环境微生物实验问题与答案

环境微生物实验问题与答案一、光学显微镜的操作及细菌单染色1、为什么油镜的放大倍数比普通物镜大？答：油镜能减少光的折射，进而提高视野的亮度；通过提高显微镜的数值口径增加显微镜的分辨力。

2、数值口径的表达公式？答案：N.A=n ×sin α，n为介质折射率；α为光线最大入射角的半数。

3、显微镜数值口径与分辨力的关系？答案：分辨力是指显微镜能辨别两点之间最小距离的能力，它与光的波长成反比，与数值口径成正比。

4、油镜的使用与普通物镜有何不同？答案：油镜必须借助于光折射率等于或接近于玻璃的试剂，如香柏油等才能使用，而普通物镜则不需要；油镜是由100×物镜与香柏油构成，而普通物镜则限于10×物镜、40×物镜等。

5、使用油镜时应特别注意什么？答案：上下调节镜头时应使用微螺旋，否则容易损坏镜头；应使油镜始终浸泡在香柏油中，否则就不是油镜；使用完毕后，必须用搽镜纸沾取二甲苯等有机溶剂搽去残留的油迹，否则会玷污油镜。

6、单染色的原理是什么？答案：主要基于微生物细胞能与各种染料进行不同程度地结合。

7、单染色过程中，为什么干燥固定？答案：因为通过干燥可以使菌体蛋白变性，细胞质凝固，进而可以使菌体紧密地附着于载玻片表面。

8、单染色过程中，为什么水洗时水流要缓慢地从载玻片上端流下？答案：因为如果水流直接冲洗有菌部位，容易使菌体被冲洗掉。

9、为什么载玻片要完全干燥后，才能使用油镜？答案：因为香柏油与水不相溶，容易造成光线发生折射或散射，一方面无法构成油镜，另一方面也会降低视野的亮度。

二、放线菌形态观察与细菌革兰氏染色1、革兰氏染色的原理是什么？答案：对于G+细菌来说，当用乙醇脱色时，由于肽聚糖含量高，网孔小，再加上脂量低，所以乙醇脱色后，进一步地缩小了网孔，结晶紫-碘复合物无法脱出，第二次用番红染色时无法着色，进而呈紫色；对于G-细菌来说，当用乙醇脱色时，由于肽聚糖含量低，网孔大，再加上脂量高，所以乙醇脱色后，进一步地扩大了网孔，结晶紫-碘复合物被脱出，第二次用番红染色时着色，进而呈红色。

2、革兰氏染色时，为什么要加碘液？答案：碘可以与结晶紫染料形成较大的复合物，从而可以阻止结晶紫向细胞外渗透；另一方面也可以增加结晶紫与细胞质的亲和力。

3、革兰氏染色时，为什么要用酒精冲洗？答案：加酒精是为了溶解细胞壁中的脂类和脱去细胞内的有机染料。

4、革兰氏染色时，为什么不能涂片太厚？答案：涂片太厚，容易使菌体重叠，造成假阳性。

5、革兰氏染色时，为什么说脱色是最关键的一步？答案：如果脱色时间较短，则容易使革兰氏阴性细菌脱色不完全，造成假阳性；如果脱色时间较长，则容易使革兰氏阳性细菌内的染料被脱出，造成假阴性。

6、革兰氏染色时，如何证明你的染色操作是正确的？答案：将革兰氏阳性细菌—葡萄球菌与革兰氏阴性细菌--大肠杆菌制成混合涂片，经革兰氏染色后，如果葡萄球菌呈紫色，而大肠杆菌呈红色，则说明染色操作是正确的。

三、无菌操作（补充）1、无菌操作过程中，为什么试管或三角烧瓶在开塞或回塞之前，口部要过火几次？答案：这样可以烧去管口或瓶口的微生物。

2、开塞后的试管或三角烧瓶口部微生物要平放？答案：如果口部向上或朝下，则容易通过空气对流污染培养物。

3、接种针接种前后微什么要过火焚烧？答案：主要防止微生物培养物之间交叉污染，也防止污染操作台面。

四、细菌的芽孢与荚膜染色1、芽孢和荚膜染色的原理是什么？用单染色可以看到芽孢吗？为什么？答案：根据细菌的芽孢与菌体对染料的亲和力不同，用不同的染料进行着色，使菌体与芽孢呈不同颜色，便于观察。

