真菌的组织病理学特殊染色
特殊染色和组织化学
⒉粘蛋白
在同一种上皮和腺体内常可同时分泌2种 粘液物质，而在同部位的分泌物中两者 的比例和含量都有所不同。
⒉粘蛋白
粘液物质一般具有下列性质： ①对异染性染料具有异染性； ②对碱性染料具有很强的亲和力； ③除胃粘蛋白外，其他粘液遇醋酸时 都会发生沉淀； ④可溶于弱碱性溶液。
2．在心肌病变及其他心血管疾病的研究 用显示糖原的特殊染色，可以观察到由缺 血缺氧所致急性早期心肌坏死病灶内的糖 原明显减少甚至消失，呈均质的浓染状态， 而病灶周围则出现反应性异常糖原增多； 已愈合的心肌梗死灶周围的心肌纤维内可 有糖原颗粒浸润；心肌的横纹肌瘤也有大 量糖原存在。
3．糖原累积病的诊断及研究 用显示糖原的 特染方法可观察到由先天性遗传缺陷引起的 糖原累积病时，心、肝、肾、骨骼肌、单核 吞噬系统等器官内均有大量的糖原堆积。
1、有学者认为从物理学角度看，染色剂和组织 细胞的结合是“溶解”或“吸收”。例如苏丹类染 色剂使脂质着色，就是利用染色剂在脂质中的溶解 度大于在酒精等溶剂中的溶解度这一特性。有些染 色剂是染色剂分子通过渗透和毛细血管作用而被吸 收或沉淀到组织、细胞的小孔中去而着色的‘这种 机制的染色是很少的。
2、另有学者认为染色是染色剂与组织、细胞之间 的化学性结合。如显示含铁血黄素的普鲁士反 应是最典型的例子。
5)蒸馏水洗涤数次。
6)用Schiff试剂浸染5一 10min，如温度低时 可延长浸染时间。
7)倾去Schiff试剂，直 接流水冲洗10min。
8)用明砚苏木素染液浅 染胞核2—3min，过 染时可用o5％盐酸乙 醇液稍分化。
9)流水冲洗5一l0min。
10)乙醇脱水，二甲苯运 明，中性树胶封固。
注意事项
2、类化学方法 有少数方法的染色反应有特 殊性，但机制不明。
病理学技术—特殊染色最最全总结
结缔组织染色法Mallory三色染色法蓝色：胶原和网状纤维淡蓝色：软骨、粘液、淀粉样变物质红色：神经胶原纤维、肌纤维、酸性颗粒橘红色：髓鞘、红细胞图表 A 染色，显示胶原纤维，A组排列规则. Masson三色染色法绿色：胶原纤维红色：肌纤维橘红色：红细胞图表 B Mssson三色法图表 C 三色染色胃癌组织中血管平滑肌. 显示胶原、网状和弹性纤维的三联染色法红色：胶原纤维黑色：网状纤维绿色：弹性纤维淡黄色：肌肉、红细胞二、胶原纤维染色法. Van Gieson（）苦味酸-酸性品红法鲜红色：胶原纤维黄色：肌纤维、细胞质、红细胞蓝褐色：胞核图表 E 2.胶原纤维，Van Gieson.)苦味酸-酸性品红法图心肌梗塞 myocardial infarction：心肌梗塞后2个月，van Gieson 染色, 坏死心肌被染成红色的纤维组织所代替，黄色区域为残留的心肌纤维。
天狼星红（Sirius red）苦味酸染色法(参照上图)黄色：其他三、网状纤维染色Gordon-Sweets银氨染色法（梅花开枝图，金色阳光伴树枝）黄棕色：胶原纤维淡红色：细胞质（红液复染）图表 F 3.Gordon-Sweets氢氧化银氨液浸染法Gomori氏银氨液配制法图表 G Gomori氏银氨液配制法四、弹性纤维染色Gomori醛复红染色法*甲醛生理盐水液固定的染色效果最佳图表 H 醛复红染色法五、显示弹性、胶原纤维的双重组合染色法蓝绿色：弹性纤维红色：胶原纤维黄色：背景六、肌肉组织染色△横纹肌组织染色Mallory磷钨酸苏木精染色法（PTAH）蓝色：胞核、纤维、肌肉、神经胶质纤维、纤维蛋白、横纹肌黄色或枚红色：胶原纤维、网状纤维软骨基质、骨微紫色：粗弹性纤维（有时）紫蓝色或棕黄色：缺血缺氧早期病变的心肌图表 J .磷钨酸苏木素法图表 K .磷钨酸苏木素染色液△早期心肌病变组织染色染色法（1974年）蓝色：细胞核图各组小鼠心肌组织Nagar-Olsen染色（光学显微镜, ×200）显示缺氧心肌染色法（1964年）红色：缺氧心肌紫色：胞核绿色：其他组织七、糖类染色过碘酸-Schiff（PAS）染色法红色：糖原及其他PAS反应阳性物质蓝色：细胞核图表 L 7.胃贲门腺体胞浆呈PAS阳性八、黏液物质（黏多糖）染色阿尔辛蓝过碘酸雪夫（ABPAS）染色法（1956）红色：中性黏液物质蓝色：酸性黏液物质紫红色：混合性黏液物质图表 M 染色结肠粘膜图表 N .