植物组织中叶绿素含量测定

（无机及分析化学实验II-设计性实验）

一、实验目的

1．设计用分光光度计测定植物组织中的叶绿素

2. 学习利用文献资料设计研究方案

3. 掌握分光光度计测定植物组织中的叶绿素的原理与方法

二、原理：

叶绿素广泛存在于果蔬等绿色植物组织中，并在植物细胞中与蛋白质结合

成叶绿体。当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对

光、热较敏感；在酸性条件下，叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中

可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和甲醇。高等植物中叶绿素有两种，均

易溶于乙醇、乙醚、酒精和氯仿。

叶绿素a 叶绿素b

叶绿素a、b在长波方面最大吸收峰分别位于663nm和645nm，且两吸

收曲线相交于652nm处。叶绿素a、b的比吸收系数K为已知，可在663nm和

645nm测定试样吸光度（两组份混合试样测定，双波长法），根据Lambert－

Beer定律，列出浓度c与吸光度A之间的关系式：

663

＝82.04c a＋9.27c b (1)

645

＝16.75c a＋45.6c b (2)

（1）、（2）式中的A

663、A

645

为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的吸光度

度。

、c b为叶绿素a、b的浓度，单位为g/L。

82.04、9.27为叶绿素a、b在波长663nm时的比吸收系数16.75、45.6为叶绿素a、b在波长645nm时的比吸收系数。解方程式（1）（2），则得经验公式：

c a =12.7 A

663

-2.69 A

645

(3)

c b =22.9 A

645

-4.68 A

663

(4)

=（c a + c b）=20.2 A645+8.02 A663...... (5)

此时，c T为总叶绿素浓度，c a、c b为叶绿素a、b的浓度，单位为mg/L ，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算a、b总叶绿素的浓度。

仪器：分光光度计、电子天平、棕色容量瓶（如使用白玻容量瓶，可用报纸遮光）、小漏斗、滤纸

试剂：95%乙醇

三、实验步骤

1、试材的采集

采集新鲜植株叶片（或含叶绿素的其他组织），夹于双层报纸中，风干（不能置于太阳光下晒）。将风干材料处理成细小颗粒，装入封口塑料袋，避光保存。

2、待测液的制备

（1）叶绿素的浸提

精密称定风干后的样品（约0.1g）于20mL 95%乙醇中，在室温浸提36-48h。

（2）叶绿素浸提液定容

提取液过滤到50mL 棕色容量瓶（如使用白玻容量瓶，可用报纸遮光），用95%乙醇定容至50mL ，摇匀，置于暗处备用待测。 3、测量吸光度

取1cm 的比色皿，注入上述叶绿素酒精溶液，用95%乙醇为参比液，1cm 的比色皿为吸收池，分别在663nm 和645nm 波长测吸光度，每一波长读三次数，取平均值带入公式计算。如吸光度大于0.8，按倍数准确稀释（稀释倍数为n ），尽量使吸光度的测量值在0.2-0.8范围内。 4、结果计算

用测得的吸光度 A 663、 A 645，代入（3）式计算溶液中叶绿素a 的含量；代入（4）式中计算得到叶绿素b 的含量，代入（5）式计算得到叶绿素总含量。

计算植株中叶绿素含量时，需要考虑稀释因子。数据记录及处理：表1

表2

17周星期一、星期二（全天开放）采集新鲜树叶并把样品带到实验室来领塑料密封的试管，然后称量0.1g 新鲜样品用研钵磨碎，并用少量酒精洗涤并转移到塑料密封试管，稀释到50mL 的刻度，带回家避光保存，并于星期三，星期

-1

T mg L (mL)10001000100%

T c V w m ??=

?样

（）

四（全天开放）带到实验室测定吸光度，并计算浓度含量，交实验报告批改后登记成绩。

如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！

植物叶绿素类胡萝卜素测定方法

植物叶绿素类胡萝卜素测定方法叶绿素、类胡萝卜素含量的测定一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A,αCL式中:α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料:新鲜(或烘干)的植物叶片。 (二)仪器设备:1)分光光度计;2)电子顶载天平(感量0.01g);3)研钵;4)棕色容量瓶; 5)小漏斗;6)定量滤纸;7)吸水纸; 8)擦境纸;9)滴管。 (三)试剂:1)95%乙醇(或80%丙酮)(v丙酮:v乙醇=2:1的95%水溶液);2)石英砂;3)碳酸钙粉。暗中2h，0.5g，25ml 三、实验步骤 1)取新鲜植物叶片(或其它绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，剪碎(去掉中脉)，混匀。

2)将取好的样品放入25ml容量瓶中，加混合浸提液(无水乙醇:丙酮 =5:5)20ml，放在黑暗条件下，浸泡至叶片发白，用浸提试剂定容至25ml，摇匀备用。 3)把叶绿体色素提取液倒入1cm光径的比色皿内，以浸提试剂为空白测定吸光度。选择波长663 646 和470nm。四、实验结果计算叶绿素a的浓度 = 12.21 ， OD– 2.81 ， OD 633 646 叶绿素b的浓度 = 20.13 ， OD– 5.03， OD646663 类胡萝卜素浓度=(1000A-3.27C-104C)?229 单位 mg/L 470ab C(mg/L)*提取液总量(ml) 叶绿体色素含量(mg/g)= ____________________________ 烟叶重量(g)*1000 注意事项:操作避光研磨时间短些

