实验二 粗蛋白的测定
粗蛋白的检测
实验步骤⑴消化称取经粉碎通过（40－60）目式样（0.5－1）g(视含氮量而定)无损地置入已洗涤烘干的试管中加催化剂一片和10ml硫酸。
将消化管分别放入消化架各个孔内，然后置于消化炉上，然后开启抽吸泵水阀，使抽吸泵处于抽吸状态。
接通电源，在加热初始阶段，须注意观察，防止式样因急沸而飞溅。
（电压调至180V－200V温度不宜太高）。
消化反应过程主要如下：(蛋白质)R·C·H·NH2·COOH+H2SO4→CO2+SO2+NH3+H2O2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4⑵蒸馏分别用橡皮管与各进出水连接，出水口，排水口用橡胶管连接后置入水池中。
冷却水接口与自来水龙头连接，H2O、NaOH输入接口与橡胶管连接后分别置入蒸馏水、氢氧化钠盛器桶内，并关闭开关阀门。
打开电源开关，H2O开关，蒸馏水即自动进入发生炉内，达到一定液位高度，受液位控制器控制停止进水，进入电加热状态。
在250ml锥形瓶中加入2％的硼酸，50ml和（2－3）滴混合指示剂1，将该瓶套在接收管上，并让管口浸没在硼酸溶液液面以下。
取消化冷却后的消化试管置入适量的H2O后，扳动蒸馏消化管托盘架，使消化管固定在蒸馏器托盘架上，开启NaOH开关，注入50ml氢氧化钠溶液。
蒸馏器内冷却水经稳压器流入蒸汽发生炉内，炉内因水位上升使电极圈产生电流，炉内蒸馏水经（1－2）min加热后，水被煮沸产生的蒸汽进入消化管内，对以消煮的样品进行蒸馏，将消化过程中产生的硫酸铵转化成氨并与接收瓶里的硼酸溶液反应生成硼酸氢铵，待接收瓶液面高于150ml时，将接收瓶下移，使接收管离开液面，用蒸馏水冲洗出气口，取下接收瓶待滴定。
蒸馏过程的主要反应如下：（NH4）2SO4+2NaOH→Na2SO4+2NH4OH2NH4OH→2NH3+2H2ONH3+4H3BO3→NH4HB4O7+5H2O⑶滴定用0.1mol/l的标准盐酸溶液滴定吸收，溶液有蓝绿色变成紫红色为滴定终点。
(完整版)实验二粗蛋白的测定
实验二饲料粗蛋白的测定一、实验目的通过饲料样品中粗蛋白质的测定，让学生了解了解凯氏定氮法测定的基本原理，掌握半微量凯氏定氮法测定饲料粗蛋白质的方法，掌握粗蛋白质含量的计算方法。
二、实验原理各种饲料的有机物质在还原性催化剂(如CuSO4，K2SO4或Na2SO4或Se粉)的帮助下，用浓硫酸进行消化作用，使蛋白质和其它有机态氮（在一定处理下也包括硝酸态氨）都转变成NH4+并与H2SO4化合成（NH4）2SO4，而非含氮物质，则以CO2 ↑，H2O↑，SO2↑状态逸出。
消化液在浓碱的作用下进行蒸馏，释放出的铵态氮，用硼酸溶液吸收之并与之结合成为四硼酸铵，然后以甲基红溴甲酚绿作指示剂，用HCl标准溶液（0.1mol/L）滴定，求出氮的含量，根据不同的饲料再乘以一定的系数（通常用6.25系数计算），即为粗蛋白质的含量。
其主要化学反应如下：1、2NH4（CH2）2COOH+13H2SO4→（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2（丙氨酸）2、（NH4）2SO4 +2NaOH→2NH 3+3H2O+2Na2SO43、4H3BO3+ NH 3→NH4HB4O7+5H2O4、NH4HB4O7+HCl+5H2O→NH4C1+4H3BO3本法不能区别蛋白氮和非蛋白氮，只能部分回收硝酸盐和亚硝酸盐等含氮化合物。
在测定结果中除蛋白质外，还有氨基酸、酰胺，铵盐和部分硝酸盐、亚硝酸盐等，故以粗蛋白质表示之。
三、实验设备1、实验室用样品粉碎机或研钵；2、分析筛：孔径0.45mm(40目)；3、分析天平：感量0.0001g；4、消煮炉或电炉；5、滴定管：酸式，25或50ml；6、凯式烧瓶：100或500m1；7、凯氏蔗馏装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式；8、锥形瓶，150或250m1；9、容量瓶：100ml。
三、实验内容1、称取0.5～1g 试样（含氮量5～80mg ）准确至0.0002g ，无损失地放入凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.9g ，无水硫酸钾（或硫酸钠）15g ，与试样混合均匀，再加硫酸25ml 和2粒玻璃珠，在消煮炉士小心加热，待样品焦化，泡沫消失，再加强火力（360～410℃）直至溶液澄清后，再加热消化15min 。
粗蛋白测定方法
粗蛋白测定方法一凯式定氮法粗蛋白crude protein ；crude matter (DM)食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。