胃粘膜组织 AB-PAS染色 40×：2.爱先蓝（）法蓝色：唾液酸、弱硫酸化黏液物质、一般粘液红色：胞核不着色：强硫酸化黏液物质图表 O .爱先蓝（）染色液图表 P .爱先蓝法图表 Q .爱先蓝法—3、爱先蓝（）法蓝色：含硫酸黏液物质不着色：非硫酸化酸性黏液物质红色：复染后的胞核九、黑色素染色黑色素银浸染色法黑色：黑色素及嗜银细胞颗粒红色：胶原纤维浅黄色：背景图表 R pigment in cells . malignant melanoma, Fontana-Masson stain.亚铁染色法暗绿色：黑色素浅绿或不着色：背景黄色：肌纤维和背景十、含铁血黄素染色Perls blue（普鲁士蓝）反应显示三价铁蓝色：含铁血黄素浅红色：其他组织图表 S 10.普鲁士蓝染色肝脏普鲁士蓝染色呈蓝色的含铁血黄素颗粒大量沉着在肝实质细十一、胆色素染色三氯醋酸染色法绿色：胆色素红色和黄色：其他十四、纤维蛋白染色等MSB染色法*本法的MSB指马休黄猩红蓝法红色：纤维蛋白紫色：陈旧性纤维蛋白蓝色：细胞核黄色：红细胞图表 T 马休黄-酸性品红-苯胺蓝染色液甲紫染色法蓝黑色：纤维蛋白红色：背景十五、淀粉样物质染色1.刚果红染色法红色：淀粉样物质蓝色：细胞核图表 U 15.淀粉染色甲状腺髓样癌淀粉样物质甲紫染色法红色或紫红色：淀粉样物质蓝色：细胞核十六、真菌染色六胺银染色法*真菌均被着色图表 V 16.六胺银染色液2.高碘酸复红染色法（1994年）紫红色：真菌浅黄色：红细胞十七、细菌染色碱性复红结晶紫染色法蓝色：革兰阳性菌红色：革兰阴性菌、细胞核抗酸杆菌染色法红色：抗酸杆菌灰蓝色：背景图表 W . 病理抗酸染色液图表 X . 病理抗酸染色液3.胃幽门螺杆菌Warthin-Starry胃幽门螺杆菌染色法棕黑色或黑色：胃幽门螺杆菌淡黄色：背景十八、螺旋体染色1. 硝酸银染色法染色法蓝—淡紫色：螺旋体、细菌蓝色：细胞质橘黄色：红细胞Ryu碳酸钠碱性复红法红色：螺旋体十九、病毒包涵体染色Macchiavello包涵体染色法图表 Y 19.巨细胞病毒核内出现周围绕有一轮“晕”的大型嗜酸性包涵体。
真菌检测步骤
真菌检查步骤1.采集标本浅部真菌的标本有毛发、皮屑、甲屑、痂等，标本在分离前常先用75%的乙醇消毒。
深部真菌的标本可根据情况取痰、尿液、粪便、脓液、口腔或阴道分泌物、血液、脑脊液、各种穿刺液和活检组织，采集标本时应注意无菌操作。
2.检查方法真菌检查的方法主要有：（1）直接涂片：为最简单而重要的诊断方法。
取标本置玻片上，加一滴10%KOH溶液，盖上盖玻片，在酒精灯火焰上稍加热，待标本溶解，轻轻加压盖玻片使标本透明即可镜检。
可用于检查有无菌丝或孢子，但不能确定菌种。
（2）墨汁涂片：用于检查隐球菌及其他有荚膜的孢子。
医学教育|网搜集整理方法是取一小滴墨汁与标本（如脑脊液）混合，盖上盖玻片后直接镜检。
（3）涂片或组织切片染色：涂片染色可更好地显示真菌形态和结构。
革兰染色适用于白念珠菌、孢子丝菌等；瑞氏染色适用于组织胞浆菌；组织切片通常用PAS染色，多数真菌可被染成红色。
（4）培养检查：可提高真菌检出率，并能确定菌种。
标本接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基上，置室温或37℃培养1～3周，必要时可行玻片小培养协助鉴定。
菌种鉴定常根据菌落的形态及显微镜下形态判断，对某些真菌，有时尚需配合其他鉴别培养基、生化反应、分子生物学方法确定。
四、真菌学检验的基本技术（一）直接镜检是最简单也是最有用的实验室诊断方法，常用的方法有：①氢氧化钾/复方氢氧化钾法：标本置于载玻片上，加一滴浮载液，盖上盖玻片，放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过2～3次，不应使其沸腾，以免结晶，然后轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用棉拭或吸水纸吸去周围溢液，置于显微镜下检查。
检查时应遮去强光，先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等。
浮载液：A.10%~20%的KOH。
