细胞种板技术经验
细胞培养基本知识基本技术
– 絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成， 这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理
– 显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成 会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常 误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生 长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批 号的血清
• 原代细胞：从机体取得组织材料，在体外
培养生长，到第一次传代前。
• 传代细胞：当原代细胞持续生长繁殖一段
时间，达到一定的细胞密度后传代的细胞。
培养瓶培养法
方法： 将培养对象直接接种于培养瓶内，再放
入培养箱进行培养。
优点： 1、可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物 的影响。 2、可以方便地进行显微镜观察、染色等操作， 以及永久保存。 3、增加了培养瓶的培养面积。
• 1943年Earle、Dulbecco等创建单层细胞培 养法，首建长期传代的L-细胞系。
• 1951年Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。
• 从50年代末开始，组织培养技术应用进入 了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和 医学研究各个领域。
无血清培养
无血清培养基:是不需要添加血清就可以维持细胞在
缺点：体外培养的细胞不能完全等同于体 内的细胞。
应用
• 病毒学：病毒鉴定，病毒抗原作用，疫苗生产…… • 免疫学：杂交瘤-单克隆抗体…… • 遗传学：染色体分析…… • 肿瘤学：筛选重要的抗肿瘤药物…… • 分化及发育：刺激使细胞群体发生改变…… • 细胞毒实验：药效测试…… • 临床医学及生物技术：干细胞培养定向诱导分
化后移植；组织工程软骨损伤修复；试管婴儿……
细胞培养经验总结
基础篇-培养基
1. 液体培养基贮存于4℃ 冰箱，避免光照，实验进行前 放在37℃ 水槽中温热。 2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量 glutamine。
3. 粉末培养基配制(以1 升为例)： 3.1. 细胞培养基通常须添加10 % 血清，因此粉末培养基 之配制体积为900 ml，pH 为7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添 加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末 应分别溶解后才混合，然后用CO2 气体调整pH，而非用 强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有 影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。
步骤： 1. 以待测试培养基培养MDCK cell，接种MDCK 细胞于6-well plate (或 35mm TC dish) 中，每个well 接种1 × 102 活细胞，同时作对照组实验。 2. 接种5～7 天后，在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细 胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。 3. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室温 下静置10 min。 4. 去除固定液，水洗二次。 5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。 6. 去除染液，水洗二次。 7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞 生长不佳，则丢弃之。
细胞培养经验总结
3.2. 材料： 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要) ，粉末培 养基 ，NaHCO3 ，电磁搅拌器 无菌血清瓶 ，0.1 或0.2 mm无菌过 滤膜 ，pH 计，真空泵，CO2 气体 3.3. 步骤： 3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。 3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末溶于200ml milli-Q 水中，搅拌使其溶 解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5 分钟。 3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基 中混合。混后溶液之pH 应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不 需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2 气体调整pH。培养 基以真空帮浦通过过滤膜时，pH 会升高0.1-0.2。 3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器 中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。(血清亦可加 入培养基中一起过滤) 3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。