不仅包括蛋白质这一物质，它涵盖的范围更广，包括含氮的全部物质，及真蛋白质和含氮物(氮化物)。
换句话说，粗蛋白是食品、饲料中含氮化合物的总称，食物中以大豆的粗蛋白含量最高，肉类次之。
所以说，粗蛋白是一种既包括真蛋白又包括非蛋白的含氮化合物，后者又可能包括游离氨基酸、尿素、硝酸盐和氨等。
然而，不同蛋白质的氨基酸组成不同，其氮含量不同，总氮量换算成蛋白质的系数也不同。
总之，粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。
我们可以通过粗蛋白测定仪即凯氏定氮仪来测量粗蛋白的含量，测量步骤如：蛋白质含氮量约为16% (这已通过多次试验得出)，再用凯氏法测出总氮量，再乘以就可求得粗蛋白的含量。
一、实验原理蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。
这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系，其中含碳50〜55%、氢6〜8%、氧20〜23%、氮15〜17% 和硫〜％。
此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。
由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15〜17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于克蛋白质。
所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以，就可以计算出样品中的蛋白质含量。
含氮有机物与浓硫酸共热，被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。
由大分子分解成小分子的过程通常称为”肖化”为了加速消化，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点(290C-400C )，加入硫酸铜作为催化剂，过氧化氢作为氧化剂，以促进反应的进行。
反应(1)(2)在凯氏烧瓶内完成，反应(3) 在凯氏蒸馏装置中进行，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。
由于蒸汽发生器体积小，节省能源，本仪器使用方便，效果良好。
粗蛋白的测定方法原理及操作探讨
(8) 硫酸铵：分析纯，干燥；
(9) 硼酸吸收液。
3 仪器
• 实验用样品粉碎机或研钵；
• 40目（0.45 mm）分析筛；
• 分析天平； • 消化装置；
• 酸式滴定管；
• 凯氏定氮蒸馏装置。
4 操作步骤:
①磨样 ④消化 ②称样 ⑤蒸馏 ③加入催化剂和浓硫酸 ⑥滴定
4.1 磨样
确保样品均匀，颗粒细度（<1 mm）。
首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳 化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫 酸铵，这一过程称为有机物的消化。
消化：蛋白质 + H2SO4 →（NH4）2SO4+ SO2↑+ CO2↑+ H2O
•
1、消化 样品中的有机物和含N有机化合物，经浓H2SO4加热消化，H2SO4使有机物脱 水，炭化为碳；碳将H2SO4还原为SO2，而本身则变为CO2；SO2使N还原为NH3， 而本身则氧化为SO3，而消化过程中所生成的新生态氢，又加速了氨的形成。在 反应中生成物CO2、H2O和SO2、SO3逸去，而NH3与H2SO4结合生成（NH4） 2SO4留在消化液中。 蛋白质+H2SO4 ——→ C C+H2SO4 ——→ SO2+CO2↑ SO2+[N] ——→ NH3+SO3↑ NH3+H2SO4 ——→（NH4）2SO4 2CH3－CH－COOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2↑+12SO2↑+16H2O↑ ∣ NH2 浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水并炭化为碳、氢、氮。浓硫酸又有氧化性， 使炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫： 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成 硫酸铵留在酸性溶液：NH3+H2SO4——→（NH4）2SO4
粗蛋白的测定原理
粗蛋白的测定原理
粗蛋白的测定原理是基于蛋白质与某种试剂发生特定的化学反应而产生可测定的信号。
一种常用的测定方法是利用布拉德福法。