配方：氢氧化钾10～20g，蒸馏水加至100ml，待氢氧化钾完全溶解后揺匀存放在塑料瓶内，适用于皮屑、甲屑、毛发、痂皮、痰、粪便、组织、耵聍等的检查。
病理学技术—特殊染色最最全总结(均配图)
病理学技术—特殊染色最最全总结(均配图)结缔组织染色法1.1 Mallory三色染色法Mallory三色染色法可用于胶原和网状纤维的染色，其中蓝色代表胶原和网状纤维，淡蓝色代表软骨、粘液和淀粉样变物质，红色代表神经胶原纤维、肌纤维和酸性颗粒，橘红色代表髓鞘和红细胞。
图表A1.1展示了Mallory三色染色法的效果，其中A组排列规则。
1.2 Masson三色染色法Masson三色染色法可用于胶原纤维和肌纤维的染色，其中绿色代表胶原纤维，红色代表肌纤维，橘红色代表红细胞。
图表B1.2和C1.2展示了Masson三色染色法在胃癌组织和血管平滑肌中的应用。
1.3 显示胶原、网状和弹性纤维的三联染色法三联染色法可用于显示胶原、网状和弹性纤维，其中红色代表胶原纤维，黑色代表网状纤维，绿色代表弹性纤维，淡黄色代表肌肉和红细胞。
图表D展示了Weigert间苯二酚法的效果。
胶原纤维染色法2.1 天狼星红苦味酸染色法天狼星红苦味酸染色法可用于胶原纤维的染色，其中红色代表胶原纤维，绿色代表细胞核，黄色代表其他物质。
天狼星红苦味酸染色法在偏光显微镜下观察，Ⅰ型呈强双折光性，呈黄色或红色纤维，Ⅱ型呈弱双折光，呈多种色彩疏网状分布，Ⅲ型呈弱双折光，呈绿色的细纤维，Ⅳ型呈弱双折光的基膜，呈淡黄色。
图表E展示了胶原纤维的染色效果，以及XXX.)苦味酸-酸性品红法在心肌梗塞后2个月的应用。
2.2 Van Gieson（V.G）苦味酸-酸性品红法Van Gieson（V.G）苦味酸-酸性品红法可用于胶原纤维的染色，其中鲜红色代表胶原纤维，黄色代表肌纤维、细胞质和红细胞，蓝褐色代表胞核。
图表E展示了胶原纤维的染色效果，以及XXX.)苦味酸-酸性品红法在心肌梗塞后2个月的应用。
三、网状纤维染色3.1 XXX-Sweets银氨染色法XXX-Sweets银氨染色法可用于网状纤维的染色，其中黑色代表网状纤维，红色代表胞核（核固红复染），黄棕色代表胶原纤维，淡红色代表细胞质（红液复染）。
组织病理隐球菌PAS染色
组织病理隐球菌PAS染色摘要：目的：探讨影响隐球菌糖原染色的因素，改善染色效果。
方法：选取隐球菌染色阳性的肺组织标本，比较高碘酸水溶液浓度氧化不同时长、雪夫氏（Schiff）染色时间对PAS染色质量的影响。
结果：浓度为l％高碘酸溶液，氧化30分钟，雪夫氏（Schiff）染色15分钟，可取得较好的染色效果。
结论：进行隐球菌糖原染色时，氧化程度是成功的关键。
关键词：糖原染色法；组织病理；隐球菌前言：PC，即肺隐球菌病，其属于一种新型隐球菌或是格特隐球菌在感染的条件下形成的急性、亚急性、慢性内脏真菌病，临床之中的表现形式为新型隐球菌的感染，而主要发生在免疫力低下的人群之中，不管是否具有基础疾病的人群都可能会发生此病，但此病的发病率并不高。
现代化条件下，伴随临床诊断技术的不断创新以及医务人员对疾病的了解更为深入全面，不断提高隐球菌感染的检出率，从而逐渐出现在人们的视野之中，成为了继念珠菌和曲霉菌之后的第三大类肺真菌疾病，并且在临床之中得到高度重视。
而糖原染色作为组织病理真菌检查常用的特殊染色，其染色过程受到多种因素的影响[1]，本文将从高碘酸浓度与氧化时间，雪夫氏（Schiff）试剂作用时间三方面探讨影响糖原染色的因素。
1实验材料与方法1.1实验材料组织标本选择本科室隐球菌染色阳性的蜡块。
1.2实验试剂与步骤实验试剂：l％高碘酸溶液：lg高碘酸粉末加至蒸馏水到100mL溶解；0.5%高碘酸溶液：1g高碘酸粉末加至蒸馏水到200mL溶解，其余试剂成分购自BASO公司。
试剂贮存在4℃的冰箱中，在染色时将其取出恢复到正常室内温度。
实验步骤：①石蜡切片厚度为3um；②石蜡切片脱蜡至水；③自来水冲洗2min，然后蒸馏水洗2min；④用高碘酸溶液氧化10-30min；⑤蒸馏水冲洗；⑥雪夫氏（Schiff）染液染色15-35min；⑦自来水流水冲洗；⑧苏木素复染细胞核1min；⑨流动水冲洗5min；⑩晾干，中性树胶封片，显微镜下观察真菌染色效果。
病理学技术特殊染色最总结均配图