细胞培养技术总结-重要
细胞培养及检测相关技术小结一、细胞培养基配制以1000ml培养基为例。
1000ml成骨细胞培养基 = 850mlα－MEM培养液 + 150 ml 特级胎牛血清FBS (15%)(1). α－MEM powder: 10.2 g/L ~~~ 8.67 g for 850 ml(2). NaHCO3: 2.2 g/L ~~~ 1.87 g for 850 ml(3). Twice distilled water 850 ml, dissolve the powder in water(4). FBS (15%,v/v) 150 ml(5). Filter to sterilized bottle(6). Label the bottle and store in 4℃.Notes: 4,5 should be operated in the sterile working place. And if necessary, we can add some antibiotics into the medium（usually in primary cell culture）. 二、PBS（10×）NaCl: 80g/LKCl: 2g/LNa2HPO4: 14.4 g/LKH2PO4: 2.4 g/LPH=7.4, with HCl or NaOHToo much PO42-is harmful to cell, so only very little amount is necessary. Get some certain to dilute this 10 times concentration PBS when we need.三、胰蛋白酶Trypsin- EDTA 消化液(10×)This solution is used for cell released from the culture flask。
细胞传代、换液、给药和种板
[实验器材] 0.25%胰酶、胎牛血清、F-12培养基、PBS、培养瓶、5ml白枪头、15ml、50ml离心管[实验步骤]1、取出细胞，显微镜下观察细胞形态和密度，确定细胞生长状况，是否需要传代或换液；2、将培养基、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒结束后，将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台，将废液缸喷足酒精移入超净台，取酒精棉放入超净台；3、点燃酒精灯，将瓶口拧松，过火消毒；4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下，5、用适量PBS清洗细胞表面，并弃去PBS；6、加入适量胰酶消化细胞，此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内消化；待消化完全后，用胰酶2倍体积的完全培养基中止消化，将细胞移入离心管1000rpm，5min离心；7、弃上清，加适量完全培养基吹打混匀细胞(沿壁轻轻吹打24次左右)，按合适比例进行细胞传代，在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱；8、收拾物品，整理实验台，做试验记录，打开超净台和细胞间紫外，30min后关闭细胞的换液[实验器材]培养基、胎牛血清、50ml离心管、5ml白枪头、PBS(白枪头、离心管提前高压)[实验步骤]1、将培养基、PBS、离心管放入超净工作台，紫外灯照射30min。
将胎牛血清从-20℃放入37℃水浴锅内，完全溶解后拿出。
2、用50ml离心管配置适当浓度的血清培养基。
3、将细胞拿出，吸去培养基，用3mlPBS洗2次，各瓶加入4ml血清培养基。
4、整理洁净台！细胞的给药[实验器材]培养基、胎牛血清、50ml离心管、5ml白枪头、PBS(白枪头、离心管提前高压)、皮质酮、咖啡因[实验步骤]1.将培养基、PBS、离心管放入超净工作台，紫外灯照射30min。
将胎牛血清从-20℃放入37℃水浴锅内，完全溶解后拿出。
2.用50ml离心管配置适当浓度的血清培养基。
3.在15ml离心管中配置皮质酮及咖啡因浓度梯度。
4.按2ml/孔加入6孔板中，做好标记。
细胞计数方法------细胞计数板法
细胞计数方法------细胞计数板法实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：1. 将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。
2. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
3. 计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。
然后按公式计算：细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104个/ml(注：当细胞很多时，可在四个格中选一定数目较平均的小格，由于每大格中有16个小格，然后计左侧和上方的细胞数，求出每小格的细胞数，取平均值m，m ×16即每个格的平均值。
所以，细胞密度=m×16×104个/ml)说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3而 1ml=1000ul=1000mm3（注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
）================================================细胞计数板的使用一、血球计数板-基本构造血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数区。
