vigs基因沉默原理
vigs原理
vigs原理VIGS原理。
VIGS（病毒诱导基因沉默）是一种基因沉默技术，通过利用病毒来诱导植物基因的沉默，从而研究基因功能和调控机制。
VIGS技术是一种快速、高效的基因沉默方法，被广泛应用于植物分子生物学研究中。
本文将介绍VIGS的原理及其在植物科学研究中的应用。
VIGS的原理主要是利用病毒载体来携带目标基因片段，并通过病毒的侵染和复制过程，将目标基因片段转录成siRNA（小干扰RNA），siRNA能够诱导RNA干扰（RNAi）途径，从而导致目标基因的沉默。
VIGS技术的关键在于选择合适的病毒载体和目标基因片段，以及优化转染条件和病毒复制过程，从而实现对目标基因的特异性沉默。
VIGS技术在植物科学研究中有着广泛的应用。
首先，VIGS可以用来研究基因功能。
通过沉默目标基因，可以观察到植物表型的变化，从而推断目标基因在生物学过程中的作用。
其次，VIGS还可以用来研究基因调控网络。
通过沉默一个基因，可以观察到其他相关基因的表达变化，从而揭示基因之间的相互作用关系。
此外，VIGS还可以用来筛选抗病基因。
通过沉默潜在的抗病基因，可以评估其对病原体的抗性作用，为植物抗病育种提供理论基础。
总之，VIGS技术是一种重要的基因沉默方法，具有快速、高效、特异性的优点，被广泛应用于植物科学研究中。
随着分子生物学技术的不断发展，VIGS技术在植物基因功能和调控研究中将发挥越来越重要的作用。
希望本文的介绍能够帮助读者更好地理解VIGS的原理及其在植物科学研究中的应用，为相关领域的研究工作提供参考和借鉴。
VIG病毒诱导基因沉默技术
VIGS原理
dsRNA:双链RNA; Dicer酶:核糖核酸酶Ⅲ (RibonucleaseⅢ, RNase Ⅲ) 家族的成员; siRNA:小干扰RNA ; RISC:RNA诱导沉默复合体
VIGS应用的载体
利用植物病毒作为载体的优点:
• 病毒能吸附到完整的植物细胞并将它们的核酸导 入到细胞中 • 感染的植物细胞产生大量的病毒，因此重组病毒 载体可以高效表达转入的外源基因。 • 病毒感染可以蔓延整个植株 • 病毒感染快
What are RNAi?
• RNAi 现象早在 1993 年就有报道 : 将产生紫色素的基 因转入开紫花的矮牵牛中,希望得到紫色更深的花, 可是事与愿违,非但没有加深紫色,反而成了白色。 当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的 外来紫色素基因都失去了功能 , 称这种现象是“共 抑制”。 • 直到1998年, Fire等的研究证明,在正义RNA阻断了 基因表达的试验中 , 真正起作用的是双链 RNA, 使基 因“沉默”了。研究人员将这一现象称为 RNA 干扰 (RNA interference,RNAi) 。 研 究 者 因 此 获 得 了 2006年诺贝尔生理学或医学奖。
VIGS优点
• 在未获取全长序列甚至事先不知道序列的情况下 即可进行VIGS分析。 • 操作简便，能快速获取表型。 • 无需构建转基因植株。这对于那些转基因植株获 取非常困难的植物种类来说至关重要 •可用于突变致死的基因功能研究。 •可用于功能冗余基因的功能研究。 •可用于快速的不同植物种类间比较基因组学的研究 。
VIGS应用寄主
• 寄主范围有限，针对不同的寄主植物往往需要开发 不同的病毒载体。 • 2002，大麦抑制PDS（大麦条纹花叶病毒BSMV，进 一步在小麦上应用） • →2006，水稻、大麦和玉米（雀麦花叶病毒BMV • →2006，大豆（多组分病毒菜豆荚斑驳病毒BPMV） • →2010，大豆（改造后无需体外转录，增加沉默效 率）
VIGS技术及其在棉花功能基因组研究中的应用进展
VIGS技术及其在棉花功能基因组研究中的应用进展VIGS（Virus-induced gene silencing）是一种利用病毒诱导基因沉默的技术，可以用于功能基因组学研究中的基因功能验证。
