高效液相色谱法第一节概述-精选
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第二节 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、分离系 统、检测系统、记录系统 等五大部分组成（图14-2）。
分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子 ，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注 入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组 分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物 收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转 变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。 色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。
②液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱。
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第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的 。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利 于色谱分离条件的选择。
（3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液 相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在 气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。
送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法 引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压 力可达4.9107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料 填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数 可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可 对流
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第一节 概 述
出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、 分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、 高效或现代液相色谱法。
二、液相色谱分离原理及分类
和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定 相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键 合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树 脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动 相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的 吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异 进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶
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第一节 概 述
的70 ~ 80%。
（2）液相色谱能完成难度较高的分离工作
因为：
①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡 过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相 互作用。而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样 品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同 比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选 择性。
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第一节 概 述
气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作 条件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定 差别，主要有以下几方面：
（1）应用范围不同
气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质 。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子 型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到 一定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色 谱分析；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制， 它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物 质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物
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第二节 高效液相色谱仪
色谱柱，就需要高压泵注入流动相。
对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无 脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀 ，密封性好。
高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。
恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和 柱渗透无关。
（4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而 且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际 应用中，这两种色谱技术是互相补充的。
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第一节 概 述
综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分 析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。该法 已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、 医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。
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第一节 概 述
剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力 的大小，决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、 液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻 色谱等类型。
三、液相色谱与气相色谱的比较
液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、 分离度、选择性等与气相色谱一致。液相色谱所用基本理论 ：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。但由于在液 相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体 和
高效液相色谱法 第一节 概 述
高效液体做流动相的新色谱技术。
高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起
来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同
点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率 和实 现了自动化 操作。经典的液相色谱法，流动相在常压下输
恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而 变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流 量。
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第二节 高效液相色谱仪
3. 梯度洗脱装置
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性 的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相 的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离 效果，缩短分析时间的目的。
一、高压输液系统
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第二节 高效液相色谱仪
高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置 和压力表 等组成。
1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑 料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的 流动相。
2.高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部 件之一，其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连 续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程 。由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很 小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地 流过
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高效液相色谱
低压梯度： 只用一个高压泵， 在泵前安装了一个比例阀，混 合就在比例阀中完成。
二、 进样系统
将样品溶液准确送入色谱柱的装置 ——手动方式、自动方式
进样器要求
密封性好、死体积小、重复性好、进样时 引起色谱系统的压力和流量波动要很小。
常用手动进样器——六通阀进样器，
二、 进样系统
六通阀进样
Load
Inject
分析对象及范围 能气化、热稳定性好、 G 且沸点较低的样品，占 C 有机物的20% 流动相的选择 操作条件
流动相为有限的几种 加温常压 “惰性”气体，只起运 操作 载作用，对组分作用小
溶解后能制成溶液的样 H 流动相为液体或各种液 品，高沸点、高分子量、 P 体的混合。它除了起运 室温、高 难气化、离子型的稳定 L 载作用外，还可通过溶 压下进行 或不稳定化合物，占有 C 剂来控制和改进分离。 机物的80%
经典LC HPLC
固定相颗粒>100μm,不均匀 固定相颗粒<10μm,均匀 常压下输送流动相 柱效较低（H↑，n↓） 高压下输送流动相 柱效较高（H↓，n↑）
分析周期长 无法在线检测
分析周期短 可以在线检测
2. HPLC与GC的比较
相同：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼
具分离和分析功能，均可以在线检测
高分子多孔微球：YSG
一、固定相
3. 常用固定相
化学键合固定相
以硅胶为载体，借化学反应方法将有机分子
以共价键连接在硅醇基上
(硅酯化) Si OH R OH Si O R
SOCl 2
(酰氯化) Si OH SOCl2 Si Cl RLi 或RMgCl Si R (硅烷化) Si OH R3 SiCl Si O SiR3 HCl
二、 进样系统
将样品溶液准确送入色谱柱的装置 ——手动方式、自动方式
进样器要求
密封性好、死体积小、重复性好、进样时 引起色谱系统的压力和流量波动要很小。
常用手动进样器——六通阀进样器，
二、 进样系统
六通阀进样
Load
Inject
分析对象及范围 能气化、热稳定性好、 G 且沸点较低的样品，占 C 有机物的20% 流动相的选择 操作条件
流动相为有限的几种 加温常压 “惰性”气体，只起运 操作 载作用，对组分作用小
溶解后能制成溶液的样 H 流动相为液体或各种液 品，高沸点、高分子量、 P 体的混合。它除了起运 室温、高 难气化、离子型的稳定 L 载作用外，还可通过溶 压下进行 或不稳定化合物，占有 C 剂来控制和改进分离。 机物的80%
经典LC HPLC
固定相颗粒>100μm,不均匀 固定相颗粒<10μm,均匀 常压下输送流动相 柱效较低（H↑，n↓） 高压下输送流动相 柱效较高（H↓，n↑）
分析周期长 无法在线检测
分析周期短 可以在线检测
2. HPLC与GC的比较
相同：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼
具分离和分析功能，均可以在线检测
高分子多孔微球：YSG
一、固定相
3. 常用固定相
化学键合固定相
以硅胶为载体，借化学反应方法将有机分子
以共价键连接在硅醇基上
(硅酯化) Si OH R OH Si O R
SOCl 2
(酰氯化) Si OH SOCl2 Si Cl RLi 或RMgCl Si R (硅烷化) Si OH R3 SiCl Si O SiR3 HCl
高效液相色谱法
由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗
第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相
粒很细（5~10m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高 效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
二、流动相
由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力， 并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影 响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选
酸镁、分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸
性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
第四节 液—固色谱法
镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。 碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。
级，存在一些分散的具有表面活性的 吸附中心 。因此，液
固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分 离，故也称为液固吸附色谱。
吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积 和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。组分 与吸附剂的性质相似时，易被吸附，呈现高的保留值；当组 分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，
硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙 烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固 定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相
第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相
两类。 1. 表面多孔型固定相
它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活 性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。 这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅 速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗 时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄， 最大允许量受到限制。 2. 全多孔型固定相
第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相
粒很细（5~10m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高 效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
二、流动相
由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力， 并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影 响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选
酸镁、分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸
性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
第四节 液—固色谱法
镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。 碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。
级，存在一些分散的具有表面活性的 吸附中心 。因此，液
固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分 离，故也称为液固吸附色谱。
吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积 和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。组分 与吸附剂的性质相似时，易被吸附，呈现高的保留值；当组 分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，
硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙 烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固 定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相
第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相
两类。 1. 表面多孔型固定相
它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活 性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。 这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅 速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗 时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄， 最大允许量受到限制。 2. 全多孔型固定相
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
高效液相色谱法基本知识培训-化验员入门培训
改变α是改变后一组分相对于前一组分的保 留时间。α的改变可以选择不同的固定相或
流动相来实现。但改变固定相在液相色谱 中比较麻烦。如在一个色谱系统中,用二根 不同固定的柱子,则又必须考虑到流动相的
适应性。比较行之有效的办法是改变流动 相的极性,如采用连续改变流动相极性的梯
度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择 性。
k’= tR/tM-1= tR’/tM 可见,容量因子就是调整保留时间与死时间的 比值。在液相色谱中，k’只与固定相、流动相性 质及柱温有关,而与流速和柱尺寸无关。
理论塔板数n和塔板高度H
理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相 中动力学特性的重要色谱参数,它是代表色 谱柱分离效能的指标。
计算公式为:
n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 tR为保留时间, W为峰宽， Wh/2为半高峰宽 塔板高度H计算公式为： H=L/n L为色谱柱长度。
分离因子(α)及分离度（R）
1.分离因子(α) α= k2’/k1’=tR2’/tR1’ α代表了二个物质在相同的色谱条件下的分 离选择性。物质的化学性质或结构上的差 异,反映在与固定相和流动相之间作用力也 有所差异上。这就是色谱分离的基础。
中保留程度的参数,并作为色谱定性的指标。 其表示方法有保留时间、保留体积、调整 保留时间和调整保留体积。
保留时间和保留体积
一般认为,当进样量很小 时,样品从柱中流出呈高斯曲 线分布。从进样开始到峰极 大值所需时间时间称为保留 时间,以tR表示。由于流出时 间与流动相流速成反比,因此 又可用保留体积作为保留值 参数,以VR表示。VR=tR・FC 式中, tR为保留时间(min), FC 为流动相流速（ml/min)。
分类
化学键合相的分类可以有不同的依据。按 键合相的表面结构为单分子键合和聚合键 合；按性质分为Si-O-C,Si-O-Si-N,Si-O-S-C； 按键合有机硅烷的功能团分为极性键合相、 非极性键合相和离子性键合相三种。
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
第二十章高效液相色谱(第五版)
（2）L2 = 30cm:
R1 2 L1 ( ) R2 L2
L2 30 R 2 R1 1.33 1.88 L1 15
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紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
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光电二极管阵列检测器
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(二) 荧光检测器 fluorophotometric detector 特点： • 灵敏度高（高于紫外检测器）
• 只适用于能产生荧光或其衍生物能发
荧光的物质。