计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。
但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
培养板需要加入培养基的体积以及细胞数量 各种规格细胞培养板需要加入的培养基的体积，可以参考下表。
培养器皿
面积（cm2 ）
96孔板
0.32
48孔板
0.95
24孔板
1.91
12孔板
3.83
6孔板
9.5
3.5cm培养皿 9.6
6cm培养皿 21.3
10cm培养皿 58.1
25cm培养皿 25
75cm培养皿 75
80%），还要综合考虑转染试剂对细胞密度的要求等。 2. 细胞生长的速度，细胞的大小，细胞处理的时间长度（24h，48
h...）。 3. 根据后续相应检测试剂盒的要求（CCK-8,细胞周期，流式，荧光染
色等）。
培养板中细胞数量的控制： ❖1. 按照经验：一个培养瓶100%满后，大概可铺n个6孔板（2n个12孔板...）等,
X
✔
细胞铺板
常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，用适量的完全培养基重悬 细胞。
细胞计数板计数原理
细胞计数板计数原理什么是细胞计数板细胞计数板，也称为海姆斯希计数板（Hemocytometer），是一种常用的实验室工具，用于计数和测量细胞数量。
它通常由玻璃制成，具有一个规定大小的网格板和一个盖片，网格板上刻有成规定尺寸的小方格。
通过在细胞计数板上放置细胞样品，然后通过显微镜观察和计数来确定细胞的浓度和数量。
细胞计数板的主要原理细胞计数板的计数原理基于以下几个方面：1. 成浓缩在使用细胞计数板之前，通常需要对细胞样品进行合适的稀释。
这是为了使细胞浓度在可观察范围内，并且避免细胞过于密集而无法准确计数。
通常使用缓冲溶液或染色剂来稀释样品。
2. 通过计数网格来估算细胞浓度细胞计数板的上方刻有一个特定尺寸的计数网格，通常是一个9或16个小方格组成的大方格。
每个小方格都再次划分成16个更小的方格。
通过显微镜观察，将视野对准计数板上的网格，并记录每个小方格中的细胞数量。
3. 统计与浓度计算在细胞计数过程中，对细胞数量进行计数，并记录每个小方格中的细胞数。
然后，将每个小方格中的细胞数加总，根据总数以及某个特定体积的稀释液，可以推算出细胞的浓度。
细胞计数板的使用步骤下面是一般情况下使用细胞计数板的步骤：1.准备样品稀释液：根据细胞样品的浓度，将其使用合适的溶液（比如缓冲溶液）稀释到合适的浓度，使细胞数在500至5000个之间。
2.取一小部分稀释后的细胞样品并将其放置在细胞计数板的装载槽中。
注意不要过量装载以确保细胞在每个小方格中均匀分布。
3.将细胞计数板覆盖盖片，确保细胞在网格上均匀分散。
4.使用显微镜将细胞计数板放置在平台上，并选择适当的放大倍数来观察细胞。
5.计数过程：从一个固定的起点开始，观察每个小方格并记录其中的细胞数。
按照一定的顺序，逐个计算每个小方格中的细胞数并记录。
6.统计计数：将每个小方格中的细胞数加总，并将总数除以小方格的数量得到每个小方格的平均细胞数。
7.计算细胞浓度：通过将每个小方格的平均细胞数乘以稀释液的体积来计算细胞的浓度。
细胞板方法和注意事项
细胞板方法和注意事项
以下是 6 条关于细胞板方法和注意事项的内容：
1. 细胞板的使用呀，就像搭积木一样，得有耐心和技巧呢！比如说在进行细胞培养时，放置细胞板可不能随随便便，得轻轻的、稳稳的，就像呵护小宝宝一样。
你可别用力过猛把它给弄碎了呀！不然一切都前功尽弃啦！
2. 嘿，细胞板方法里面学问可大了去啦！就拿细胞接种来说，那得均匀地把细胞铺在板上，这可不是随便撒撒就行的哦。
你想想看，要是这边一堆那边没有，那不是乱套了嘛！所以一定要仔细认真呀，可别犯糊涂哟！
3. 细胞板的注意事项可不能小瞧呀！好比说保持细胞板的清洁，这就像是给家里做大扫除一样重要。
要是脏兮兮的，细胞能生长好才怪呢！你说对吧？千万不能偷懒不做好清洁这一步呀！
4. 哇塞，细胞板方法如果没掌握好，那可不得了呀！就像做饭时调料放错了，味道全变了。
像细胞培养的条件，温度呀、湿度呀，都得严格把控，不能有一点差错呢，你难道不想把细胞养得健健康康的嘛？
5. 哎呀呀，细胞板的这些注意事项你可得牢记在心呀！比如不要让细胞板受到污染，这就好像保护自己的宝贝不让别人碰到一样。
稍有不慎，整个实验可能就毁了呢！你可别不当回事呀！
6. 细胞板呀，要小心对待它哟！像操作的时候动作得轻柔，不能毛毛躁躁的。
这就跟对待一件珍贵的瓷器一样，稍微粗鲁点就可能损坏啦。
你说是不是得
格外小心呢？总之，一定要重视细胞板的方法和注意事项，这样才能让实验顺顺利利的呀！。
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2、
3、2、加的过程中，每加3排细胞时晃动一下装有细胞悬液的器皿，防止细胞在未加到板子上时就沉底了（重要）。
4、
5、3、加完细胞后不要做任何拍打96空板的操作，直接慢慢平移到培养箱内即可。
6、
7、4、以后换液或加药时，枪头不要抵触到孔的底部，加到侧壁即可。
8、
9、5、种细胞时横排接种，加药时纵向加药，这样可以有效的避免因接种细胞不均匀造成的误差。
希望对大家有帮助。从6孔板到96空板要细胞分散均匀，先用培养基把细胞稀释好，再把培养板放在适当的位置，加入细胞时和加入细胞后不移动培养板；如果空中有的地方没有培养基可吹打，但不要移动培养板，加入细胞后静置20-30分钟再移入培养箱。这样细胞一般都能长的很均匀。当然，前提是细胞消化的很好。
6、96孔板加完细胞后不能晃动，但是24孔板最好混匀一下
2、新方法：这种方法简直是太好了，种的很均匀。先用抢将吹打均匀的细胞吸起来，让后将枪头紧
贴着孔的一侧壁（注意枪头的尖不要接触孔底），然后将枪头中的细胞缓缓的打下去，种好之后Байду номын сангаас万
不要摇晃板子，直接放到显微镜下看就可以了，此方法可以说是100%的有效吧。