在棉花功能基因组研究中，VIGS技术也已经取得了一些重要的进展。
棉花作为重要的经济作物之一，其基因组研究一直备受关注。
VIGS技术通过感染植株的细胞表达病毒片段，从而诱导植物基因的沉默或抑制，以研究其功能。
VIGS技术有以下几点在棉花功能基因组研究中的应用进展：首先，VIGS技术可以用于研究棉花的基因功能。
利用VIGS技术，研究人员可以选择目标基因进行沉默，然后观察植株的表型变化以及转录组和蛋白质组的变化。
比如，研究发现，在棉花纤维发育过程中，一些关键调控基因的抑制可以导致纤维长度和纤维数目的改变，从而揭示了纤维发育的调控机制。
其次，VIGS技术还可以用于筛选抗病基因。
棉花作为一种重要的经济作物，往往受到各种病原体的侵害。
利用VIGS技术，可以针对不同的病原体选择相应的抗病基因进行沉默，从而研究其抗病机制。
研究人员已经利用VIGS技术筛选出多个抗病基因，为棉花的抗病育种提供了重要的候选基因。
此外，VIGS技术还可以用于研究棉花与其他植物的互作机制。
研究人员利用VIGS技术沉默棉花中的一些基因，然后观察植株与其他植物的互作表型。
通过这种方法，可以揭示不同植物之间的相互作用机制。
研究人员已经利用VIGS技术研究了棉花与其它植物的竞争竞争、共生以及对其他植物的拮抗等互作机制。
最后，VIGS技术在棉花的遗传改良中也有潜在的应用前景。
通过基因沉默可以调控棉花的相关性状，从而实现特定的基因改良目标。
然而，在实际应用中，需要解决一些挑战，如传递病毒载体的优化、目标基因的选择以及目标基因的稳定性等，这些问题需要进一步研究和改进。
综上所述，VIGS技术在棉花功能基因组研究中已经取得了一定的进展。
通过VIGS技术，研究人员可以揭示棉花基因的功能、筛选抗病基因、研究棉花与其他植物的互作机制，并有潜在的应用于棉花遗传改良中。
VIGS实验方案
VIGS实验方案VIGS（病毒诱导基因沉默）是一种基因沉默的技术，通过病毒载体介导的RNA干扰机制，靶向降低目标基因的表达。
VIGS技术广泛应用于植物研究领域，可以帮助我们理解基因与表型之间的关系。
下面是一个VIGS实验方案的示例，以帮助研究者深入了解该技术的应用。
实验目标：通过VIGS技术沉默目标基因，研究其在植物发育和抗逆过程中的功能。
实验步骤：1.构建VIGS载体：选择一个合适的病毒载体（如Tobacco Rattle Virus，TRV），并将目标基因的片段克隆到载体中，构建TRV:目标基因短暂表达载体。
2.病毒感染：将构建好的TRV:目标基因载体与辅助载体（如pTRV1）转化至Agrobacterium tumefaciens，并经过过夜培养。
3.生成病毒颗粒：分别用TRV:目标基因载体感染葡萄苗或拟南芥等模式植物的幼苗，通过渗透法或注射法将Agrobacterium harboring TRV:目标基因载体的细菌转化至植物体内。
然后将植物继续养护，直至观察到病毒症状。
4.分析基因沉默效率：在病毒感染后的适当时间点（通常是10-14天），收集叶片或其他组织样本，利用实时定量PCR或Northern blotting等方法，分析目标基因的表达水平。
与未感染的植物进行对照实验，以评估基因沉默的效率。
5.表型分析：观察病毒感染植株的表型变化，如外观、生长速度、营养状况等。
比较感染植株与对照植株的差异，以推断目标基因在发育和抗逆等生理过程中的功能。
6.RNA测序分析：收集沉默目标基因的植株样本，提取总RNA并进行测序分析。
通过与对照样本比较，鉴定沉默目标基因可能参与的信号通路和生物过程。
7.补充实验证实：根据RNA测序结果，选择一些重要的候选基因进行进一步验证实验，如RT-PCR、Western blotting以及表型复原分析等。
8.数据分析和结果呈现：对实验数据进行统计分析，使用图表、图片和表格等形式呈现实验结果。
第一实验：以烟草脆裂病毒为载体通过基因沉默分析植物基因功能（VIGS
第一实验：以烟草脆裂病毒为载体通过基因沉默分析植物基因功能（VIGS）一、目的掌握一种分析植物基因功能的方法二、原理在病毒载体中插入某一外源基因，然后侵染宿主可引起宿主体内相应基因或序列相似基因的沉默。