病理学技术特殊染色最总结均配图结缔组织染色法Mallory三色染色法蓝色：胶原和网状纤维淡蓝色：软骨、粘液、淀粉样变物质红色：神经胶原纤维、肌纤维、酸性颗粒橘红色：髓鞘、红细胞图表 A 染色，显示胶原纤维，A组排列规则. Masson三色染色法绿色：胶原纤维红色：肌纤维橘红色：红细胞图表 B Mssson三色法. 显示胶原、网状和弹性纤维的三联染色法红色：胶原纤维黑色：网状纤维绿色：弹性纤维淡黄色：肌肉、红细胞图表 D 间苯二酚法二、胶原纤维染色法. Van Gieson（）苦味酸-酸性品红法鲜红色：胶原纤维黄色：肌纤维、细胞质、红细胞蓝褐色：胞核图表 E 2.胶原纤维，Van Gieson.)苦味酸-酸性品红法图心肌梗塞 myocardial infarction：心肌梗塞后2个月，van Gieson 染色, 坏死心肌被染成红色的纤维组织所代替，黄色区域为残留的心肌纤维。
天狼星红（Sirius red）苦味酸染色法(参照上图)红色：胶原纤维绿色：细胞核黄色：其他三、网状纤维染色Gordon-Sweets银氨染色法（梅花开枝图，金色阳光伴树枝）黑色：网状纤维红色：胞核（核固红复染）黄棕色：胶原纤维淡红色：细胞质（红液复染）图表 F 3.Gordon-Sweets氢氧化银氨液浸染法Gomori氏银氨液配制法图表 G Gomori氏银氨液配制法四、弹性纤维染色Gomori醛复红染色法*甲醛生理盐水液固定的染色效果最佳图表 H 醛复红染色法五、显示弹性、胶原纤维的双重组合染色法蓝绿色：弹性纤维红色：胶原纤维黄色：背景图表 I 间苯二酚法六、肌肉组织染色△横纹肌组织染色Mallory磷钨酸苏木精染色法（PTAH）蓝色：胞核、纤维、肌肉、神经胶质纤维、纤维蛋白、横纹肌黄色或枚红色：胶原纤维、网状纤维软骨基质、骨微紫色：粗弹性纤维（有时）紫蓝色或棕黄色：缺血缺氧早期病变的心肌图表 K .磷钨酸苏木素染色液△早期心肌病变组织染色染色法（1974年）红色：缺氧心肌、红细胞黄色或黄棕色：正常心肌蓝色：细胞核图各组小鼠心肌组织Nagar-Olsen染色（光学显微镜, ×200）显示缺氧心肌染色法（1964年）绿色：其他组织七、糖类染色过碘酸-Schiff（PAS）染色法红色：糖原及其他PAS反应阳性物质蓝色：细胞核图表 L 7.胃贲门腺体胞浆呈PAS阳性八、黏液物质（黏多糖）染色阿尔辛蓝过碘酸雪夫（ABPAS）染色法（1956）红色：中性黏液物质蓝色：酸性黏液物质紫红色：混合性黏液物质图表 M 染色结肠粘膜图表 N .胃粘膜组织 AB-PAS染色 40×：2.爱先蓝（）法蓝色：唾液酸、弱硫酸化黏液物质、一般粘液红色：胞核不着色：强硫酸化黏液物质图表 O .爱先蓝（）染色液图表 P .爱先蓝法图表 Q .爱先蓝法—3、爱先蓝（）法蓝色：含硫酸黏液物质不着色：非硫酸化酸性黏液物质红色：复染后的胞核九、黑色素染色黑色素银浸染色法黑色：黑色素及嗜银细胞颗粒红色：胶原纤维浅黄色：背景图表 R pigment in cells . malignant melanoma, Fontana-Masson stain.亚铁染色法暗绿色：黑色素浅绿或不着色：背景黄色：肌纤维和背景十、含铁血黄素染色Perls blue（普鲁士蓝）反应显示三价铁蓝色：含铁血黄素浅红色：其他组织图表 S 10.普鲁士蓝染色肝脏普鲁士蓝染色呈蓝色的含铁血黄素颗粒大量沉着在肝实质细胞和库普弗细胞内。
病理学技术——特殊染色最全总结
病理学技术——特殊染色最全总结特殊染色是病理学中常用的一种技术手段，用于染色并可视化细胞、组织或病理标本中特定的结构、细胞成分或病理损伤，从而帮助诊断人员更准确地判断疾病类型和病理变化程度。
特殊染色的种类繁多，下面将对一些常见的特殊染色进行全面总结。
一、银染色法银染色法是通过化学反应使待染物质与银盐结合，生成黑色或褐色沉淀，并在显微镜下观察变化。
常见的银染色方法有：Reticulin（網狀纖維）染色、Gomori银染色、Grocott-Methenamine银染色。
二、PAS染色PAS染色（Periodic Acid-Schiff染色）是一种常见的特殊染色技术，用于检测糖原以及其他多糖类物质。
通常使用的PAS染色是将待染物标本与过氧化铬酸溶液（Periodic Acid）处理后再使用Schiff试剂进行染色的方法。
