填充物，使溶质在液相中迅速地分离和富集的色谱法。
HPLC的关键是：高流速、高效分离柱、高灵敏检测器及自动化数据处理。
其主要原理是利用在流动相动力学不断交互和琢磨下，溶质主动与固定在填充柱中的固定相交互和琢磨而实现分离。
二、高效液相色谱法的分类1. 液相色谱法液相色谱法是利用液相作固定相，将溶质吸附于填充柱的一端的一种色谱法。
根据固定相的种类，又可分为吸附色谱、间隙色谱、离子交换色谱等。
2. 气相色谱法气相色谱法是利用气相作固定相，溶质在气相中沿柱壁表面扩散、交换、迁移分离的一种色谱法。
根据固定相的种类，又可分为草胺酸色谱、膜层分离、毛细管电色谱等。
三、高效液相色谱法中的样品前处理样品前处理在药物分析领域扮演着重要的角色。
在HPLC分析中，如果样品中的杂质较多，可能会干扰分析结果，影响分析的准确性和灵敏度。
因此，合适的样品前处理方法可以减少或消除干扰物，提高分析效果。
常见的样品前处理方法包括前处理、萃取、分配、浓缩、保护性介质法等。
四、高效液相色谱法在药物分析中的应用1. 药物纯度检测HPLC广泛用于药物纯度检测，可以准确测定药物的含量、杂质、有关化合物等。
通过HPLC可以快速、准确地得到药物的质量信息，保证药物的合格出货。
2. 药物稳定性研究药物稳定性对药物的长期储存和使用具有重要意义。
HPLC可以对药物与其他成分的相互作用、不同储存条件下的降解行为进行研究，评估药物在不同条件下的稳定性。
高效液相色谱技术在食品安全检测中的应用
高效液相色谱技术在食品安全检测中的应用第一章：引言随着社会经济的不断发展，人们对食品质量和安全的关注日益增加。
尤其是近年来，食品安全问题时有发生，引起广泛关注。
因此，为了确保人们的身体健康和生活质量，需要对食品进行严格的安全检测。
而高效液相色谱技术因其具有高效、准确、快捷等诸多优点，在食品安全检测中得到广泛应用。
第二章：高效液相色谱技术概述高效液相色谱（HPLC）是由液相为驱动力的一种分析技术。
通过将样品在液态移动相中进行分离，然后用检测器检测每个分离出来的物质的特定信号，最终得到色谱峰。
HPLC是一种灵活性强、可靠性高、分离效率高、分析速度快、灵敏度高的分离技术，它在食品安全领域应用广泛。
第三章：高效液相色谱在食品安全检测中的应用3.1 食品添加剂检测食品添加剂是食品加工过程中添加的各种化学物质，用于增加食品的色、香、味、营养价值和保质期等。
但是，有些食品添加剂可能对人体健康有害。
因此，如何检测食品添加剂成为食品安全领域的重要问题。
高效液相色谱技术在食品添加剂检测中有着很广泛的应用。
例如，利用HPLC可以对食品中的亚硝酸盐、硫代硫酸盐等添加剂进行检测。
3.2 食品中的农药残留农药是农业生产中一个重要的辅助决策因素，但是如果没有恰当地控制其使用，就可能对人造成危害。
因此，对食品中的农药残留情况进行监测和控制是很重要的。
高效液相色谱技术具有灵敏度高、准确性高、分析速度快等特点，可以对食品中的农药残留情况进行精确的检测，如对克百威、毒死蜱、硫磺磷等常见农药进行检测。
3.3 食品中的罕见氨基酸检测高效液相色谱技术作为营养学、化学与生物学等学科的重要分析手段，在食品科学中也被广泛地应用。
在检测食品中罕见氨基酸方面小分子双酰胺（NBD-F）标记和高效液相色谱（HPLC）测定法对于检测食品中的氨基酸具有重要意义第四章：高效液相色谱技术在食品安全领域的优势高效液相色谱技术在食品安全检测中具有以下几个优势：4.1 灵敏度高高效液相色谱技术不仅可以检测低浓度的物质，而且还可以提高精确度。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
正相色谱法与反相色谱法的主要区别
反相色谱法在生物医学上的应用
• 反相色谱法分离生物大分子就是基于生物大分 子与非极性的固定相和极性流动相的疏水作用 的差异。
• 反相色谱法分离生物大分子的纯化因子是仅次 于生物亲和色谱和免疫亲和色谱
（1）异构体分离方面的应用
• 结构非常相似的维生素E的四种异构体、 、、
• 分子结构非常相似的维生素D2和D3 • 脂溶性维生素A六种顺式异构体
脂溶性维生素A六种顺式异构体
植物蜕化激素的分离分析
(2)强极性化合物的分离
• 强极性的化合物可以采用正相色谱法来 分离测定，但是找到合适的分离条件往 往是比较困难的。在一些特殊的情况下， 使用正相色谱法分离测定强极性的化合 物时，为了缩短溶质的保留时间，减小 色谱峰的拖尾现象，可以在流动相中加 入少量的水或醇、酸胺等物质，这样可 以获得满意的色谱分离
小麦中非淀粉脂族类化合物
(3)离子型化合物的分离
• 对于离子型化合物最好是采用离子交换 色谱法或反相离子对色谱法分离。但是 使用正相色谱法也可以对离子型化合物 进行分离测定，尤其是有机酸和碱类化 合物。
5.2反相色谱法的应用
• 反相色谱法分离溶质是基于被分离溶质 与固定相的疏水作用力的差异，通过改 变固定相的种类和流动相的种类和组成， 反相色谱法可以实现以下分离:
• 通过改变流动相中有机溶剂的浓度来改变分离 结果，所以在分离过程中使用了大量的有机溶 剂，这可能会导致生物大分子失去活性
反相色谱在食品分析中的应用
反相色谱在环境分析中的应用
8.3反相• （1）使用反相色谱法很难分离的异构体可以采用硅胶吸
附剂为固定相的正相色谱法分离，并且有很高的选择性和 分离能力 • （2）根据被分离溶质的极性不同，可以进行反相色谱法所 不能得到的族分离 • （3）对于在水溶液中化学不稳定的样品分离分析 • （4）对在极性有机溶剂中溶解度小的化合物进行分离分析 • （5）使用有机溶剂作为流动相，可以避免硅胶的溶解现象 • （6）由于流动相具有较大的挥发性，分离之后的样品易于 富集和进一步分析 • （7）有机溶剂的粘度小，流动相的粘度也小，色谱柱的柱 前压低
第五章 高效液相色谱法的应用
• 5.1正相色谱法的应用 • 5.2反相色谱的应用 • 5.3反相离子对色谱的应用
5.1正相色谱法的应用
• 在正相色谱中溶质分子在固定相上的保留主 要取决于溶质分子中极性最强的官能团的极性， 溶质的极性增大，其保留值也增大。
• 化合物在硅胶吸附剂上极性序列： 碳氟化合物 饱和烃 烯烃 芳烃 卤代化合物 醚类 硝基化合物 酯类酮类醛类化合物 醇类胺类 酰胺类 羧酸类化合物