病毒侵染宿主后导致的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）这一流程如图1-1。
其中修饰后的烟草脆裂病毒（TRV）的载体克服了其他病毒载体所固有的缺点。
它便于非病毒序列的插入和随后对植物的侵染、介导VIGS缺乏病毒侵染后产生的症状或产生非常轻的症状、侵染的面积比较大、导致的VIGS维持的时间比较长。
特别是它能在植物生长点产生基因沉默，锁定宿主的RNAs，然后可通过比较基因沉默后植物的表型等方法来分析基因的功能。
TRV可以侵染12属的60多种植物，如烟草、番茄、马铃薯等。
以上这些特点使TRV载体在发现植物基因和分析基因功能方面得到广泛的应用。
图1-1 病毒引起的植物基因沉默图1-2 TRV载体A：野生型TRV RNA1的结构及位于植物双元转化系统质粒p TRV1中的cDNA克隆；B：野生型TRV RNA2结构及位于植物双元转化载体系统质粒pTRV2中的TRV RNA2的cDNA克隆。
其中Lb、Rb：T-DNA 的左、右边界DNA序列；RdRp：依赖RNA的RNA聚合酶；35S：CaMV的35S启动子；MCS：多克隆位点；T：转录终止点；16K、29.4K、32.8K分别为病毒编码的蛋白序列；CP：病毒编码的外壳蛋白序列；Int：插入病毒基因的内含子；MPbd的运动蛋白TRV是正链RNA病毒，包括两个基因组分，其中RNA1编码病毒在植物中的复制和运动所需的蛋白，RNA2编码病毒组装和介体传播所需的蛋白。
在构建载体时把RNA1和RNA2的cDNA分别克隆在植物转化所用的农杆菌的双元载体系统中的两个质粒上，具体结构如图1-2所示。
vigs基因沉默原理和rnai沉默
vigs基因沉默原理和rnai沉默VIGS基因沉默原理和RNAi沉默是两种常用的分子生物学技术，被广泛应用于研究植物基因功能。
它们有些相似之处，同时也存在一些差异。
本文将对这两种技术的原理、应用和优缺点进行详细探讨。
1. VIGS基因沉默原理VIGS（Virus-induced gene silencing）是通过病毒侵染植物细胞，诱导宿主植物基因的沉默。
该技术利用了病毒的复制和传播机制，将目标基因序列整合到病毒基因组中，并且在感染的植物细胞中产生可复制的RNA介导的沉默效应。
具体步骤包括：（1）构建VIGS载体：将目标基因的部分序列插入病毒载体，形成VIGS载体。
（2）VIGS载体侵染植物细胞：将构建好的VIGS载体导入病毒感受性植物中，让病毒基因组中的目标基因RNA与宿主植物基因的mRNA互补杂交，导致宿主基因沉默。
（3）基因沉默效应：病毒RNA会在植物细胞中被RNA依赖性RNA 聚合酶复制成多个复制体，随后通过系统性运输到植物全身，触发整个植物的基因沉默效应。
2. RNAi基因沉默原理RNA干扰（RNA interference）是一种保守的基因沉默机制，通过切割目标mRNA分子而将其降解，从而实现对基因表达的调控。
RNAi主要通过siRNA和miRNA两条途径实现。
具体步骤包括：（1）siRNA的产生：长双链RNA被核酸酶Dicer切割成短双链siRNA。
（2）siRNA的介导：siRNA将RISC（RNA诱导的沉默复合体）导入到靶基因mRNA上，使其降解。
（3）miRNA的产生：由miRNA基因转录出的pri-miRNA在细胞核中被核酸酶Drosha切割为pre-miRNA，经过转运到细胞质后被Dicer 进一步切割成短miRNA。
（4）miRNA的介导：miRNA与RISC结合后能够通过完全或不完全互补靶序列的mRNA上结合，从而通过诱导转录后调控蛋白质的翻译或降解。
3. VIGS和RNAi的异同点（1）机制差异：VIGS是依赖于病毒的复制和传播来诱导植物基因沉默，而RNAi是通过siRNA和miRNA介导的沉默机制来调控基因表达。
VIG病毒诱导基因沉默技术
What are RNAi?