由于芽孢壁厚，不易着色，所以在染色时需加热，以便染料进入菌体。

荚膜主要成分是多糖，很难着色，因而只能采用衬托的方法将背景与菌体染色，而衬托出白色而透明的荚膜。

用单染色也可以看到芽孢，因为单染色时，仅有菌体被染色，而芽孢不被着色，因此可以看到细菌细胞内白色的芽孢形态。

2、细菌荚膜染色时为什么不能加热？答案：由于荚膜属于胶质状、粘液状物质，如果加热可使荚膜失水，导致无法看到荚膜的具体形态。

3、如何用墨汁浸透法观察细菌荚膜？1）、取干净的普通载玻片，并在载玻片的一端滴加蒸馏水，将巨大芽孢杆菌轻沾于水滴中。

2）、加少许墨汁于菌滴中，加盖玻片，轻轻挤压，除去多余的液体。

3）、镜检，可以观察到菌体周围的白色荚膜。

4、荚膜染色时，为什么荚膜不易着色？答案：因为荚膜的主要成分为多糖，而多糖分子表面的电荷多为中性，很难被染料着色。

5、芽孢染色属于哪种类型？其染色过程如何？答案：芽孢染色过程前后共使用两种染料，所以属于复染，其染色过程为：1）、在干净的普通载玻片一端加一滴蒸馏水，无菌操取菌，涂片、干燥。

2）、加孔雀绿染液，加热产生蒸汽，并保持蒸汽4-5min，注意不要使染液蒸干。

3）、倾去染液，冷却后水洗至无绿色出现。

4）、沙黄复染1min，水洗、干燥。

5）、油镜镜检，芽孢呈现浅绿色，而菌体呈红色。

五、酵母菌、霉菌、藻类、原生动物个体形态的观察1、如何区分酵母菌的营养细胞和释放出的子囊孢子？答案：涂片后，滴加孔雀石绿染液染色1min，用95%的乙醇抽提30秒，水洗。

用番红染色30秒，水洗，风干，观察。

营养细胞被染成绿色，子囊孢子被染成红色。

2、区分酵母菌细胞死活的原理？答案：活的酵母菌细胞具有旺盛的代谢活力，可以将美蓝由兰色还原为无色，而死细胞则不能，被染成兰色。

3、叙述霉菌的直接制片观察法在载玻片上加一滴乳酸石碳酸棉蓝溶液，然后用解剖针从霉菌菌落边缘挑取少量产孢菌丝，先放在50%的乙醇中浸泡30秒洗去孢子，再放在载玻片的染液中染色，并用解剖针将菌丝轻轻分开，盖上盖玻片，进行观察。

4、如何区分衣藻、小球藻和硅藻？答案：衣藻细胞前端有红色的眼点，后端有杯状叶绿体，用碘液可以染成蓝紫色；小球藻有杯状叶绿体，用碘液可以染成蓝色；硅藻细胞内有白色的脂肪颗粒，用苏丹III可以染成橙色。

5、如何观察活性污泥中的原生动物？答案：取污泥溶液一滴，加在干净的载玻片中上，盖上盖玻片，吸去多余的液体后进行观察，注意不要产生气泡。

六、微生物大小的测定1、测定微生物大小的原理？答案：显微测微尺可用于测量微生物细胞或孢子的大小，包括镜台测微尺和目镜测微尺两个部件。

镜台测微尺全长1mm，等分为10个大格，每大格又分为10个小格，共100个小格，每小格长度为0.01mm，即10μm，用于校正目镜测微尺每小格的长度。

目镜测微尺中央刻有50等分或100等分的小格，测量前应预先用镜台测微尺来校正并计算出在某一放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的实际长度，再以后作为测量微生物细胞的长度。

2、为什么目镜测微尺必须用镜台测微尺来校正？答案：由于不同显微镜或不同目镜与物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下代表的实际长度也不同。