(完整word版)叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A 与其中溶质浓度C 和液层厚度L 成正比，即A ＝αCL 式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm 时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a 、b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A ，并根据叶绿素a 、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a 、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。已知叶绿素a 、叶绿素b 的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm 处。已知在波长663nm 下叶绿素a 、叶绿素b 在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在波长645nm 处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据加和性原则列出以下关系式： A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2）式（1）（2）A 663nm 和A645nm 为叶绿素溶液在663nm 和645nm 处的吸光度，C a C b 分别为叶绿素a 、叶绿素b 的浓度，以mg/L 为单位。解方程（1）（2）组得 C a =12.72 A 663—2.59 A 645 (3) C b =22.88 A 645—4.67 A 663 (4) 将C a +C b 相加即得叶绿素总量C T C T ＝ C a 十C b ＝20.29A 645—8.05 A 663 (5) 从公式（3）、（4）、（5）可以看出，，就可计算出提取液中的叶绿素a 、b 浓度另外，由于叶绿素a 叶绿素b 在652nm 的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为30.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A 652）而求出叶绿素a 、叶绿素 b 总量所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算： C T ＝ 5 .341000 652 A (6) 有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。Licht-enthaler 等对Arnon 进行了修正，提出了 80%丙酮提取液中3种色素含量的计算公式： C a ＝12.21A 663—2.59 A 646 (7)

植物叶绿素测定方法

叶绿素含量的测定一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。（二）仪器设备：1）分光光度计；2）电子顶载天平（感量0.01g）；3）研钵；4）棕色容量瓶； 5）小漏斗；6）定量滤纸；7）吸水纸； 8）擦境纸；9）滴管。（三）试剂：1）95%乙醇（或80%丙酮）（v丙酮：v乙醇=2：1的95%水溶液）；2）石英砂；3）碳酸钙粉。暗中2h，0.5g，25ml 三、实验步骤 1）取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 2）称取剪碎的新鲜样品 0.2g ，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml 95%乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5m 3）取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 4）用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。 5）把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm 和645nm下测定吸光度。在波长663nm、645nm下或652nm测定吸光度。四、实验结果计算叶绿素a的含量 = 12.7 ? OD 663 – 2.69 ? OD 645 叶绿素a的含量 = 22.9 ? OD 645 – 4.86 ? OD 663 叶绿素a、b的总含量 = 8.02 ? OD 663 + 20.20 ? OD 645

YSI(多参数水质检测仪)测定叶绿素a浓度的准确性及误差探讨解析

上肠ｋｓｄ．（湖泊科学），２０１０，２２（６）：９６５－９６８ｈｔｔｐ：∥ｗｗｗ．ｊｌａｋｅｓ．ｏｒｇ．Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｈｋ∞＠ＩｌｉｇＩａｓ．ａｃ．ｃｎ＠２０ｌＯｂｙ如￡册耐矿ｋｋｓｃ泐鲫ＹＳＩ（多参数水质检测仪）测定叶绿素ａ浓度的准确性及误差探讨‘刘苑１”，陈宇炜Ｈ。，邓建明１’２（１：中国科学院南京地理与湖泊研究所湖泊与环境国家重点实验室，南京２１０００８）（２：中国科学院研究生院，北京ｌｏ００４９）摘要：Ｙｓｌ（多参数水质检测仪）由于其快速、轻便的特点，已广泛应用于野外水体中时绿素ａ的测定．通过将Ｙ跚溯得的叶绿素ａ值与分光光度法测定值进行比较，对Ｙｓｌ６６００水质测定的准确性和数据采集进行评估．结果显示，Ｙｓｌ测定值多数偏低。且与分光光度法测定值之间存在显著性差异；时间上，冬季比夏季具有更大的线性相关性．分段同归结果显示，随着叶绿素ａ浓度不断增大．两组数据的差值也不断增大．ＹｓＩ测定误差产生于３个方面：（１）测定前ＹｓＩ校准方法的不同；（２）其它种类具有荧光特性色素的存在；（３）ＹｓＩ自身结构．关键词：叶绿素ａ浓度；ＹＳＩ；分光光度法；误差ＤｉｓＣｕｓｓｉＯｎ０ｎａｃｃｕｒａｃｙａｎｄｅｒｒＯｒＳｆｏｒｐｈｙｔｏｐＩａｎＩ∞ｎｃｈｌｏｒｏｐｈｙ¨－ａｃｏｎｃｅｎｔｒａ埘０ｎａｎａＩｙＳｉＳｕｓｉｎｇＹＳｌ（ＭｕＩｔＩ－ｐａｒａｍｅｔｅｒｗａｔｅｒａｎａｌｙｚｅｒ）Ｕ［ＵＹｕ觚１ｒ，Ｃ胍ＮＹｈｗｅｉｌ＆ＤＥＮＧＪｉ柚ｍｉｎ９１．２巧ｓｃｉｅ，ｌｃｅｓ．Ｎｎ嘲ｉ他２、０００ｓ．Ｐ．Ｒｃｈｔ舱）（１：胁把研ｋ幻加ｆｏ秽巧上４妇＆妇懈４耐勖佃研珊跏ｆ，觑ｌ咖ｇ肺咄姚可＆珊，印砂研ｄ肠彻咖，劭加甜ＰＡｃ扭娜（２：Ｇ，眦妇纪＆幻Ｄｚ盯ｃＪ咖ｅ卵Ａ棚ｄ唧矿＆￡伽，＆驴ｆ，增ｌ（－Ｄ０４９，Ｐ．尼西ｆ，埘）Ａｂｓｔ陀ｃｔ：ＹｓＩ（Ｍｌｌｌｔｉ?ｐａ强ｌｎ曲盱ｗａｌｅｒ锄ａｌｙ蹭ｒ）ｉｓ诵ｄｅｌｙｕｓｅｄｔｏ山把皿ｉ肿ｐｈｙｔｌＤｍ锄ｋｔｏｎ６ｅＩｄｓｃｈｌ啪ｐｈｙｌｌ－ａｃｏｎｃｅｎｔｒ撕加ｉｎｍ蛐ｙｂｅｃ舢卵０ｆｉｔｓｒａｐｉｄｎｅ睇锄ｄｐｏｒｔａｂｌｅｎｅ鹄．Ｔｂｅｐｕ叩∞ｅ０ｆｔｌｌｉｓ咖由ｉ８ｔ０ｅｖａｌｕ砒ｅｔＩｌｅｅ伍ｃ卵ｙ０ｆｔ王ｌｅＹＳＩＥｎ“姒蛐ｅｎｔａｌＭｏ＿Ｉｌｉ试ｎｇｓｙｅ锄ｈｗ栅ｑＩｌａｌｉｔｙⅡ地ａ棚他眦“ｔｓａｎｄｄａｌａｃｏｕｅｃｔｉｏｎｂｙｃｏｍｐｆａｒｉＩｔｇｔｗ０ｇｒｏｕｐ邑０ｆｄａｌａ憾ｉｌｌｇ蚰啪ｌｔｏｒｙ耐｝

叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定

实验报告植物生理学及实验（甲）实验类型：课程名称：实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定姓名：专业：学号：指导老师：同组学生姓名：实验日期：实验地点：二、实验内容和原理一、实验目的和要求装四、操作方法与实验步骤三、主要仪器设备订六、实验结果与分析五、实验数据记录和处理七、讨论、心得一、实验目的和要求、掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。1 和b的方法及其计算。a2、熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素二、实验内容和原理以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。原理如下：80%的乙醇或95%叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，1、常用的丙酮提取。、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素2．盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。- COOCHCOO3 Mg + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH

HONC43230+C20H39OH 、3H+可依次被在酸性或加温条件下，叶-COOCOOCH39 20 绿素卟啉环中的Mg++取代反应。Mg2+, Cu2+ 取代Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+和H+ ) 取代(Zn2+) 绿色褐色、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。4645其中叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，5、定量分析。 652可直接用于总量分析。663用于定量叶绿素a,b及总量，而和C最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度根据朗伯-比尔定律， *k+C*kOD=Ca*k与吸光值之间有如下的关系： OD=Ca*k+C b2 1g/L和b的80查阅文献得，2b1 b1a1a2b时，比吸收系％丙酮溶液，当浓度为叶绿素a 值如下。数k k 比吸收系数波长/nm b 叶绿素a 叶绿素 9.27 82.04 663 45.60 645 16.75

叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定一.实验原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL.式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。就是吸光度的加和性。如欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。植物叶绿素含量测定----丙酮提取法高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。叶绿体色素的提取、分离和测定是研究它们的特性以及在光合中作用的第一步。叶片叶绿素含量与光合作用密切相关，是反眏叶片生理状态的重要指标。在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。 ● 叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或浸泡提取。叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。 ●利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。其数学表达式为： ●A=Kbc 式中：A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。 ●叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。叶绿素a 和b在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g·L-1时的吸光度）分别为82.04和9.27；在645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据Lambert-Beer定律,叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度（A663和A645）与溶液中叶绿素a、b和总浓度（a+b）（Ca、Cb 、Ca十b，单位为g·L-1），的关系可分别用下列方程式表示： ●A663=82.04C a+9.27C b （1） ●A645=16.76C a+45.60C b（2） ●C a=12.7 A663—2.59 A645(3) ●C b=22.9 A645—4.67 A663 (4) ●C a十b＝20.3 A645—8.04 A663 (5) ●

叶绿素a的测定(B)

叶绿素a的测定(B) 叶绿素是植物光合作用中的重要光和色素。通过测定浮游植物叶绿素，可掌握水体的初级生产力情况。在环境监测中，可将叶绿素a含量作为湖泊富营养化的指标之一。 1.水样的采集与保存可根据工作的需要进行分层采样或混合采样。湖泊，水库采样500ml，池塘300ml，采样量视浮游植物的分布量而定，若浮游植物数量较少，也可采样1000ml。采样点及采样时间同“浮游植物”。水样采集后应放置在阴凉处，避免日光直射。最好立即进行测定的预处理，如需经过一段时间（4～48h）方可进行预处理，则应将水样保存在低温（0～4℃）避光处。在每升水样中加入1%碳酸镁悬浊液1ml，以防止酸化引起色素溶解。水样在冰冻情况下（-20℃）最长可保存30d。 2.仪器设备（1）分光光度计（2）真空泵（3）离心机（4）乙酸纤维滤膜（孔径0.45um）（5）抽滤器（6）组织研磨器或其他细胞破碎器（7）碳酸镁粉末（8）90%丙酮