该方法利用染料结合蛋白质产生颜色变化的特性，通过比色反应来测定粗蛋白的含量。
具体操作步骤如下：
1. 准备一系列标准溶液，其中含有已知浓度的蛋白质。
2. 取一定体积的待测样品，加入定量的试剂。
常用的试剂是科氏试剂，它与蛋白质能够在一定条件下形成稳定的配合物。
3. 将混合溶液在适当的条件下孵育一段时间，使蛋白质与试剂充分反应。
孵育过程中，蛋白质与试剂发生结合并形成沉淀。
4. 用离心或者过滤的方法将溶液与沉淀分离，并采集沉淀物。
5. 加入某种试剂，使沉淀溶解或产生颜色变化。
这些试剂可以与蛋白质产生特定的反应，例如与杜仲酚蓝形成蓝色的复合物。
6. 通过分光光度计或者其他测定仪器，测定复合物的光吸收值。
7. 将待测样品的吸光值与已知标准溶液的吸光值进行比较，以确定蛋白质的浓度。
通过以上步骤，可以利用布拉德福法测定粗蛋白的含量。
需要注意的是，不同的试剂和条件可能对蛋白质的提取和测定结果产生影响，因此在进行测定时需要严格控制实验条件。
此外，布拉德福法对于某些特殊蛋白质的测定可能不够准确，需要配合其他方法进行确认。
粗蛋白的测定
成品料及原料中粗蛋白质的测定原料与成品中蛋白质的测定是饲料化验中特别重要的一项，目前国家标准中用于检测饲料中蛋白质的方法共有三种：1、凯氏定氮法；2、乙酰丙酮分光光度法；3、燃烧法。
其中凯氏定氮法在饲料的蛋白质的测定中应用最广泛。
下面主要介绍凯氏定氮法。
凯氏定氮方法简介：凯氏定氮法是1883年Kjeldahl发明，当时凯氏只使用H2SO4来分解试样，来定量谷物中的蛋白质，后来由Gunning加入改进，在消化时加入K2SO4使沸点上升，加快分解速度，凯氏定氮法至今仍在使用。
凯氏定氮法所测得的含氮量为物质的总氮量，其中还包括少量的非蛋白氮，如尿素氮、游离氨氮、生物碱氮、无机盐氮等，因此由凯氏定氮法测得的蛋白质称为粗蛋白质。
原理：原料或成品与催化剂和硫酸一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以0.1mol/L盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。
其反应方程式如下：蛋白质+ H2SO4 →（NH4）2SO4（NH4）2SO4+NaOH=NH4OH+Na2SO4NH4OH →H2O + NH3 →NH4OHNH3+(标准) HCL→NH4CL试剂和材料：蒸馏水，硫酸铜，硫酸钾，硫酸，硼酸，甲基红指示剂（C15H15N3O2），溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5S），氢氧化钠，95%乙醇（C2H5OH），硼酸溶液，40%氢氧化钠溶液，盐酸标准滴定溶液（0.1mol/L），消化炉，凯氏定氮仪。
步骤：1、消化，2、蒸馏，3、滴定，4、计算。
1．消化过程：称取充分混匀的固体试样0.2g精确至0.001 g，移入干燥的消化管中，加入3.2 g 催化剂及7mL 浓硫酸，放在消化炉上打开开关，整个消化过程需要2.5h。
在此过程中混合指示剂是硫酸钾与硫酸铜以15:1的质量比混合的，其中硫酸钾的作用是可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330℃，而添加硫酸钾后，温度可达400℃，加速了整个反应过程；硫酸铜的作用是在蒸馏过程中与氢氧化钠反应指示其加入量；硫酸起到强氧化剂的作用，与蛋白质反应生成硫酸铵，与蛋白质中的有机物反应生成CO2，SO2，H2O。
粗蛋白测定
1.2.4 粗蛋白含量的测定—凯氏定氮法(1)原理样品在加速剂的参与下，用浓硫酸消煮时，各种含氮有机化合物，经过复杂的高温分解反应，转化为铵态氮。
碱化后蒸馏出来的氨用硼酸吸收，以酸标准溶液滴定，结果乘以蛋白质换算系数6.25，即为粗蛋白质含量。
(2)仪器设备研钵、分析天平(感量为0.0001g)、消煮炉、半自动定氮蒸馏装置、酸式滴定管、锥形瓶(容积150ml）、量筒(量程10mL）、移液管(10mL）(3)试剂配制10mol·L-1NaOH溶液：NaOH420g+1L H2O；甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：0.5g溴甲酚绿和0.1g甲基红溶于100mL乙醇中；20g·L-1 H2BO3指示剂：20g H2BO3(化学纯）溶于1L水中；混合加速剂：K2SO4:CuSO4:Se=100:10:1即100g K2SO4(化学纯）、10g CuSO4 ·5H2O(化学纯）、和1gSe粉混合研磨，充分混匀(注意戴口罩），贮于具塞瓶中；0.01mol·L-1(1/2 H2SO4）标准液：量取H2SO4(化学纯、无氮、ρ=1.84g·mL-1）0.3mL，加水稀释至1000mL。