七、微生物细胞数的记数1、显微镜直接计数法的优缺点是什么？答案：直观、快速、操作简单，但无法区分细胞的死活。

2、如何解决无法区分细胞的死活的问题？答案：可以通过美蓝染色的方法进行区分，活的细菌被染成兰色，但死的不着色。

活的酵母菌细胞具有旺盛的代谢活力，可以将美蓝由兰色还原为无色，而死细胞则不能，被染成兰色。

3、血球计数板的构造？答案：血球计数板是一块特制的载玻片，表面由4条沟槽分成3个条形区，中间的较宽，并且还有中间一条短槽将中间条分成两部分。

每部分中间均有一个方格网。

每个方格网有九个大方格，中间的为计数室。

4、血球计数板的类型答案：两种，其中一种是中间大方格被分成25个中方格，另一种是中间大方格被分成16个中方格。

5、误差来源？答案：如果不染色，则容易将死细胞计算在内，造成过高估计。

八、培养基的配制、消毒、灭菌与空气微生物分离1、培养基配制原则是什么？答案：目的明确；根据微生物的营养需要；注意各种营养物质的浓度配比；要控制具体pH、渗透压、水活度和氧化还原电位；经济。

2、培养基配制应注意什么？答案：称取药品蛋白胨时要迅速，防止吸潮；培养基融化时要不断搅拌以防烧焦；针对不同的培养基要调节适当的pH；培养基灭菌时应按高压蒸汽灭菌锅的操作过程进行，以免危险发生。

灭菌后培养基要及时处理，防止凝固或污染。

3、为什么培养微生物时，平板培养基要倒置？答案：第一培养基倒置可以防止冷凝水落到培养基表面，使菌落分散开；第二可以防止空气对流，污染培养基。

4、为什么高压蒸汽灭菌效果好？答案：因为在湿热情况下，湿热的穿透力强，菌体吸收水分使蛋白质容易凝固，而且当蒸汽与菌体接触后冷凝成水时可以放出热量，进而提高锅内的温度。

5、如何使用高压蒸汽灭菌锅？答案：首先检查灭菌锅内的水是否没过电阻丝，然后放上装有物品的内桶。

注意物品不要过多。

将盖子上的通气管插入内桶壁上的管槽内，盖上盖子，用对角的方式旋紧螺扣，接通电源，开始灭菌。

当压力指针达到0.05KPa时打开放气阀放气，反复放气三次以便排除锅内的冷空气。

放气结束后，使指针升到压力为0.1KPa，并通过人为控制电源的开闭，在0.1KPa 压力下维持20-30min。

灭菌结束后，通过冷却使锅内的压力下降到0.05，打开压力阀放气，待压力为0时，对角旋开螺扣，取出物品即可。

6、分离土壤微生物时，细菌、真菌和放线菌的培养基分别是什么？答案：分离细菌、真菌和放线菌时分别采用牛肉膏--蛋白培养基、马丁氏培养基和改良高氏一号培养基。

九、活性污泥中脱氢酶活性的测定1、脱氢酶活性测定的原理？答案：脱氢酶是一类内源性氧化还原酶；它的作用是催化氢从被氧化的物体（基质AH）中转移到另一个物体（受氢体B）上：）为了定量地测定脱氢酶的活性，常通过指示剂的还原变色速度，来确定脱氢过程的强度。

常用的指示剂有2,3,5－三苯基四氮唑氯化物（TTC）或亚甲蓝，它们在无色的氧化状态接受脱氢酶活化后而被还原成具有稳定的红色；我们即可通过比色的方法，测量反应后颜色深度，来推测脱氢酶的活性。

2、脱氢酶测定的意义？答案：在处理污水过程中，活性污泥脱氨酶活性的降低，直接说明了污水中可利用物质营养浓度的降低。

此外，由于酶是一类蛋白质，对毒物的作用非常敏感，当污水中有毒物存在时，会使酶失活，造成污泥活性下降。

因此，通过测定活性污泥在不同工业废水中脱氢酶活性的变化情况来评价工业废水成分的毒性，评价对不同工业废水的生物可降解性。

3、测定脱氢酶时为什么要避光？答案：因为实验中使用的指示剂2,3,5－三苯基四氮唑氯化物（TTC）对可见光非常敏感，见光易分解，所以在37℃水浴反应时应尽量避光。

4、活性污泥悬浮液制备时，为什么用生理盐水洗涤？答案：因为生理盐水浓度为0.85%，符合微生物细胞的渗透平衡，因而既可去除杂物，又可保证微生物细胞不被破坏。

十、利用发光细菌检测环境有毒污染物1、发光细菌检测环境有毒污染物的原理？答案：发光细菌在正常状态下，体内的荧光素在有氧参与时，经荧光素酶的作用会产生荧光。