高效液相色谱法(HPLC)的概述
高效液相色谱简介及操作
HPLC和经典液相色谱法的比较
3.高效液相色谱法的分类
• 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色 谱法和凝胶色谱法四大类。
4.如何阅读色谱图？？
tR：保留时间；tM：死时间； ：调整保留时间； W：峰宽
• 定性分析：在同一色谱系统中相同物质具 有相同的保留值 • 定量分析：组分含量与其响应值（峰高或 面积）成正比
2 色谱柱使用的注意事项
• 色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。 • 当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存（一般 为甲醇）。 • 每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱。
3 其他注意事项
• 未经提取净化的蛋白样品、血样、生物样品绝对禁 止直接进样分析。 • 要注意流动相的脱气。 • 避免使用高粘度的溶剂作为流动相。 • 使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或缓冲液建 议不超过两天，最好每天更换。
（5）色谱柱平衡后，打开检测器（开灯） （6）测定样品 （7）清洗仪器
色谱柱及流路清洗 进样阀清洗 进样针清洗
四、主要注意事项
1 泵使用的注意事项
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防止任何固体微粒进入泵体（用0.22 um或0.45 um 的微孔滤膜过滤） 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲盐的流 动相不应保留在泵内更不允许留在柱内。 泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运 转一是会使大量空气进入柱内柱床崩塌、也会磨损柱塞、 密封圈，最终产生漏液。 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力。 流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量 的稳定性和分析结果。
c. 荧光检测器 (FLD) 只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基 酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定。
高效液相色谱法
2．高效液相色谱法与气相色谱法的比较
（l）气相色谱法：分析对象仅占有机物总数的20％。 高效液相色谱法：分离和分析占有机物总数近80％的那些 高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质。
（2）气相色谱：流动相与组分不产生相互作用力，仅起运 载作用。 高效液相色谱法：流动相对组分可产生一定亲和力，并参与 固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用， 相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数；
高压输液泵应符合下列要求：密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速 更换溶剂及耐腐蚀。
高压输液泵
常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱 柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差。 目前主要使用恒流泵，又称机械泵，它又分机械注射泵和机械 往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
（四）检测系统
两种基本类型的检测器： 溶质型检测器：它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应， 属于这类检测器的有紫外、荧光、安培检测器等。 总体检测器：它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应， 属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 （l）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）示差折光率检测器 （4）电化学检测器
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography，HPLC
§1
概 述
Introduction
一、高效液相色谱法概述
高效液相色谱法（HPLC）吸取了气相色谱与经典液相色谱优 点，并用现代化手段加以改进。
引入了气相色谱的理论;
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器; 具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点;
含量测定,高效液相色谱法
高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分析方法，可以用于含量测定。
该方法以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
高效液相色谱法具有高分离度、高灵敏度、高选择性等优点，适用于对热不稳定、难挥发、易分解的物质的分离和分析。
在含量测定中，高效液相色谱法可以用于测定药物、食品、环境样品中的成分含量。
需要注意的是，在进行含量测定时，应先进行方法学验证，以确保该方法具有足够的灵敏度、精密度和准确性。
同时，还应根据具体的样品和待测成分的性质选择合适的色谱柱、流动相和检测器等。
总之，高效液相色谱法是一种重要的分析方法，可用于含量测定，但需要经过方法学验证和选择合适的实验条件，以确保结果的准确性和可靠性。
高效液相色谱的简称
高效液相色谱的简称为HPLC，全称为High Performance Liquid Chromatography。
它是一种常用的分离和分析技术，广泛应用于化学、制药、环境科学、食品安全等领域。
HPLC利用液体作为流动相，在固定填充物（如柱填充剂）中进行分离。
样品溶液被注入进HPLC系统，经过柱子后，各组分根据其在填充物上的亲和性差异而被分离。
通过控制流动相的性质和梯度，可以实现对样品中不同组分的分离和定量。
HPLC具有以下特点：
1. 高效：HPLC能够在短时间内完成复杂样品的分离和分析，提高实验效率。
2. 灵敏度高：HPLC可以检测到很低浓度的物质，通常可达到ppm或ppb级别。
3. 选择性强：HPLC可以通过调整流动相的成分和条件来实现对不同化合物的选择性分离。
4. 应用广泛：HPLC可以用于分析各种样品，包括有机物、无机物、生物大分子等。
5. 自动化程度高：现代HPLC系统具有自动进样、自动分离和自动检测等功能，减少了人工操作的影响。
因为HPLC在科学研究和实验室分析中具有重要地位和广泛应用，所以被称为高效液相色谱。
1。
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
高效液相色谱法的简介..