3.试验程序 (1)以离心或过滤浓缩水样，在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜。倒入定量体积的水样进行抽滤，抽滤时负压不能过大（约为50kpa）。水样抽完后，继续抽1～2min，以减少滤膜上的水分。如需短时期保存1～2d时，可放入普通冰箱冷冻，如需长期保存（30d），则应放入低温冰箱（-20℃）保存。 (2)取出带有浮游植物的滤膜，在冰箱内低温干燥6～8h后放入组织研磨器中，加入少量碳酸镁粉末及2～3ml90%的丙酮，充分研磨，提取液绿色a。用离心机（3000～4000r/min）离心10min。将上清液倒入5ml或10ml容量瓶中。 (3)再用2～3ml的90%的丙酮，继续研磨提取，离心10min，并将上清液再转入容量瓶中。重复1～2次，用90%的丙酮定容为5ml或10ml，摇匀。 (4)将上清液在分光光度计上，用1cm光程的比色皿，分别读取750nm、663nm、645nm、630nm波长的吸光度，并以90%的丙酮做空白吸光度测定，对样品吸光度进行校正。 4.计算方法叶绿素a的含量按如下公式计算 [11.64×(D663-D750)—2.16×（D645-D750）+0.10×（D630-D750）].V1叶绿素a（mg/m3）= ----------——-—————————————-----------------------———V.δ 式中：V——水样体积（L） D——吸光度 V1——提取液定容后的体积（ml） δ——比色皿光程（cm）

叶绿素A测定复习试题

叶绿素a测定复习试题一、填空题 1.叶绿素a的测定方法有和，环境监测(生物)技术规范中规定用。答：分光光度法；荧光光度法；分光光度法； 2.地表水环境质量标准(GHZB1-1999)中，对控制湖泊水库富营养化的特定项目之一叶绿素a作了明确规定：Ⅰ类水质的标准值为，Ⅱ类水质的标准值为，Ⅲ类水质的标准值为，Ⅳ类水质的标准值为，Ⅴ类水质的标准值为。答：≤0.001mg/L；≤0.004mg/L；≤0.01mg/L；≤0.03mg/L；≤0.065mg/L。 3.进行生物样品污染物测定的样品处理可概括为二个过程：第一步是将样品、、；第二步是将前一步处理过的样品以消除干扰，提高被测组分的浓度。答：分离；纯化；浓缩；分解消化或提取。 4.经丙酮浸取含有叶绿素a的溶液，以溶液为参比，在波长、、、下测定吸光度。在波长测定丙酮溶液的空白值。丙酮溶液空白值应不大于。答：丙酮；663nm；645nm；630nm；750nm；0.05。 5.经离心后的样品上清液，在750nm处测定吸光度，用以校正提取液的，当测定用1cm比色皿，吸光度超过时，提取液应。答：浊度；0.005；重新离心。二、问答题 1. 控制叶绿素a指标值的意义是什么？答：叶绿素a是反映水体富营养化的一个重要指标。控制叶绿素a就在于控制富营养化和藻类生物量，从而揭示湖库富营养化发生的内在实质。

2. 叶绿素a的涵义是什么？答：指水中藻类具有光合色素的叶绿素。 3.什么叫富营养化？答：营养物质特别是含氮和磷的化合物，在淡水或盐水中的富集。富营养化加速了藻类和较高等植物的生长。 4.评定水质富营养化的几种类型标准是什么？答：参照国际经济合作与发展组织(OECD)规定和关于评定湖泊富营养化状态的叶绿素a划分标准：以≥78μg/L为重富营养型；11—78μg/L为富营养型；3.0—11μg/L为中营养型；＜3.0μg/L为贫营养型。 5.用于叶绿素a测定的水样应如何保存？答：每升水样加1%碳酸镁悬浊液1ml，以防止酸化引起色素溶解。如不能立即测定，则应在低温(0—4℃)避光保存。 6.叶绿素a测定方法的原理是什么？答：原理是：以丙酮溶液提取浮游植物色素，浸取液经过滤离心后，依次在663、645、630nm波长下测定吸光度，按Jettrey—Humphrey方程式计算，可得出叶绿素a的含量。 7.一般用于测定叶绿素a的样品采集多少量较合适？答：通常采样体积可根据水中叶绿素a含量的高低来确定，一般可采取1.5—2升。按浮游植物采样方法，湖泊、水库采样500毫升，池塘300毫升，按海洋监测方法规定，海水采取2—5升。 8.什么叫中营养水？答：天然发生的，或由于营养累积形成的中等营养状态的水，及介于贫营养和富营养之间的水。 9.什么叫贫营养水？答：贫营养物且含高浓度腐殖质的水。

