2007锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用_范万红

3. 端标记 TA M RA。然后利用梯度稀释的阳性样品克隆质粒进行定量 PCR 反应, 制作标准 曲线, 得到病毒拷 贝数与 Ct 值 的
关系为: Ct = - 3. 45 lgX+ 42. 73( 相关系数 R 2= 0. 989) 。通过试验检测得到实时荧光定量 PCR 对 KHV 的灵敏度为 32 个病 毒核酸拷 贝数, 同时, 设计的引物和探针对于鱼类细胞系和其它鱼类 病毒没有扩 增反应, 表现出 较好的特异 性。实验结果 表
正向引物: 5.- GCT GCAT CGCCGT CAAG- 3. ; 反向引物: 5.- GCT GT GCAT GGCCACCT T- 3. ; 探针: 5.- FAM- ACGCCATAGACCAGCGCTACACCGTAMRA- 3. 。 1. 3 病毒 DNA 提取方法 取鱼的脑、肝、脾和肾脏各 100 mg, 放在 1. 5 m L 的离心管中, 在 10 e 条件下, 按文献[ 14] 的方法抽提核 酸 DNA。 1. 4 DNA 片段的克隆及阳性质粒的制备 设计引物( KHV- T K- F1: 5.- AT G GCT AT G CT G GAA CT G GT G A- 3. 和 KHV- T K- R1: 5.- CCC GT G AGA- CAG GGA CGA CA- 3. ) 扩增 KHV T K 基因 530 bp 的 DNA 片段。选取阳性 PCR 产物进行克隆。制备 10 LL 连接反应液, 其中: pM D18- T Vector DNA 1 LL 、 Cont rol Insert DNA 1 LL 、ddH 2O 3 LL、Solut ion I 5 LL , 16 e 连接 30 min。将 10 LL 连接反应液转化 JM 109 感受态细胞 ( 100 LL ) 。在含有 X- Gal, IPT G, Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养, 形成单菌落。挑选白色菌 落, 并培养菌液。采用碱裂解法提取质粒。 1. 5 灵敏度实验及标准曲线 提取的质粒 DNA 以 10 倍系列稀释, 进行实时荧 光定 量 PCR。用核 酸蛋 白分 析仪 测定 质粒 DNA 的 OD260 吸收值, 计算出 1 LL 质粒的质量。1 对碱基的 质量大约为 10- 15 Lg , 因此质粒拷贝数/ LL = { 总含量 ( Lg/ LL) } / { 质粒分子 碱基数 @ 10- 15 Lg } 。根据 拷贝 数以及对应的 Ct, 利用分析软件得到标准曲线。 1. 6 特异性实验 抽提草鱼性腺细胞( CO) 、鲤鱼上皮瘤细胞( EPC) 、 海水鲤科鱼类细胞( FHM ) 和锦鲤鳍条细胞( KF) 4 种 鱼类细胞系和传染性胰脏坏死病毒( IPNV) 、病毒性出 血性败血症病毒( VH SV ) 、流行性造血器官坏死 病毒 ( EHNV) 、甲鱼虹彩病毒( 9 701 株) 、草鱼 呼肠孤病毒 ( GCRV) 、传染性造血器官坏死病毒( IH NV ) 6 种病毒 核酸进行扩增, 检测引物和探针的特异性。 1. 7 数据分析 定量 PCR 反应结束后, 利用 SDS( Sequence Detect ion System ) 2. 1 软件进行数据分析, 包括查看扩增曲 线、Ct 值。计算质粒不同稀释度拷贝数与 Ct 值的相关
of r ea-l time PCR of KHV
/ mmol# L- 1
组分 Com pon ent
Buffer
试剂浓度 Concentration of
reagent 10 @
终浓度 F inal concentrat ion
1@
M gCl2
25
3
dN T P M ix ture
10
1
正向引物
10
( 1. 深圳出入境检验检疫局, 广东 深圳 518001; 2. 山东出入境检验检疫局, 山东 青岛 266002)
摘 要: 研究建立并完善了 T aqman 实时荧光定量 PCR 检测锦 鲤疱疹 病毒( KHV ) 的方法。 首先通 过选取 KHV 病毒 T K
基因的保守序列( GenBank AB182940) , 利用 PR IM ER EXPRESS 2. 0 设计引物和探针。其中 T aqman 探针的 5. 端标记 FAM ,
锦鲤疱疹病毒病是近年来在锦鲤和鲤鱼养殖生产
中发生的 1 种新病, 但已经显示出对渔业生产的严重 危害性[ 1] 。锦鲤疱疹病毒( Ko i Herpesvirus, KH V ) 是 锦鲤疱疹病毒病的病原, 主要感染锦鲤和鲤鱼, 并使之 大规模突然死亡。1998 年 5 月, 此病毒病在以色列首 先发生暴发, 锦鲤和鲤鱼死亡率高达 75% ~ 95% [ 2- 3] 。 接着, 美国和欧洲一些国家如英国、德国、比利时以及 亚洲一些国家[ 4- 5] , 如印度尼西亚、日本和南韩养殖的 锦鲤也因锦鲤疱疹病毒病而大量死亡[ 6, 8] 。KHV 带来 的严重危害已引起世界动物卫生组织( OIE) 和世界粮 农组织亚洲水产协会的高度关注。国家质检总局发布 警示通报, 要求暂停从日本和印度尼西亚进口锦鲤和 鲤鱼, 将 KHV 作为必检项目, 并加强对从其他国家和 地区进口的锦鲤和鲤鱼的检疫。