3．操作条件差别
GC：加温操作
HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
二. 高效液相色谱法的特点和应用
“三高” “一快” “一广” 高压 高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）
三.各类高效液相色谱法
液-固吸附色谱 液-液分配色谱
3.1 液-固吸附色谱法
固定相为固体吸附剂,流动相为液体。
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常 使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂
分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心能力的差异，即物质吸附作用的不同来分离的。
适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具 有官能团的化合物和异构体有较高选择性
3.2 液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）；
基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相 ：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即 流动相的极性小于固定液的极性（正相色谱），反之， 流动相的极性大于固定液的极性（反相色谱）。正相 与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失较多，较少采 用；
离子交换色谱
离子色谱
排阻色谱
亲和色谱
高效液相色谱固定相和流动相 （－）固定相
1. 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两 大类：
刚性固体：以二氧化硅为基质，可承受 7.O×108 ～ 1.O×109Pa 的高压，可 制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官 能团，就是键合固定相。 硬胶：主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基 交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。
高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法(HPLC) High Performance LiquidChromatography§3-1 高效液相色谱法概述一、定义以高压输出液体为流动相，以小粒径填料填充色谱柱的色谱分析方法。
高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术.二、HPLC特点1、高压经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。
而现代液相色谱法中，流动相改为高压输送（150～350 ⨯105 Pa，最高输送压力可达450⨯105 Pa）;2、高速由于流动相流速高，分析时间大大缩短，几min、十几min可完成一个分析任务。
3、高效HPLC色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）。
4、高灵敏度利用高灵敏度的检测器，检测灵敏度大大提高。
紫外检测器10-9g荧光检测器10-11g高效液相色谱三、液相色谱分离原理及分类液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合相色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。
四、液相色谱与气相色谱的比较1、相同点（1）基本原理一致：不同组分在两相中的作用力不同。
（2）基本概念一致：基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。
（3）基本理论一致：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。
2、不同点由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的有性质本质不同，因此，两种方法也有不同之处：（1）仪器设备和操作条件不同；（2）应用范围不同；气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。
对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。
高效液相色谱原理
高效液相色谱法（HPLC）一、方法原理1、液相色谱法概述高效液相色谱分析法其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。
HPLC仪器的基本结构2、高效液相色谱法的特点（HPLC）与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。
由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。
特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。
高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。
高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。
如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。
3、高效液相色谱法的固定相和流动相（1）固定相表面多孔型和全多孔型两大类。
（2）流动相（淋洗液）流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。
从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求：①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。
②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。
③与所用的检测器相匹配。
④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度。
⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱效）和适当低的沸点。
⑥应避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证工作人员的安全。
液相色谱法中常用的流动相有正己烷、正庚烷、甲醇、乙腈等。
4、高效液相色谱法的主要类型（1）液—固吸附色谱法①分离原理：基于各组分吸附能力的差异来进行混合物分离的。
②固定相：极性和非极性两种。
极性固定相：硅胶、氧化镁。
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此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC主要容包括：1•高效液相色谱法（HPLC）的概述2.髙效液相色谱基础知识介绍（1——13楼）3.髙压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类4.液相色谱的适用性5.应用高效液相色谱法（HPLC）的概述以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。
由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液一液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18 （0DS）为最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
系统组成：（一）高压输液系统由贮液维、脱气装置、高压辙液泵、过滤券、梯度洗脱装置等组成。
1.贮液罐由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。
贮液謹的放置位置要高于泵体，以保持输液靜压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。
2.流动相流动相常用甲醇-水或乙肠一水为底剂的溶剂系统。
流动相在使用前必须脱气，否则很易在系统的低压部分逸出气泡，气泡的出现不仅影响柱分离效率，还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。
脱气的方法有加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。
3.高压输液泵是髙效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。
对泵的要：耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量围宽、流速恒定，且泵体易于清洗和维修。
高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵（其压力随系统阻力改变而流量不变）。
（二）进样系统常用六通阀进样器进样，进样量由定量环确定。
操作时先将进样器手柄置于釆样位置（L OAD）,此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。
然后转动手柄至进样位置（INJECT）,使定量环接入输液管路，样品由高压流动相带入色谱柱中。