叶绿素a测定实验报告

叶绿素a测定实验报告（一）实验目的及意义水体富营养化可以通过跟踪监测水中叶绿素的含量来实现，其中叶绿素a是所有叶绿素中含量最高的，因此叶绿素a的测定能示踪水体的富营养化程度。（二）水样的采集与保存 1.确定具体采样点的位置 2.在采样点将采样瓶及瓶盖用待测水体的水冲洗3-5遍 3.将采样瓶下放到距水面0.5-1m处采集水样2.5L 4.在采样瓶中加保存试剂，每升水样中加1%碳酸镁悬浊液1mL 5.将采样瓶拧上并编号 6.用GPS同步定位采样点的位置（三）仪器及试剂仪器： 1.分光光度计 2.比色池：10mm 3.过滤装置：过滤器、微孔滤膜（孔径0.45μm，直径60mm） 4.研钵 5.常用实验设备试剂： 1.碳酸镁悬浮液：1%。称取1.0g细粉末碳酸镁悬浮于100mL蒸馏水中。每次使用时要充分摇匀 2.乙醇溶液（四）实验原理将一定量的试样用微孔滤膜过滤，叶绿素会留在滤膜上，可用乙醇溶液提取。将提取液离心分离后，测定750、663、645、630mm的吸光度，计算叶绿素的浓度。（五）实验步骤 1.浓缩：在一定量的试样中添加0.2mL碳酸镁悬浮液，充分搅匀后，用直径60mm 的微孔滤膜吸滤.过滤器内无水分后,还要继续抽吸几分钟.如果要延时提取,可把载有浓缩样品的滤膜放在干燥器里冷冻避光贮存。 2. 提取：将载有浓缩样品的滤膜放入研钵中，加入7mL乙醇溶液至滤纸浸湿的程度,把滤膜研碎,再少量地加乙醇溶液，把滤膜完全研碎，然后用乙醇溶液将已磨碎的滤膜和乙醇溶液洗入带刻度的带塞离心管中，使离心管内提取液的总体积不超过10mL，盖上管塞，置于的暗处浸泡24h。 3.离心：将离心管放入离心机中，以4000r/min速度离心分离20min。将上清液移入标定过的10mL具塞刻度管中，加少量乙醇于原提取液的离心管中，再次悬浮沉淀物并离心，合并上清液。此操作重复2-3次，直至沉淀不含色素为止，最后将上清液定容至10mL。 4.测定：取上清液于10mm的比色池中，以乙醇溶液为对照溶液，读取波长750,663,645和630mm的吸光度。

叶绿素含量测定方法(精)

叶绿素含量测定方法---丙酮法由于微藻的生长周期比较复杂，包括无性繁殖阶段和有性繁殖阶段，其在不同阶段的生理形态不同，有时藻细胞会聚集在一起，以片状或团状形式存在，在显微镜下难以确定其所包含的细胞数量。藻细胞中叶绿素的含量（特别是叶绿素a的含量）通常随与细胞的生长呈较好的线性关系，因此可通过测定藻细胞中叶绿素含量变化来反映微藻的生长情况。叶绿素测定采用丙酮研磨提取法。取适量藻液于10 mL离心管中在4000 rpm转速下离心10 min，弃去上清液，藻泥中加入适量的100 %的丙酮。采用丙酮提取法时在试管研磨器中冰浴研磨5 min，4000 rpm离心后，上清液转入10 mL容量瓶中。按上述方法对藻体沉淀进行萃取，直至藻体沉淀呈白色为止。定容后，采用722S型可见分光光度计分别测定645 nm和663 nm下萃取液的吸光值，叶绿素含量用以下公式进行计算（Amon,1949）：叶绿素a含量用以下公式进行计算： Chlorophyll a (mg/L) = (12.7×A663 nm－2.69×A645 nm)×稀释倍数叶绿素b含量用以下公式进行计算： Chlorophyll b (mg/L) = (22.9×A645 nm－4.64×A663 nm)×稀释倍数叶绿素总含量用以下公式进行计算： Chlorophyll a＋b (mg/L) = (20.2×A645 nm＋8.02×A663 nm)×稀释倍数由于丙酮的沸点较低，较高温度下挥发很快。此外，叶绿素稳定性较差，见光易分解，因此，本实验中叶绿素的提取和测定均在低温黑暗条件下进行，以减少提取过程中的损失。叶绿素提取方法提取液：本试验用DMSO/80%丙酮(l/2，v/v)提取的叶绿素，谭桂英周百成底栖绿藻叶绿素的二甲基亚砜提取和测定法* 海洋与湖沼 1987 18（3）295--300. 一、直接浸提法： 1、准确量取10ml藻液,加到15ml离心管中，放在台式离心机离心，3500r/min （根据不同的藻选择不同那个的离心转速）离心5min倒上清；留藻泥。随后在盛有藻泥的离心管中加入蒸馏水，与藻泥混匀后再次离心，目的是除去藻细胞表面的盐份，此清洗过程重复三次。 2、往藻泥中加二甲基亚砜3.33ml，65℃水浴9h，20h； 3、然后离心，将上清转移到10ml棕色瓶中， 4、添加6.67ml80%丙酮到离心管中，混匀，离心，再将上清转移到10ml棕色瓶中。 5、定容，待测。