PAS染色为酸性物质染成红色，大多为胞浆染色。
常见的应用包括鉴别肝细胞变性、神经纤维、肾小管等结构。
三、 Masson三色染色法Masson三色染色法是一种多彩染色方法，通过染色剂的组合可染出细胞核、胶原纤维和细胞质等不同组织成分。
Masson三色染色方法包括酸性区域以绿色染色显示胶原纤维，细胞核以黑色或暗蓝色染色显示，胞质以红色染色显示。
该染色法在组织纤维化、炎症反应等病变的检测中应用广泛。
四、Mallory三色染色法Mallory三色染色法和Masson三色染色法类似，可以用于显示胶原纤维、细胞核和胞质等组织成分。
其区别在于Mallory三色染色法标本在染色前需用盐酸处理，使染色剂更易于沉积在纤维上，能更清晰地显示组织纤维结构。
五、Giemsa染色Giemsa染色通常用于血液和骨髓涂片的染色，并可以显示细胞核、染色质和胞质等成分。
Giemsa染色法有多种方法，如Giemsa-Eosin染色法、Giemsa-Wright染色法等，可根据需要选用。
六、von Kossa染色法von Kossa染色法用于检测组织中的钙盐沉积，如血管壁的钙化、尿路结石等。
几种常用特殊染色操作过程中的要点
一、网状纤维染色 ——氢氧化银氨法（Gomori法）
5
（一）网状纤维的形态结构
较细的纤维组织、短、分支多，交织成网状
（与胶原纤维共同为细胞丰富的器官起到支撑作用）
HE呈淡红色，银氨液浸染、甲醛还原后呈黑色
（嗜银性/嗜银纤维：黑色）
主要由Ⅲ型胶原蛋白构成，表面被覆糖蛋白
（PAS染色：淡紫红色）
6
＋蒸馏水，洗涤沉淀（50-100ml蒸馏水） <反复/3次，沉淀不浑浊>
留下沉淀及少许上清液（4ml）
<保留沉淀物质>
逐滴＋氢氧化铵（一次1-2滴加入）
<边加摇晃>
至沉淀逐渐完全溶解
<无色溶液>
逐滴＋10%硝酸银，至刚出现浑浊 加氢氧化铵一至数滴，使沉淀消失
＋蒸馏水至40ml，2-8°C冰箱
<浑浊状态>
2
四、淀粉样物 刚果红法（甲醇刚果红、碱性刚果红）、甲基紫法 五、色素 含铁血黄素（Perls）、黑色素（Masson-Fontana）铜（罗 丹明、红氨酸） 六、糖类物质 糖原（PAS）、黏液物质（AB-PAS、AB） 七、脂内物质 中性脂肪（苏丹Ⅲ、Ⅳ、油红O）
3
八、神经组织 尼氏体（硫瑾、甲苯胺蓝）、神经髓鞘（变色酸2R、砂罗 铬花青） 九、肝脏穿刺 Masson、网状纤维、含铁血黄素、PAS、铜等。 十、肾脏穿刺组织 Masson、六胺银、PAS、刚果红等
1.氧化（KMnO4）：使网状纤维内羟基转变为醛基。<选择性> 2.漂白（H2C2O4）：棕色变为无色。 3.媒染（铁明矾）：增加网状纤维对银氨液的选择性。 4.浸银（氢氧化银氨）：银氨液中Ag（NH3）2+被组织吸附后与醛基结合。 5.还原（甲醛）：与网状纤维结合的银氨配位化合物还原成黑色的金属 银。
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真菌的组织病理学特殊染色马天;宋月星;邹先彪【摘要】Histological evaluation is quick and easy for pathogen identification and diagnosis in fungal infections. Some common special stains and application will be discussed in this paper.%组织学检查是一种识别真菌快速、简便的方法.本文介绍真菌病的病理学诊断中最常见的特殊染色方法及应用范围.【期刊名称】《中国真菌学杂志》【年(卷),期】2011(006)006【总页数】3页(P367-369)【关键词】特殊染色;真菌病;组织病理学【作者】马天;宋月星;邹先彪【作者单位】解放军总医院第一附属医院皮肤科,北京100048;解放军总医院第一附属医院皮肤科,北京100048;解放军总医院第一附属医院皮肤科,北京100048【正文语种】中文【中图分类】R446.83组织学检查是识别真菌的一种快速、简便的方法。
炎性肉芽肿和风湿性肉芽肿的组织学评价必须包含特殊染色以确定或排除真菌和抗酸细菌的存在。