(4)操作步骤样品消煮：将样品0.4g置于干燥的消煮管底部，加3g混合加速剂和浓硫酸10mL，消煮30分钟左右。
同时，做一份空白测定，除不加样品外，其他操作皆与测定样品相同。
蒸馏：消煮管内10 mol·L-1NaOH溶液10mL于半自动定氮仪上蒸馏。
用装有30mL 20g·L-1 H2BO3－指示剂的锥形瓶收集蒸馏液，自溶液变为蓝色计时4min 后停止蒸馏。
滴定：用0.01 mol·L-1(1/2 H2SO4）标准液滴定馏出液，馏出液由蓝色至刚变为红色，记录所用酸标准溶液的体积(mL）。
计算：式中:X-样品中粗蛋白质的含量，%V1-样品消耗盐酸标准溶液的体积，mLV2-试剂空白消耗盐酸标准溶液的体积，mLN-盐酸标准溶液的当量浓度0.014-1N盐酸标准溶液Im L相当于氮的克数m-样品的质量(或体积)，g(或mL)F-蛋白质换算系数，6.25。
粗蛋白测定方法
粗蛋白测定方法—凯式定氮法粗蛋白crude protein；crude matter（DM）食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。
不仅包括蛋白质这一物质，它涵盖的范围更广，包括含氮的全部物质，及真蛋白质和含氮物（氮化物）。
换句话说，粗蛋白是食品、饲料中含氮化合物的总称，食物中以大豆的粗蛋白含量最高，肉类次之。
所以说，粗蛋白是一种既包括真蛋白又包括非蛋白的含氮化合物，后者又可能包括游离氨基酸、尿素、硝酸盐和氨等。
然而，不同蛋白质的氨基酸组成不同，其氮含量不同，总氮量换算成蛋白质的系数也不同。
总之，粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。
我们可以通过粗蛋白测定仪即凯氏定氮仪来测量粗蛋白的含量，测量步骤如：蛋白质含氮量约为16%（这已通过多次试验得出），再用凯氏法测出总氮量，再乘以6.25就可求得粗蛋白的含量。
一、实验原理蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。
这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系，其中含碳50～55%、氢6～8%、氧20～23%、氮15～17%和硫0.3～2.5%。
此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。
由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15～17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于6.25克蛋白质。
所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以6.25，就可以计算出样品中的蛋白质含量。
含氮有机物与浓硫酸共热，被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。
由大分子分解成小分子的过程通常称为”消化”。
为了加速消化，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点(290℃→400℃)，加入硫酸铜作为催化剂，过氧化氢作为氧化剂，以促进反应的进行。
反应(1)(2)在凯氏烧瓶内完成，反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。
由于蒸汽发生器体积小，节省能源，本仪器使用方便，效果良好。
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实验二饲料粗蛋白的测定
一、实验目的
通过饲料样品中粗蛋白质的测定，让学生了解了解凯氏定氮法测定的基本原理，掌握半微量凯氏定氮法测定饲料粗蛋白质的方法，掌握粗蛋白质含量的计算方法。
二、实验原理
各种饲料的有机物质在还原性催化剂(如CuSO4，K2SO4或Na2SO4或Se粉)的帮助下，用浓硫酸进行消化作用，使蛋白质和其它有机态氮（在一定处理下也包括硝酸态氨）都转变成NH4+并与H2SO4化合成（NH4）2SO4，而非含氮物质，则以CO2 ↑，H2O↑，SO2↑状态逸出。
消化液在浓碱的作用下进行蒸馏，释放出的铵态氮，用硼酸溶液吸收之并与之结合成为四硼酸铵，然后以甲基红溴甲酚绿作指示剂，用HCl标准溶液（0.1mol/L）滴定，求出氮的含量，根据不同的饲料再乘以一定的系数（通常用6.25系数计算），即为粗蛋白质的含量。
其主要化学反应如下：
1、2NH4（CH2）2COOH+13H2SO4→（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2（丙氨酸）