植物组织中叶绿素含量测定

植物组织中叶绿素含量测定（无机及分析化学实验II-设计性实验）一、实验目的 1．设计用分光光度计测定植物组织中的叶绿素 2. 学习利用文献资料设计研究方案 3. 掌握分光光度计测定植物组织中的叶绿素的原理与方法二、原理：叶绿素广泛存在于果蔬等绿色植物组织中，并在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体。当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光、热较敏感；在酸性条件下，叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和甲醇。高等植物中叶绿素有两种，均易溶于乙醇、乙醚、酒精和氯仿。叶绿素a 叶绿素b 叶绿素a、b在长波方面最大吸收峰分别位于663nm和645nm，且两吸收曲线相交于652nm处。叶绿素a、b的比吸收系数K为已知，可在663nm和 645nm测定试样吸光度（两组份混合试样测定，双波长法），根据Lambert－

Beer定律，列出浓度c与吸光度A之间的关系式： A 663 ＝82.04c a＋9.27c b (1) A 645 ＝16.75c a＋45.6c b (2) （1）、（2）式中的A 663、A 645 为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的吸光度度。 c a 、c b为叶绿素a、b的浓度，单位为g/L。 82.04、9.27为叶绿素a、b在波长663nm时的比吸收系数16.75、45.6为叶绿素a、b在波长645nm时的比吸收系数。解方程式（1）（2），则得经验公式： c a =12.7 A 663 -2.69 A 645 (3) c b =22.9 A 645 -4.68 A 663 (4) c T =（c a + c b）=20.2 A645+8.02 A663...... (5) 此时，c T为总叶绿素浓度，c a、c b为叶绿素a、b的浓度，单位为mg/L ，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算a、b总叶绿素的浓度。仪器：分光光度计、电子天平、棕色容量瓶（如使用白玻容量瓶，可用报纸遮光）、小漏斗、滤纸试剂：95%乙醇三、实验步骤 1、试材的采集采集新鲜植株叶片（或含叶绿素的其他组织），夹于双层报纸中，风干（不能置于太阳光下晒）。将风干材料处理成细小颗粒，装入封口塑料袋，避光保存。 2、待测液的制备（1）叶绿素的浸提精密称定风干后的样品（约0.1g）于20mL 95%乙醇中，在室温浸提36-48h。（2）叶绿素浸提液定容

2-4叶绿素a测定

实验题目: 湖塘水体叶绿素a测定姓名：学号：班级：组别：第一组指导教师： 1.实验概述 1.1实验目的及要求 (1)初步了解叶绿素a测定的原理和常规测定方法; (2)通过实验，掌握叶绿素。的测定方法及富营养化水样的前处理方法; (3)熟练掌握抽滤装置及分光光度计的使用。 1.2实验原理浮游植物的主要光合色素是叶绿素((Chlorophyll)，常见的有叶绿素a、b和c。叶绿素a (chl-a >存在于所有的浮游植物中，大约占有机物干重的1-2%，是估算浮游植物生物量的重要指标，因此浮游植物叶绿素a含量的测定成为浮游植物生物量的重要指标而被广泛应用。浮游植物叶绿素a的测定方法有许多种，根据所使用的仪器可以分为高效液相色谱法

萃取效率比较低，使得甲醇和乙醇成为替代丙酮的色素萃取剂。不过，甲醇对人体毒害性大，且在酸化过程中容易产生误差，于是，乙醇成为现在广泛应用的叶绿素a的萃取剂。超声破碎法因快速、提取效率高等特点也被研究者所青睐。本实验介绍一种以热乙醇为萃取溶剂，结合超声细胞破碎法为基础的叶绿素a含量侧定方法。 2.实验内容 2.1实验方案设计每组选择一个池塘，实地取水样，测定水样的叶绿素a含量。 2.2实验条件 2.2.1实验仪器: 1) 幼分光光度计1台; 2)抽滤装置(砂芯过滤器、负压表、真空泵等)1台; 3)4000r/min离心机1台; 4) 15mL带刻度及螺旋盖的离心分离试管6个; 5)恒温水浴锅1台; 6)直径47 mm的醋酸纤维滤膜; 8)超声细胞破碎仪 9 ) icm玻璃比色皿2个 10)表面皿若干 11)10mL比色管7个; 2.2.2实验材料 1）90%乙醇 2）1mol/L盐酸 2.3实验过程（实验步骤、记录、数据、分析） 2.3.1实验步骤

叶绿素含量的测定

植物生理学实验报告实验题目：叶绿素含量的测定姓名班级学号

一、实验原理和目的根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比。叶绿素(丙酮)在652nm(混合）、663nm、645nm有最大吸收峰。叶绿素(95%乙醇)在665nm、649nm，类胡萝卜素在470nm有最大吸收峰，根据在分光光度计下测定的吸光度，求得叶绿素的含量二、实验器具和步骤植物材料：女贞实验器具：分光光度计；电子天平；研钵；试管；小漏斗；滤纸；吸水纸；移液管；量筒；剪刀试剂：95％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉步骤：1.称取剪碎的新鲜样品0.1g 左右，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3～5ml 95％乙醇，研成均浆，继续研磨至组织变白。静置3～5min 2. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到10ml试管中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 3.用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入漏斗中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至10 ml ，摇匀 4. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm、470nm下测定吸光度 5. 计算公式：叶绿素的含量（mg/g）= (浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重。 Ca=13.95A665－6.88A649； Cb=24.96A649－7.32A665 C类=(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245 单位：mg/L 三、实验数据和作业