在病理学日常实践和工作中，Gomori六胺银染色 (Gomori＇s methenamine silver stain，GMS)和糖原染色(Periodic acid-Schiff stain，PAS)是两种较常见的寻找组织和细胞样本中真菌的染色方法。
真菌在组织切片中的存在是侵袭性感染的有力证据。
在细胞学标本中，真菌可以通过它的大小和特殊的形态得到鉴定。
但由于其多样性，仅仅使用一些常规的染色很难在组织切片中发现或鉴别真菌。
1 广谱真菌染色苏木精-伊红染色 (Hematoxylin-eosin stain，HE)是一种多用途的染色方法 (见图1)。
但诊断真菌病仅仅使用HE染色常常是不够的，即使在高倍镜下，也很难从组织中区分出被染色的病原菌。
当HE染色切片中的真菌稀少时，很容易被忽略。
有些真菌的形态特征可能不显明，有时甚至会误诊。
如组织胞浆菌、皮炎芽生菌以及巴西副球孢子菌在切片中可能含有胞质，使形态鉴定变得很困难。
一些真菌变种可能有不同的大小，像大形状的变种(非洲)组织胞浆菌和小形状的芽生菌。
一些双相型的真菌可以在组织中形成假菌丝。
有时真菌形态可以在治疗后发生改变。
因此，对于无法解释的炎症过程的组织病理学检查，特殊染色是十分必要的［1-2］。
用常见的特殊染色方法可以轻而易举地显示出绝大多数真菌，因此，GMS、Gridley＇s真菌(Gridley＇s fungus，GF)染色和 PAS 染色也被作为“广谱”真菌染色剂。
GF染色原理与PAS染色原理基本相同，都是因真菌细胞壁由糖类构成而成阳性反应，只是以铬酸而非过碘酸氧化。
GMS比较适合用来初筛，因为即使是对变性的、无法用另外两种染色法识别的真菌，它都能提供更好的对照(见图2)。
GMS和GF染色的缺点是他们掩盖了被染色真菌的天然色素，无法确定他们是无色透明的还是暗色真菌(色素)，从而无法对真菌病如暗色丝孢霉病做出确定的组织学诊断［3］。
除 PAS反应，GMS和GF染色都无法显示真菌侵袭的炎症反应。
为了解决这个问题，GMS同时可进行HE复染来确定真菌及宿主反应。
岑玉兰等［4］对25例肺隐球菌病患者的观察中，GMS显示菌体荚膜呈黑色，其检出率为100%。
GMS也可以染藻类 (原壁菌属和小球藻属)、肺囊虫的包囊 (见图3)、致病性阿米巴、大多数微孢子虫的孢壁、胞浆内颗粒、以色列放线菌和相关的菌属、诺卡氏菌、大多数结核分枝杆菌属、具有多糖荚膜的非线状菌如肺炎克雷伯菌和肺炎链球菌。
而确定变性的真菌成分 (如肉芽肿内酵母组织胞浆菌)的存在需要延时硝酸银染色。
在真菌的筛选中，PAS染色与GMS同样有效。
实际上它对真菌形态的显示比银染好。
而PAS染色可以染色变性的真菌成分在HE染色中则可能无法显色。
干酪性肉芽肿中的钙化组织可通过PAS染色被发现，但它可能被误认为是酵母样真菌的出芽酵母、荚膜或者增厚的细胞壁。
GMS和GF染色是避免误诊最好的染色方法，因为铬酸作为氧化剂可以在染色过程中溶解钙，留下未染色的钙化体。
相反，GMS和 GF染色中可见的微小真菌在 PAS染色中不会出现，因此，GMS和PAS染色的联合使用可以降低假阳性率。
2 窄谱真菌染色真菌的鉴别诊断，可能需要额外的特殊染色，使某些真菌结构染色而其他的成分不染色，这些方法被称为“窄谱”真菌染色［5-6］。
如粘蛋白染色包括阿辛蓝(alcian blue)、Mayer＇s胭脂红染色或Southgate胭脂红染色 (Southgate＇s mucicarmine stain)等可以轻易鉴别新生隐球菌黏液囊 (见图4～5)。
这种染色方法可以将隐球菌与其他形态类似的真菌区别开，如粗球孢子菌、念珠菌和组织胞浆。
这些粘蛋白染色并非新生隐球菌的特异性染色，如皮炎芽生菌和西伯鼻孢子菌的细胞壁往往可被粘蛋白染剂不同程度地染色。
然而，这两种真菌都无包膜，且形态各异，因此通常不会被误认为是隐球菌。
在某些情况下，组织切片中无囊体的隐球菌可能不会被粘蛋白胭脂红完全染色，但新生隐球菌的细胞壁含有可能是黑色素前体的还原银的物质，它可以被黑素颗粒染剂的银染色［7-8］。
这种染剂尤其对具有以下两个特征的隐球菌有效，即以无包囊侵袭性的酵母菌型存在的，也就是所谓的干性变种。
这种隐球菌可能与具有相似形态的无囊体酵母菌混淆。