（三）色谱柱由柱管和填充剂组成。
柱管多用不锈钢制成。
柱填充剂有硅胶和化学键合固定相。
在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶（又称ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷键合硅胶（C 8柱)、氨基或飢基键合硅胶等，在中药制剂的定量分析中，主要使用ODS柱。
由于ODS属于非极性固定相，在分离分析时一般使用极性流动相，所以属反相色谱法。
常用流动相有甲醇一水或乙惰一水等，洗脱时极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱。
(四)检测器在高效液相色谱法中主要使用紫外检测器(UYD),可分为固定波长、可变波长和二极管阵列检测器三种类型，以可变波长紫外检测器应用最广泛。
检测器由光源、流通池和记录器组成，其工作原理是进入检测器的组分对特定波长的紫外光能产生选择性吸收，其吸收度与浓度的关系符合光吸收定律。
高效液相色谱基础知识介绍(1——13楼)—、基本概念和术语1.色谱图和峰参数㊉色谱图(chromdtogram) —样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号一时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile).㊉基线(base line) 一流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴。
㊉變音(noise) —一基线信号的波动。
通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
㊉漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。
主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
㊉色谱峰(peak)-组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。
流出曲线上的突起部分。
正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。
不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和脱尾峰(taking peak ).前者少见。
㊉拖尾因子(tailing factor,T) -T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。
也称为对称因子(s ymmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)《中国药典》规定T应为0. 95〜1. 0 5。
T<0. 95为前延峰，T>1.05为拖尾峰。
㊉峰底一一基线上峰的起点至终点的距离。
㊉峰高(Peak height,h) 一一峰的最高点至峰底的距离。
㊉峰宽(peak width,W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。
W=4 o .㊉半峰宽(peak width at half-height,Wh/2) 一峰高一半处的峰宽。
W h/2=2.355o。
㊉标准偏差(standard deviation, o ) --正态分布曲线x=± 1时(拐点)的峰宽之半。
正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。
标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。
小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，0大，峰形胖、柱效低。
㊉峰面积(peak area, A) 一一峰与峰底所包围的面积。
甘X o Xh=2. 507 o h=l. 064Wh/2h[Last edit by madprodigy]2.定性参数(保留值)㊉死时间(dead time, t0) —不保留组分的保留时间。
即流动相(溶剂)通过色谱柱的时间。
在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。
㊉死体积(dead volume.VO) 一一由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。
它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱固定相颗粒间隙(被流动相占据，Vm)、柱出口管路体积、检测器流动池体积。
其中只有Vm参与色谱平衡过程，其他3部粉只起峰扩展作用。
为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。
VO=FXtO (F为流速)㊉保留时间(retention time, tR)—从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
㊉保留体积(retention volume,VR) 一从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。
又称洗脱体积。
VR=F*tR .㊉调整保留时间(adjusted retention time, tR')—扣除死时间后的保留时间。
也称折合保留时间(reduced retention time)。
在实验条件(温度、固定相等)一定时，tR'只决定于组分的性质，因此，tR'(或tR)可用于定性。
TR' =tR-tO㊉调整保留体积(adjusted retention volume, VR* )—扣除死体积后的保留依积。
VR=VR-VO 或 VR=F*tR'3.柱效参数㊉理论塔板数(theoretical plate number,N)用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。
N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。
如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为：N= (tR/o ) 2=16(tR)2/W =5. 54(tR/Wl/2)2W：峰宽；。
：曲线拐点处峰宽的一半，即峰高0. 607处峰宽的一半。
N为常量时，W随tR成正比例变化。
在一多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。
用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。
N与柱长成正比，柱越长，N越大。
用N表示柱效时应注明柱长，，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。
（一般HPLC柱的N在1000以上。
）若用调整保留时间（tR‘）计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数（N有效或Neff）=16（tR, /W）2㊉理论塔板高度（theortical plate height,H）每单位柱长的方差。
H=。
实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算：H=L/N4.相平衡参数（distribution coefficient,K） --在一定温度下,化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。
K=[xs]/[xm]Cs-溶质在固定相中的浓度Cm—溶剂在流动相中的浓度分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。
在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数（或称交换系数），凝胶色谱法为滲透参数。
但一般情况可用分配系数来表示。
在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs、Cm很小）时，K 只取决于组分的性质，而与浓度无关。
这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减少，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随看溶质浓度的增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。
因此，只有尽可能较少进样量，使组份在柱浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。
在同一色谱条件下，样品中K值大的组份在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组份则滞留时间短，先流出色谱柱。
混合物中各组份的分配系数相差越大，越容易分离，因此，混合物中各组份的分配系数不同是色谱分离的前提。
在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。
实践中主要靠调整流动相的组成配比及PH值，以荻得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。
㊉容量因子（capacity factor.K）--化合物在两相间达到平衡时，在固定相与流动相中的量之比。
K= （tR-tO） /tO=tR f /t0 （或溶质在固定相中的量/溶质在流动相中的量）。
因此, 容量因子也称质疑分配系数。
{K=Cs/Cm=K, Vm/Vs k= （tR-tO）/tO=K*Vs/Vm Vs：色谱柱中固定相的体积;Vm：色谱柱中流动相的体积。