2、计算叶绿素含量计算公式：叶绿素的含量（mg/g）= (浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重。 Ca=13.95A665－6.88A649； Cb=24.96A649－7.32A665 C类=(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245 单位：mg/L 由上面的公式进行代入计算，有： Ca=13.95*1.820-6.88*0.953=18.83236 Cb=24.96*0.953-7.32*1.820=10.46448 C类=（1000*1.948-2.05*18.83236-114.8*10.46448）/245=2.8901 则：叶绿素含量=（29.29684*10*0.001*1）/0.1=2.9297 四、数据分析实验中可能清洗研钵和滤纸不是特别干净可能造成误差五、思考题为什么提取叶绿素时干材料一定要用80％的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取？答：因为叶绿素存在于叶绿体内囊体上与其上的蛋白质组成色素蛋白复合体，要分离叶绿素和蛋白质必须有水，叶绿素的头部为极性的，有亲水性

叶片叶绿素含量的测定

植物叶片中叶绿素含量测定----丙酮提取法 1、原理叶绿素a、b在长波的最大吸收峰分别在663nm、645nm，据Lamber-Beer 定律，可得浓度C与光密度D间的关系式： D663= + D645= + (浓度单位：g/mL）叶绿素a的浓度：Ca= – 叶绿素b的浓度：Cb= –D663 总叶绿素的浓度：Ct = + (浓度单位：mg/L） 2、试剂与材料试剂：丙酮、石英砂、碳酸钙材料：新鲜叶片。仪器与器皿：分光光度计、天平、剪刀、研钵、移液管、漏斗、大试管 3、实验步骤称叶用丙酮研磨 ↓ 匀浆过滤（用80%丙酮洗研钵及残渣，合并滤液） ↓ 滤液用80%丙酮定容至25mL ↓ 适当稀释后测A645、A663 取样：称取剪碎的叶片（提供的样品即为剪碎后冻于-80℃的叶片）放入研钵中。注意取样时要避开大的叶脉。研磨提取：向研钵中加入80%丙酮，以及少许（约）CaCO3 (中和酸性，防止叶绿素酯酶分解叶绿素) 和石英砂，研磨成匀浆，再加入3ml 80%丙酮，继续研磨至组织变白，在暗处静止3~5min后，用一层干滤纸过滤到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙酮将研钵洗净，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后，用80%丙酮定容至刻度。读取吸光度：取厚度为lcm的洁净比色皿，注意不要用手接触比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗2~3次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的4/5，将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉（注意不能擦），再用擦镜纸擦干擦净。将比色

叶绿素a测定

实验三富营养化湖中藻量的测定（叶绿素 a 法）、实验目的富营养化湖由于水体受到污染，尤以氮磷为甚，致使其中 10微克 /升。本实验通过测定不同水体中藻类叶绿素 a 浓度，以考查其富营养化情况。二、器材与用品分光光度计（波长选择大于 750nm ，精度为0.5— 2nm ）。蔡氏滤器；滤膜（ 0.45 微克，直径 47mm ）。的藻类旺盛生长。此类水体中代表藻类的叶绿素 a 浓度常大于 1、 2、比色杯（ 1cm ； 4cm ）。 3、台式离心机（ 3500r/min ） 4、离心管（ 15ml 具刻度和塞子）；冰箱 5、匀浆器或小研钵。 6、 7、真空泵（最大压力不超过 300kpa ）。

MgC03悬液：Ig MgC03细粉悬于100ml 蒸馏水中。 90％的丙酮溶液： 90 份丙酮＋ 10 份蒸馏水。 10、水样：两种不同污染程度的湖水水样各 2L. 三、方法和步骤 8、 9、

1、按浮游植物采样方法，湖泊、水库采样500ml ,池塘 300ml 。采样点及采水时间同“浮游植物” 2、清洗玻璃仪器：整个实验中所使用的玻璃仪器应全部用洗涤剂清洗干净，尤其应避免酸性条件下而引起的叶绿素 a 分解。 3、过滤水样；在蔡氏滤器上装好滤膜，每种测定水样取 500ml 减压过滤。待水样剩余若干毫升之前加入 0.2ml MgCO 3 悬液、摇匀直至抽干水样。加入 MgCO 3 可增进藻细胞滞留在滤膜上，同时还可防止提取过程中叶绿素 a 被分解。如过滤后的载藻滤膜不能马上进行提取处理，应将其置于干燥器内，放冷（4C ）暗处保存，放置时间最多不能超过 48小时。 4、提取；将滤膜放于匀浆器或小研钵内，加 2 - 3ml90 %的丙酮溶液，匀浆，以破碎藻细胞。然后用移液管将匀浆液移入刻度离心管中，用 5ml90%丙酮冲洗2次，最后向离心管中补加 90%丙酮，使管内总体积为 10ml 。塞紧塞子并在管子外部罩上遮光物，充分振荡，放冰箱避光提取 18－24小时。离心10min ，取出离心管，用移液管将上清液移入刻度离心管中，塞上塞子，3500r/min 在离心10min 。正确记录提取液的体积。 6、测定光密度：藻类叶绿素 a 具有其独特的吸收光谱 (663nm )，因此可以用分光光度法测其含量。用移液管将提取液移入 1cm 比色杯中，以 90％的丙酮溶液作为空白，分别在 750、663、645、630nm 波长下测提取液的光密度值( OD )。注意：样品提取的 O D 663值要求在 0.2与 1.0 之间，如不在此范围 50－ 5、离心：提取完毕后，置离心管于台式离心机上 3500r/min ，