在组织切片中，Fontana-Masson法和Lillie＇s硫酸铁染色也可以用来定位和加强组织中细胞壁含黑色素和黑色素样染色不良的皮肤暗色丝孢霉［9］。
同时，PAS也可以当作窄谱染剂使用，例如，在对出芽的小酵母菌型不同的鉴别诊断中，一个弱PAS和一个强CMS染色支持组织胞浆菌的诊断，因为用PAS染色时，念珠菌、芽生菌的微缩型、马拉色菌的酵母型(见图6)的后壁会被染色。
另一种窄谱真菌染色是Ziehl-Neelson染色。
一项研究表明，使用ZN染色，60%的皮炎芽生菌和47%的组织胞浆菌生物(见图7)呈酵母菌样细胞的胞质阳性染色。
染色阴性主要出现在隐球菌或念珠菌，抗酸染色法很难用在内生芽孢［10］染色。
自体荧光某些真菌或在HE染色组织切片时，萤光真菌成分在紫外线光源下［11］可见自体荧光。
念珠菌属、粗球孢子菌属和曲霉菌属能表现出亮绿色到黄绿色荧光［12］。
当这些真菌组织切片被PAS染色 (见图8)时可以在深橘红色背景中观察到明亮的黄色荧光［10］。
自体荧光可以帮助诊断少量的或在HE染色中染色不佳部分真菌，但这一表现不稳定，不应作为最终诊断。
大多数在冷冻或石蜡包埋组织切片中的真菌被Calcofluor white(一种在紫外灯下发棉白色荧光的染色剂)非特异性染色［13］。
这种快速和简单的荧光染色经常用于新鲜冰冻组织的真菌检查中。
免疫组化染色可用于鉴别涂片标本和福尔马林固定标本，石蜡包埋组织中的某些真菌。
但是，这种技术只能局限性地应用于诊断中［14］。
3 直接免疫荧光直接免疫荧光 (immunofluoresence，IF)可提高［15］常规病理组织诊断在真菌疾病诊断中的作用。
直接免疫荧光可以用于涂片标本和福尔马林固定石蜡包埋组织切片的定性诊断，尤其是当新鲜组织无法进行真菌培养或发现非特异性图像时。
亚特兰大(美国)真菌性疾病机构、疾病控制中心和其他有组织都拥有很多对常见致病真菌的诊断兼具敏感性和特异性的试剂。
免疫荧光方法有几个优点，待鉴别的真菌在HE染色和GMS染色切片后，初步鉴定可能在数小时内完成。
免疫荧光可以省时省力，在处理潜在感染材料时，在荧光染色前微生物在福尔马林中被灭活，可以减少微生物的感染风险，避免污染。
福尔马林固定的组织，无论是湿组织或石蜡包埋，长期储存不会影响真菌抗原性。
石蜡包埋组织抗原性稳定，这可以保证在回顾性研究中或将标本远途运送至认证实验室后，其鉴定依然准确。
大部分临床实验室不经常使用免疫荧光法，因为特殊的着色剂对日常病理诊断已经非常可靠了。
图1 曲霉的HE染色［16］图2 曲霉的GMS染色［16］图3 肺囊虫的GSM染色［16］图4 隐球菌的阿辛蓝染色［16］图5 隐球菌的PAS染色(×1 000)［17］图6 PAS染色下的马拉色菌属［16］图7 ZN染色下的组织胞浆菌属［16］图8 PAS染色下的组织胞浆菌属(×400)［17］Fig.1 Hematoxylin and Eosin staining of Aspergillus Fig.2 GMS staining of Aspergillus Fig.3 GMS staining of Pneumocystis jirovici Fig.4 Alcian Blue staining of Cryptococcus Fig.5 PAS staining of Cryptococcus Fig.6 PAS staining of Malassezia Fig.7 ZN staining of Histoplasma Fig.8 PAS staining of Histoplasma参考文献［1］Schwartz J.The diagnosis of deep mycoses by morphologic methods ［J］.Hum Pathol，1982，13(6):519-533.［2］Vacca boratory Manual of Histochemistry［M］.New York:Raven，1985.［3］Chandler FW，Kaplan W，Ajello L.Color atlas and text of the histopathology of mycotic disease［M］.Chicago:Year Book Medical，1980. ［4］岑玉兰，李勇.