RNA干扰广泛存在于生物界，在不同物种中RNA干扰被 赋予不同的名称: •在植物体中被称为基因共抑制（co-suppression） •在真菌中被称为基因阻抑（qulling） •在动物体内被称为RNA干扰（RNAi）
现今用于植物RNAi技术按导入方式的不同有粒子轰击、 病毒诱导基因沉默(VIGS)、农杆菌介导等方式。
© 2013 American Society of Plant Biologists
PDS即八氢番茄红素脱氢酶，是类胡卜素合成所必需的酶，具保护叶绿 素免受光漂白的作用，而PDS基因发生沉默后被侵染植物就会表现出光 漂白症状。
PDS表型变异易于辨别，因此PDS基因成为VIGS体系评价的参照基因。
VIGS应用的载体
DNA病毒(载体构建简便、无需体外转录、操作难度 低) →1998,基于双生病毒番茄金色花叶病毒TGMV的VIGS 体系成功建立(第一例DNA病毒载体) →2004,非洲木薯花叶病毒ACMV →2008,棉花皱叶病毒CLCrV →2010,水稻东格鲁杆状病毒RTBV(实现农杆菌介导 接种高效沉默水稻內源基因PDS，第1例能够通过农 杆菌介导接种水稻的VIGS载体)
VIGS缺陷
• VIGS引起目标基因的沉默特征不具有遗传性，以 致VIGS技术并不能彻底揭示基因的功能，这是此 种技术自身最大的局限性。 • 如何获得目标基因的系统性沉默仍然是VIGS技术 目前需要解决的问题。 • 沉默持续的时间问题。 • 病毒载体如何有效地接种入植物体内，并产生较 强的沉默效果，是VIGS技术实验操作中的关键性 步骤。
VIGS原理
dsRNA:双链RNA; Dicer酶:核糖核酸酶Ⅲ (RibonucleaseⅢ, RNase Ⅲ) 家族的成员;
vigs原理
vigs原理VIGS原理。
VIGS（Virus-Induced Gene Silencing）是一种通过病毒诱导基因沉默的技术，被广泛应用于植物基因功能研究中。
VIGS技术利用植物病毒的RNA干扰机制，通过病毒载体将目标基因的片段导入植物细胞，从而抑制目标基因的表达。
本文将详细介绍VIGS原理及其在植物基因研究中的应用。
VIGS原理。
VIGS技术的原理是利用病毒诱导植物基因沉默。
病毒载体中携带了目标基因的部分序列，一旦进入植物细胞，这些序列将被转录成双链RNA。
这些双链RNA 能够被植物细胞内的Dicer酶切割成小的siRNA（small interfering RNA），siRNA 与靶标基因的mRNA互补结合，导致靶标mRNA降解，从而抑制了目标基因的表达。
这一过程与RNA干扰（RNA interference, RNAi）的机制相似。
VIGS技术的优势。
相比于传统的转基因和突变体筛选技术，VIGS技术具有以下优势：1. 快速，VIGS技术可以在短时间内沉默目标基因，研究者可以快速获得目标基因沉默后的表型变化。
2. 高效，VIGS技术可以在整个植物体内实现目标基因的沉默，而不仅限于特定组织或细胞。
3. 灵活，VIGS技术可以用于多种不同类型的植物，而不需要针对每种植物进行特定的转基因操作。
VIGS技术的应用。
VIGS技术在植物基因功能研究中有着广泛的应用，包括：1. 基因功能研究，VIGS技术可以帮助研究者快速验证目标基因的功能，特别是对于那些没有已知突变体的基因。
2. 代谢途径研究，通过沉默代谢途径中的关键基因，可以帮助研究者了解这些基因在植物代谢中的作用。
3. 抗病性研究，利用VIGS技术可以验证植物中与抗病相关的基因，有助于揭示植物抗病机制。
总结。
VIGS技术作为一种快速、高效、灵活的基因沉默技术，在植物基因功能研究中发挥着重要作用。
通过利用VIGS技术，研究者可以快速验证目标基因的功能，探究植物代谢途径和抗病机制，为植物育种和生产提供重要的科学依据。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1997年，VIGS这一术语最早被Van Kammen用于描述植物受病毒侵染后的症状恢复现象。
1999年，Baulcombe认识到，由于VIGS允许通过讲解特定基因的转录本来有针对性地下调该基因，VIGS将被作为基因功能研究的潜力巨大。
2004年，Burch-Smith通过使用重组病毒来沉默植物内源基因，此后，VIGS作为一种反向遗传学技术被研究者广泛使用。