测定叶绿素a和b的方法及其计算完整版

测定叶绿素a和b的方法及其计算 Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】

实验二十五测定叶绿素a和b的方法及其计算一目的要求：熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。二实验原理：如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。如图z-4叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。图z-4 叶绿素a和b的吸收光谱曲线横坐标为波长（nm），纵坐标为比吸收系数根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下的关系： OD1=Ca·ka1+Cb·kb1 （1） OD2=Ca·ka2+Cb·kb2 （2）式中：Ca为组分a的浓度，g/L。 Cb为组分b的浓度，g/L。 OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。 OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。

ka1为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长λ1时的光密度OD值。 kb2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长λ2时的光密度OD值。 ka2为组分a（浓度为1g/L），于波长λ2时的光密度OD值。 kb1为组分b（浓度为1g/L），于波长λ1时的光密度OD值。从文献中可以查到叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下：将表中数值代入上式（1）、（2），则得： OD663=×Ca+×Cb OD645=×Ca+×Cb 经过整理之后，即得到下式： Ca= OD645 Cb= OD663 如果把Ca，Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式： Ca= OD645 （3） Cb= OD663 （4） CT= Ca+ Cb= OD663+ OD645 （5）（5）式中CT为总叶绿素浓度，单位为mg/L。利用上面（3）、（4）、（5）式，即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度（mg/L）。 [附注]一般大学教学实验室所用的分光度计多为721型，属低级类型，其单色光的半波宽要比中级类型的751型宽得多，而叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm（663-645nm），难以达到精确测定。此外有时还由于仪器本身的标称波长与实际波长不符，

水体叶绿素a测定方法

叶绿素a的测定方法一一乙醇+分光光度法 1、水样的保存水样注入水样瓶后，应放置在阴凉处，并避免阳光直射。若水样的进一步处理需要较长时间（大于12h）,则应置于0°C?4 °C低温下保存。水样量视水体中浮游植物多少而定，一般应采0.5~2L 。 2、抽滤在抽滤装置的滤器中放入GF/C滤膜。抽滤时负压应不大于50kPa。抽滤完毕后，用镊子小心地取下滤膜，将其对折（有藻类样品的一面向里），再用普通滤纸吸压，尽量去除滤纸上的水分。如不立即提取，应将滤膜放在黑暗低温条件下保存。在普通冰箱冷冻室中可存放几天，在-20C低温冰箱中可保存30天。 3、提取研磨可用玻璃研钵。将滤膜剪碎放入研钵，加入90%乙醇溶液7?8ml，研磨3~5分钟直至变为匀浆。将研磨后的匀浆移入具塞带刻度的离心管中。用少量提取液冲洗研钵或匀浆器，冲洗液并入离心管中，使终容积略小于10ml o盖上关塞，摇动后置于黑暗低温处进行提取至少6-24h 。 4、离心将装有提取液的离心管放入离心机中，转速3500?4000rpm,离心10?15min。将上层叶绿素提取液移入定量试管中，再用少量提取液清洗、离心二次取得提取液。最后将提取液定容到10ml。如果大批样品需同步操作时，可减少离心步骤，直接在提取液中浸泡滤膜6-24h ，取其清液即可。 5、测定用90%乙醇溶液作为参照液（参照比色皿中盛放90%乙醇溶液，并用90%乙醇调分光光度

计零点）。测定定容后的提取液在665nm和750nm处的吸光度，并计算两个吸光度的差记为A; 然后向比色皿中加入1滴1mol/L的盐酸酸化，酸化5—10min(可以用不同时间实验再进行调整)后再次测定酸化后的提取液在665和750nn处的吸光度，并且把酸化后的两个吸光度的差记为A 则提取液中叶绿素a的浓度为： Chla=27.9 x( A- A) x V是取液/V 脱镁叶绿素浓度为： Chla=27.9 x( 1.7 A 2-A) x V是取液/V 其中Chla为水样中的叶绿素a含量，单位为ug/L ; V提取液为提取液的最终定容体积，单位为 mL; V为抽滤水样的体积，单位为L。

叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定有谁知道用分光光度计法测定叶绿素含量的具体步骤????谢谢!!!!!! 一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A 与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 电子顶载天平（感量0.01g）；3. 研钵；4. 棕色容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量滤纸；7. 吸水纸；8. 擦境纸；9. 滴管。（三）试剂：96％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。三、实验步骤 1. 取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。四、实验结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A665－6.88A649；Cb=24.96A649－7.32A665。据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重（或干重）。