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(三) 蒸发光散色检测器 evaporative light scattering detector
流动相 （样品）
流动相蒸发除去
加热
组分形成气溶胶
强光
特点： 测定散射光强 • 灵敏度低 I = k mb • 通用型：如糖类、 氨基酸等分析
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(四) 化学发光检测器
组分 + 发光试剂 激发态产物 光辐射
n1/2 -1 k2 R = —— (——) (——) 4 1+k2
：主要受溶剂种类的影响
k ：主要受溶剂配比的影响
29
选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失； （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
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第二节 HPLC的固定相和流动相及其选择
一、化学键合固定相：目前应用最广、性能最佳的固定相；
a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
高效液相色谱法教学【全】精选全文
P307~311
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
高效液相色谱法简介
高效液相色谱仪一般可分为四个主要
部分：高压输液系统，进样系统，分离系
统和检测系统。此外还配有辅助装置：如
梯度淋洗，自动进样、馏分收集及数据处
理等。
1、高压输液系统
1 ） 贮 液 器 ： 1-2L 的 玻 璃 瓶 ， 配 有 溶 剂 过 滤 器 (Ni合金)，其孔很小约2 m，可防止颗粒物进
入泵内。 2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透 过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测）。
高效液相色谱法是以液体作为流动相的色谱
法，它是利用样品中各组分在色谱柱中固定相和流 动相相间分配系数或吸附系数的差异，将各组分分 离后进行定性、定量分析。
发展历史
20世纪初，俄国植物学家茨维特提出经典液相色 谱法。
1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的 局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大 分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经 典液相色谱。
（使用较多）
ห้องสมุดไป่ตู้对流量变化敏感的检测器会有噪声
干扰，此时可连接一脉动阻尼器。
◆恒压泵--------压力恒定，但流量不恒定（现在已经较少使用）。
输液泵操作注意事项：
防止固体微粒进入泵体 流动相不应含有腐蚀性物质 防止溶剂瓶内的流动相被用完 不超过规定的最高压力 流动相一般应该先脱气
4）梯度淋洗装置：
3）高压泵
输液泵应具备如下性能：①流量稳定②流量范 围宽③输出压力高，一般应能达到150～300 kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。
高压泵按排液性质可分为：恒压型和恒流型。
注射型泵------输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。
◆恒流泵
高效液相色谱法基本知识培训-化验员入门培训
某一组分的保留体积就是该组分从柱中流出 所需流动相体积,一般情况下常以ml为单位。细内 径柱和毛细管柱,由于所需流动相流量很小, FC的 单位用μ1/min表示,此时VR可采用为μ1单位。 不保留物质流出时间以tM表示,又称死时间。 而tM・FC即为保留物质死体积,简称死体积(VM)。 死体积不仅与柱结构有关,而且与进样系统、检测 系统的体积有关。只有当柱外体积忽略不计时, tM ・FC才表示柱内流动相所占的体积。以VM表示。 任何色谱过程的基本保留方程式为VR=VM+KVS式 中,K为平衡分配系数, VS为固定相体积,Vm为柱内 流动相所占体积(当柱外体积不容忽略时,Vm表示 柱内空隙及柱外体积之总和)。
无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其他峰、内标 峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外, 待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。
计算公式为：
首先，可以通过增加分离因子（α）值的方法提高分离度，可 通过以下方法实现：（1）改变流动相的组成；（2）改变流 动相的pH值；（3）改变固定相的种类；（4）改变分离温度。 其次，提高理论板数（N）可以提高分离度：（1）柱长增加1 倍，柱效也增加1倍，但相应的分离时间也增加1倍；（2）减 少固定相粒径，可以提高柱效，相应的柱压增高，可进行快 速分离。第三，提高容量因子（k’）方法提高分离度，可通 过以下方法实现：（1）调节流动相极性、pH值、离子强度 等；（2）梯度洗脱。另外，如果k’值过大，会造成分离时间 过长，并且谱带扩散严重，因此，比较适宜的k’值范围为 1≤k’≤10。
极性键合相一般都用作正相色谱,即用非极性或极性 小的溶剂(如烃类溶剂)加入适量的极性溶剂(如三氯 甲烷、醇、乙腈等),以调节控制洗脱液的洗脱强度。 分离组分的出峰顺序与组分的极性大小顺序相同,即 极性弱的先出峰,极性强的后出峰。但对强极性的化 合物,上述极性键合相也可用反相色谱,如在分离糖类 或多肽化合物时,用乙腈-水作洗脱液也可以得到良好 的分离效果。 在极性键合相上的分离机理,有吸附和分配之争。但 一般都认为吸附过程是主要的相互作用过程,通过填 料表面极性基团的偶极诱导,或氢键,或静电作用和溶 质分子发生相互作用,达到混合物的分离目的。
高效液相色谱法
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特点： 特点： 氰基键合相选择性与硅胶类似 键合相选择性与硅胶类似， ① 氰基键合相选择性与硅胶类似， 但极性更小。相同流动相， 但极性更小。相同流动相，组分保留 时间小于硅胶。 时间小于硅胶。 氨基键合相 主要用于糖类分析， ② 氨基键合相 主要用于糖类分析， 糖类分析专用柱 分析专用柱。 是糖类分析敏度： 紫外、荧光、电化学、 紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏 度检测器使用。 度检测器使用。 最小检测量： 最小检测量： 10-9 ~10-11 g 4. 高度自动化： 高度自动化： 采用色谱专家系统为核心的色谱智 能化和仿真优化技术， 能化和仿真优化技术，使 HPLC不仅能 不仅能 自动处理数据，绘图和打印分析结果， 自动处理数据，绘图和打印分析结果， 而且还可以自动控制色谱条件。 而且还可以自动控制色谱条件。
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2. 流动相极性与容量因子的关系 流动相极性大，洗脱能力增加， 流动相极性大，洗脱能力增加， k 减小，tR 减小；反之， k 与 tR 均 减小， 减小；反之， 增加。 增加。 极性小的组分先出柱
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四、正、反相色谱法 正相HPLC（normal phase HPLC） （ 正相 ） 固定相： 固定相：极性 常用：改性硅胶 硅胶、 常用：改性硅胶、氰基柱 流动相: 非极性（或弱极性） 流动相 非极性（或弱极性） 常用： 正己烷 常用： 流动相极性小于固定相极性
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第二节 分离机制 一、液-固吸附色谱法 固吸附色谱法
(Liquid-Solid Chromatography)
（一）吸附机理 根据吸附剂对样品中各组分的吸 根据吸附剂对样品中各组分的吸 附能力差异而分离 而分离。 附能力差异而分离。 吸附过程是被分离组分的分子 与流动相分子争夺吸附剂表面活性 中心(active center)的结果。 的结果。 中心 的结果