2、（NH4）2SO4 +2NaOH→2NH 3+3H2O+2Na2SO4
3、4H3BO3+ NH 3→NH4HB4O7+5H2O
4、NH4HB4O7+HCl+5H2O→NH4C1+4H3BO3
本法不能区别蛋白氮和非蛋白氮，只能部分回收硝酸盐和亚硝酸盐等含氮化合物。
在测定结果中除蛋白质外，还有氨基酸、酰胺，铵盐和部分硝酸盐、亚硝酸盐等，故以粗蛋白质表示之。
三、实验设备
1、实验室用样品粉碎机或研钵；
2、分析筛：孔径0.45mm(40目)；
3、分析天平：感量0.0001g；
4、消煮炉或电炉；
5、滴定管：酸式，25或50ml；
6、凯式烧瓶：100或500m1；
7、凯氏蔗馏装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式；
8、锥形瓶，150或250m1；
9、容量瓶：100ml。
三、实验内容
1、称取0.5～1g 试样（含氮量5～80mg ）准确至0.0002g ，无损失地放入凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.9g ，无水硫酸钾（或硫酸钠）15g ，与试样混合均匀，再加硫酸25ml 和2粒玻璃珠，在消煮炉士小心加热，待样品焦化，泡沫消失，再加强火力（360～410℃）直至溶液澄清后，再加热消化15min 。
2、氨的蒸馏
（1）常量直接茂馏法 将上述的试样消煮液冷却，加蒸馏水200ml ，摇匀，冷却。
沿瓶壁小心加入40％氢氧化钠溶液100ml ，立即与蒸馏装置相连．蒸馏装置冷凝管的末端应浸入50ml 硼酸吸收液lcm 。
加混合指示剂2滴，轻摇凯氏烧瓶，使溶液混匀，加热蒸馏，直至馏出液体积约150ml 。
先将吸收液取下，再停止加热。
（2）半微量水蒸汽蒸馏法 上述试样的消煮液冷却，加蒸馏水20m1转入100ml 容量瓶，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。
取2％硼酸溶液20ml ，加混合指示剂2滴，使半微量蕉馏装置的冷凝管末端浸入此溶液；蒸馏装置的蒸汽发生器的水中应加甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，且保持此液为橙红色，否则应补加少许硫酸。
准确移取试样分解液10～20ml 注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10ml40％氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，并在入口处加水封密好，防止漏气，蒸馏4min ，使冷凝管末端离开吸收液面，用蒸馏水洗冷凝管末端，洗液均流入吸收液。
3、滴定 用硼酸吸收氨后，立即用0.05mol/L 的HCI 标准溶液滴定，仍以甲基红或混合甲基红为指示剂。
在测定饲料样本中含氮量的同时，应做一空白对照测定，即各种试剂的用量及操作步骤完全相同，但不加样本，这样可以校正因药品不纯所发生的误差，吸收氨后的吸收液立即用0.05mol/L 盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。
4、空白测定 称取蔗糖0.0lg ，以代替试样，按上述测定步骤进行空白测定，消耗0.05mol/L 盐酸标准溶液的体积应不得超过0.3ml 。
5、计算
每m1的lmol/L 盐酸标准溶液相当于0.0140g 的N 。
因此，
10025.60140.0)((%)25.6%'12⨯⨯⨯⨯⨯-==⨯v
v m c v v N 粗蛋白质 式中：v 2—试样滴定时所需酸标准溶液的体积（m1）；
v 1—空白滴定时所需酸标准溶液的体积(m1)；
c —盐酸标准溶液的浓度(mol/L)；
m 一试样的质量（g ）；
v —试样的分解液总体积（ml ）；
v ’—试样分解液蒸馏用体积（m1）；
0.0140—每ml HCl 标准溶液相当于N 的克数； 6.25一氮换算成蛋白质的平均系数。
每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。
当粗蛋质含量在25％以。
上，允许相对偏差为1％；当粗蛋白质含量在l0％～25％时，允许相对偏差为2％；当粗蛋白质含量在10％以下时，允许相对偏差为3％。
测定步骤的检验精确称取0.2g硫酸铵，代替试样，按测定步骤文字中的各步骤操作，并按公式计算（但不乘系数6.25），测得硫酸铵含氮量为21.19±0.2％，否则应检查加碱，蒸馏和滴定各步骤是否正确。
试样消煮时，加入硫酸铜0.2g，无水硫酸钠2g，与试样混合均匀，再加硫酸10ml，仍可使饲料试样分解完全,只是试样焦化再变为澄清所需时间要略长些。