病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）是指携带目的基因片段的病毒侵染植物后，随着病毒的复制和转录而特异性的诱导序列同源基因mRNA降解或被甲基化等修饰，从而引起植物内源基因沉默、引起表型或生理指标变化，进而根据表型变异研究目标基因的功能。
VIGS是根据植物对RNA病毒防御机制发展起来的一种用以表征植物基因功能的基因转录技术，其内在的分子基础可能是转录后基因沉默(post-transcript gene silence)。
与传统的基因功能分析方法相比，VIGS能够在侵染植物当代对目标基因进行沉默和功能分析；无需开发稳定的转化子，并且具有沉默单个或多个基因家族成员的潜力。
因此，VIGS一经建立，即被视为研究植物基因功能的强有力工具，得到了深入的研究和广泛应用，已用于烟草、番茄、小麦、水稻等植物的抗病反应、生长发育以及代谢调控的功能基因研究。
沉默机制
基因沉默在生物中普遍存在，表现在抵御病毒、转座子等外来核酸的入侵，识别并抑制外源基因表达，维持生物基因组稳定性等。
VIGS 作为基因沉默的特殊形式，是植物抗病毒侵染的一种自然机制。
当病毒或携带cDNA 的病毒载体侵染植物后，在复制与表达过程中通常会形成双链RNA （Double stranded RNA，dsRNA）形式的中间体。
dsRNA 作为基因沉默关键激发子，首先在细胞中被类似RNase Ⅲ家族特异性核酸内切酶Dicer 类似物（如DCL4）切割成21 ~ 24 nt 的小分子干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）。
siRNAs 在植物细胞内被依赖RNA 的RNA 聚合酶1（RNA-dependent RNA polymerase 1，RDR1）、RDR2 或RDR6进一步扩增，并以单链形式与Agronaute1（AGO1）蛋白等结合形成RNA 诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC 特异地与细胞质中的同源RNA 互作，导致同源RNA 降解，从而发生转录后水平的基因沉默（Post-transcriptional gene silencing，PTGS）发生转录水平的基因沉默（Transcriptional gene silencing，TGS）。
VIGS 可以分为两种类型，即转录后水平的基因沉默（PTGS）和转录水平的基因沉默（TGS）。
影响VIGS效率的因素及缺陷分析
插入片段与靶基因的同源性显著影响VIGS 的效率
由于VIGS 的作用机制基于核苷酸序列同源性，两者序列同源性越高，基因沉默效果越好，基因片段如果选择不当可能会造成基因沉默的“脱靶”，从而得不到有效的沉默表型。
疑惑：植物中很多基因都以家族形式存在，尤其对于小麦基因组而言，基因家族普遍庞大，家族成员往往在几十到几千不等，家族内各成员的序列又具有很高的相似性。
所以，如果只沉默基因家族中的某个特定基因，则必须在其特异序列上
选取靶基因片段，这一步对插入序列的选择就得仔细；如果要沉默基因家族内的多个基因，则必须选取基因家族的共有保守序列，以避免不同基因之间的功能互补而达不到良好的沉默效果。
靶基因片段的长度
插入病毒载体的基因片段长度应在200~350 bp之间。
过短则有可能由于不能满足特异性匹配的要求而导致沉默掉非靶标基因；过长则有可能造成插入片段的丢失，或失去系统侵染能力。
靶基因片段的方向
一般而言，靶基因片段反向插入VIGS 载体比正向插入诱导的基因沉默效率要高。
但不绝对。
环境温度
一般情况下，高温环境会导致植物体内病毒含量显著降低，基因沉默的效率亦明显降低；而在较低的温度条件下，病毒的含量和基因沉默的效率都显著地上升。
vigs体系中的PDS是什么？
八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene desaturase，PDS）是类胡萝卜素合成途径中的一个关键酶，当PDS 表达受阻时，植物便丧失了类胡萝卜素的光保护作用，从而呈现出白化效应。
也常以此作为接毒成功与否的参照。
展望
VIGS作为快速表征感兴趣基因表型的筛选技术，对特定物种病毒载体的改造应该值得被重视。
关于VIGS技术的一篇文献，我觉得很可。
2019年，中科院上海植物逆境中心Alberto P.Macho 课题组在NbSGT1-VIGS
实验过程中发现：利用TRV 沉默系统产生的NbSGT1-VIGS 的本氏烟中，NbSGT1 能够有效被沉默，然而通过农杆菌介导的瞬时表达系统会受到影响，例如GFP 蛋白不能有效被转录与表达(Fig.1)。