肺隐球菌病25例临床病理分析［J］.临床与实验病理学杂志，2010，26(2):237-238.［5］Youngberg GA，Wallen EDB，Giorgadze TA.Narrow-spectrumhistochemical staining of fungi［J］.Arch Pathol Lab Med，2003，127(11):1529-1530.［6］Hussain Z，Martin A，Youngberg GA.Blastmyces dermatitides with large yeast forms［J］.Arch Pathol Lab Med，2001，125(5):663-664.［7］Kwon-Chung KJ，Hill WB，Bennett E.New，special stain for histopathological diagnosis of cryptococcosis［J］.J Clin Microbiol，1981，13(2):383-387.［8］Lazcano O，Speights VO Jr，Stickler JG，et bined histochemical stains in the differential diagnosis of Cryptococcus neoformans［J］.Mod Pathol，1993，6(1):80-84.［9］Wood C，Russel-Bell B.Characterization of pigmented fungi by melanin staining［J］.Am J Dermatopathol，1983，5(1):77-81.［10］Jackson JA，Kaplan W，Kaufman L.Development of fluorescent-antibody reagents for demonstration of Pseudallescheria boydii in tissue ［J］.J Clin Microbiol，1983，18(3):668-673.［11］Mann JL.Autofluorescence of fungi:an aid to detection in tissue sections［J］.Am J Clin Pathol，1983，79(5):587-590.［12］Graham AR.Fungal autofluorescence with ultraviolet illumination ［J］.Am J Clin Pathol，1983，79(2):231-234.［13］Monheit JE，Cowan DF，Moore DG.Rapid detection of fungi in tissue using calcofluor white and fluorescence microscopy［J］.Arch Pathol Lab Med，1984，108(8):616-618.［14］Kobayashi M，Kotani S，Fujishita M，et al.Immunohistochemical identification of Trichosporon beigelii in histologic sections byimmunoperoxidase method［J］.Am J Clin Pathol，1988，89:(1)100-105. ［15］Reiss E，de-Repentgny L，Kuykendall J，et al.Monoclonal antibodies against Candida tropicalis mannans antigen detection by enzyme immunoassay and immunofluorescence［J］.J Clin Microbiol，1986，24(5):796-802.［16］Abida Haque.Special stains and H＆E［M］.US:Connection，2010:187-194.［17］王端礼.医学真菌学-实验室检验指南［M］.北京:人民卫生出版社，2005.。