Western blot ,帮你理解

Western Blot
（3） 电泳

电泳时间一般4～5 h，电压为40V 较好， 也可用 60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终 止电泳，进行转膜。
Western Blot
Western Blot
Western Blot
（四） 转膜

（1） 转一张膜需准备 6 张7.0～8.3cm 的滤纸和1 张7.3～8.6cm 的硝酸纤维素膜。 切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的 蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置 于水上浸2 h 才可使用。（用镊子捏住膜 的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使 膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样 由于毛细管作用可使整个膜浸湿。 若膜沉 入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这 样会阻止膜吸水。
PBST(TBST)洗涤3 次，每次10分钟。
Western Blot 的具体步骤
7.免疫反应
不同二抗稀释浓度的效果图
Western Blot 的具体步骤
8.显色（结果检测）
显色方法 酶促底物发光法 代表类型 DAB显色法 特点 稳定性好，灵敏度 较高（250pg）， 背景一般，成像性 较差，药品疑有一 定致癌性。 稳定性好，灵敏度 高（10-12g），背 景可以很低，成像 性好，且可以重复 标记，
Western Blot 的具体步骤
4.转膜
表5 PVDF膜、NC膜、尼龙膜特点比较
Western Blot 的具体步骤
4.转膜
转膜准备
Western Blot 的具体步骤
4.转膜
制作“三明治”
Western Blot 的具体步骤
4.转膜
转膜条件： 推荐：100V ，1——2小时；根据蛋白大小以及胶厚度的不同而不同。
Western Blot 的具体步骤
5.转膜后检测：（立春红染色）
为检测转膜是否成功，可用相关染料对膜进行染色。
1x立春红 5min
染色前
染色后
Western Blot 的具体步骤
6.封闭
为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜 的封闭，常用的封闭液： 不能用于磷酸化蛋白！ 脱脂奶粉（5％） BSA（5％） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司 提供） 封闭条件： 4°C摇动，封闭1 hour，再用 TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育。
• 2. 1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8）
• Tris (MW121.14) 18.671g • 蒸馏水 100ml • 溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。
• 3. 10％SDS
• • • • SDS 10g 蒸馏水至 100ml 如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。 如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
Western Blot 的具体步骤
7.免疫反应
1.按照抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST稀释抗体； 2.抗体孵育时间：室温下孵育1～2h或4℃过夜（一般不超过18小 时）； 3. 保持适当的摇动使抗体与膜的结合均匀；
Western Blot 的具体步骤
7.免疫反应
上二抗
摆床上，二抗杂交，室 温（25℃左右）1h， 或4℃过夜。
仪器： 凝胶成份：
丙烯酰胺 N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 过硫酸铵 TEMED H 2O
电泳缓冲液：
Tris-甘氨酸溶液
Western Blot 的具体步骤
3.SDS-PAGE电泳
1.制胶 需紧密固 定！！
Western Blot 的具体步骤
3.SDS-PAGE电泳
2.上样 每孔上样量为 20-50 μg蛋白；根 据目的蛋白的表达 情况的不同而有所 变化。
3.SDS-PAGE电泳 原理：
Western Blot 的具体步骤
SDS 是一种离子性的界面活性剂, 它有强离子性的硫酸根离子也带有 疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质 混合时,它会以其碳链与蛋白质之 疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来, 而以硫酸根离子外露与水分子作用. 大多数蛋白质和 SDS 的平均结合 量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白 质结合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带 电价微不足道,且每单位重量之蛋 白质带电价一致 (charge density), 所以决定不同蛋白的泳动速率就只 剩下分子大小一项因素
DNA重组技术
siRNA的转染技术
表观遗传学（甲基 化，miRNA） 凡是涉及蛋白水平检测的研究，均可运用到western blot技术

为什么要作蛋白质印迹实验？

研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存 在样品当中

蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样 品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。
• 下层胶
• 依次加入
• • • • • 去离子水 30%丙烯酰胺 5ml 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml 10%SDS 150μl 10%AP 150μl TEMED 6μl5% 5.9ml
• 上层胶
• 依次加入
• • • • • 去离子水 4.1ml 30%丙烯酰胺 1ml 1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml 10%SDS 60μl 10%AP 60μl TEMED 6μl
Western blot
是什么？
Western Blot
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝 酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－DNA 杂交检测特定的DNA片段的方法，称为 Southern印迹法。
• 9．
• • • •
10XTBS缓冲液
Tris（MW121.14） 24.2g NaCl 80.0g 蒸馏水至 1000ml （浓盐酸调pH至7.6），溶解后室温保存。
• 10．1XTBST缓冲液
• • • •
10XTBS缓冲液 100ml 蒸馏水 900ml Tween-20 1 ml 因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产 生气泡。 • 溶解后室温保存。
• 11．封闭液/抗体稀释液（5%脱
脂牛奶)：
• 1XTBST缓冲液 95-100 ml • 脱脂奶粉 5g • 溶解后4℃保存，可于一周内使用。
• 其他试剂
• 一抗、二抗、显影液、定影液、ECL化 学发光试剂 • A 和 B 两种试剂
Western Blot 的具体步骤
3.SDS-PAGE电泳
• 4. 10％过硫酸胺（AP）
• 过硫酸胺 0.1g • 蒸馏水 1ml • （现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管 中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后， 4℃保存，保存时间为1周）
• 5．
•
四甲基乙二胺原液 （TEMED）： 4C保存。 6． 30%丙稀酰胺： 4C保存。
Western Blot 的具体步骤
4.转膜 原理：
蛋白因结合SDS而带电 荷，转膜即在电场作用 下从胶中转至膜上的过 程。
Western Blot 的具体步骤
4.转膜
方法 仪器 特点
半干转
半干式转膜速度快，适 合与小分子量蛋白 两种方法的转 膜液不同！！
湿 转
湿式成功率高并特别适合用 于分子量大于 100KD的蛋白
• 7．
• • • • •
5X电泳液缓冲液
Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5.00g 蒸馏水至 100制成800ml即可。
• 8．
10X转膜缓冲液
• 甘氨酸（MW75.07） 151.1g • Tris（MW121.14） 30.3g • 蒸馏水至 1000ml • 溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。 • 通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即 可。（先加甲醇易产生沉淀）
埃德温· 迈勒· 萨瑟恩 （Edwin Mellor Southern）
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印 迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分 析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为 Eastern印迹法。
能做什么？
Western Blot

2、按前面方法配 10％分离胶，加入TEMED 后立即 摇匀即可灌胶。灌胶时， 可用 10ml 枪吸取 5ml 胶 沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。 然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶 时开始可快一些，胶快到所需高度时要放慢速度。 操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有 气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
Western Blot

3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已 凝了。再等 3min 使胶充分凝固就可倒去胶上 层水并用吸水纸将水吸干。
Western Blot

4、配4 ％的浓缩胶,加入TEMED 后立即摇匀即可灌 胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶 中。灌胶时也要使胶沿玻璃板以免胶中有气泡产生。 插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会 收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在 浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩 胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻 将其拔出。
Western Blot 的具体步骤
3.SDS-PAGE电泳
3.电泳
电泳条件： 推荐：浓缩胶 80V 35——45min 分离胶 120V 45——75min
Western Blot 的具体步骤
3.SDS-PAGE电泳