1997 年, 美国的研究人员建立了锦鲤鳍条细胞系 ( K F) [ 7] , 1998 年以色列和美国的研究人员从大量死亡 的锦鲤中率先分离出锦鲤疱疹病毒, 并经人工感染试验 证实这种疱疹病毒是引起世界各国锦鲤暴发性死亡的 主要病因[ 9, 11] 。该病毒的适合培养温度是 15~ 25 e , 最 适生长温度是 20 e , 只对锦鲤细胞系敏感, 能引起组织 细胞融合, 细胞质肥大, 产生细胞病变[ 12] 。
KHV 病毒粒子呈对称二十面体, 直径 100~ 110 nm, 成熟的病毒颗粒带有松散的囊膜, 直径 170~ 230 nm。病 毒粒子由 31 个病毒多肽组成, 其中 21 个多肽的分子 量与鲤科鱼类疱疹病毒( H erpesv irus Cyprini, CHV) 相
似, 10 个与叉尾 病毒( Channel catf ish virus, CCV ) 相 似。通过病毒多肽和限制性酶切反应试验, 表明分离 到的以色列株、美国株和英国株 KHV 是相同的。而基 因的 限制性片段长 度多态性试验 表明, KHV 不同于 CHV 和 CCV [ 10] 。K HV 基因组大小约为 277 kbp, 而 疱疹病毒 科的病毒基因 组大小通 常为 250 kb。英国 CEFAS 的 OIE 参考实验室对 KHV 约 50 kb 的基因进 行了测定和解析, 发现有许多基因与 CCV 基因有着高 度的同源性[ 13] 。
第 37 卷 第 5 期 2007 年 9 月
中国海洋大学学报
PER IOD ICA L O F O CEAN U N IVER SITY OF CHIN A
37( 5) : 785~ 788 Sept . , 2007
锦鲤疱疹病毒实时荧光定量 PCR 检测方法的建立及应用X
范万红1, 刘 荭1, 岳志芹2, 吕建强1, 何俊强1, 江育林1
收稿日期: 2006-11- 06; 修订日期: 2007-01-04 作者简介: 范万红( 1965-) , 女, 硕士, 兽医师, 主要从事进出境动物病害检疫及病害方面的研究。E-mail: kerryf an65@ yahoo. com. cn
786
中 国 海 洋大 学 学 报
2 00 7 年
0. 2
反向引物
10
0. 2
探针
5
0. 1
模板
5 LL
T aq DN A 聚合酶
5 U / LL
5U
2. 2 定量 PCR 反应的灵敏性实验 将 KHV 质粒进行 10 倍系列稀释, 共 9 个梯度, 为
10- 1~ 10- 9, 进行定量 PCR, 其扩增曲线如图 1。可以看 出, 质粒在 10~ 10- 7稀释度, 共 7 个数量级的范围内有典 型的/ S0型扩增曲线。在 10 稀释度时, Ct 值最小, 约为 12; 在 10- 7稀释度时, 对应的 Ct 值约为 36。在 10~ 10- 7范围 内, 根据质粒拷贝数( X) 与对应的 Ct 值的相关性, 利用软 件分析得到标准曲线: Ct= - 3. 45 lgX+ 42. 73, 相关系数 R2= 0. 989( 见图 2) 。质粒在 10- 8稀释度, 对应为 32 个病 毒拷贝时, 经过 PCR 扩增仍有荧光信号, 其 Ct 值为 37. 5。 因此, 在实际检测中, 以 Ct 值 37. 5 为界限, 则该方法的检
2 结果
2. 1 KH V 荧光定量 PCR 检测方法的优化 将加好样的 PCR 管放在荧光 PCR 仪中, 设置相应
荧光收集条件后进行扩增检测, 反应程序如下: 94 e 3 min; 94 e 15 s 变性, 55 e 30 s 退火, 72 e 1 min 延 伸, 如此重复 5 个循环进行预扩增; 94 e 10 s 变性, 60 e 40 s 退火、延伸, 如此重复 40 盖循环进行目的片段 的扩增, 对试验结果进行实时监测。
10 mmol/ L 以 1 mmol/ L 递增, 经过重复试验选定, 作为
反应体系中的镁离子浓度为 3 mmol/ L, Taq DNA 聚合
酶的用量为 5U, dNT Ps 的用量为Leabharlann 1 mmol/ L( 见表 1) 。
表 1 KHV 实时荧光 PCR 反应中各组分情况
T able 1 T he final concentr at ion of each compo nent in the reaction
在反应体系中其它条件相同的情况 下, 将引物浓
度和探针浓度从 0. 1 Lmol/ L ~ 1. 0 Lmol/ L 作倍比连
续稀释, 互相组合后进行检测, 通过对试验结果的分析
比较, 确定 最 佳引 物终 浓 度和 探 针浓 度 分别 为 0. 2