人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测

里！型！！塑型！！垫！婴！型塑坠！人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测。

刘德敏杨莉丽丁玉静孙颖于德民摘要目的：在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。

方法：利用ＰＣＲ技术扩增人脂联素基因完全编码序列，选用Ｇａｔｅｗａｙ原核表达体系，经过ＢＰ反应、ＬＲ反应两步反应，将ＰＣＲ产物克隆人ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２质粒，构建融合表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２，ａｔｔＢ—ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，转化大肠杆菌Ｂ１２１（ＤＥ３），以异丙基硫代一Ｂ—Ｄ一半乳糖苷（ＩＹｒＧ）诱导表达脂联索融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，ＮＤＳＢ２０１高效复性后，使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞，ＲＴＰＣＲ法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖一６一磷酸酶转录水平的影响。

结果：成功构建了表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ—ａｄｉｇｎｎｅｃｔｉｎ，ＤＮＡ序列测定结果与预期一致。

ＩＰｒＧ诱导表达的融合蛋白经纯化后ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定具有人脂联素抗原性，并可使培养的肝细胞中葡萄糖－６一磷酸酶转录水平下降。

结论：获得具有生物学活性的重组人脂联素为进一步研究脂联素的生理机制奠定了基础。

关键词脂联索克隆，分子基因表达肝细胞重组蛋白质类葡糖一６—磷酸酶大肠杆菌ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＡｃｔＭｔｙＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＨｕｍａｎＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎＧｅｎｅＬ１ＵＤｅｎｔｉｎ，ＹＡＮＧＬｉｆｔ，ＤＩＮＧＹ删抽ｇ，ＳＵＮＹｉｎｇ，ＹＵＤｅｍｉｎＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｗｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｔａｂｏｌｉｃＨｏｐｉｔｕｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｌｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｘｐｒｅｓｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｗｉｔｈｂｉｏｌｏ咖ａｌａｅｆｉｖｉＶｉｎＥｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｅＤＮＡｃｏｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｇｅｎｅⅧａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲＧａｔｅｗａｙｐｍｋａｒｙｏｆｉｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｕｓｅｄＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２ｐｌａｓｍｉｄｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｆｕｓｉｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ－ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｓｉｔｅｒＢＰｒｅａｃｆｉｃｍａｎｄＬＲｒｅａｃｔｉｏｎｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２／ａｎＢ—ａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎＷａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥｅｏｌｉＢ１２｜ａｎｄｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｗⅡｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｄｉｐｏｎｅｅｔｌｎ，ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＷ８８ｐｕｎｆｉｅｄｂｙＮｉ・ＮＴＡａⅡｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｍａｔａｎｔａｄｉｐｏｎｅｅｆｉｎｏｎｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈ０８ｐｈａｔｏｎｅｗ∞ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ—ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｈｏｗｅｄ出啦ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｃｔｏｒｐＥＴ—ＤＥｓＴ４２ｆ戬啦＿ａｄｉｐ叫ｅｃ血ｗ啦ｅｍａｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．ｐｕｒｉｆｉｅｄａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｓｈｏｗｅｄａｎｄｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｒｅｄｕｃｅｄｓｋｏ”６一ｐｈ０８ｐｈａｔａｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｅｖｅｌＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｗｅｈａｖｅｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈａｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｗｉｔｈｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ．ｗｈｉｃｈｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｖ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｃｌｏｎｉｎｇ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｇｌｕｅｏｓｅ一６一ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｅｓｃｈｅｆｉｃｈｉａｃｏｌｉ人脂联素（ａｄｉｐ（、ｎｅｃｔｉｎ）基因全长１７ｋｂ，位于染色体３ｑ２７，包含３个外显子和２个内含予。

该基因编码的脂联素蛋白在血浆中分子质量为２８ｋｕ。

脂联素在血循环中含量较高，其血浆浓度约占总血浆蛋白的Ｏ０１％ｒ”。

目前，脂联素在调节血糖稳态、抗动脉粥样硬化及抗炎等方面的作用已有较为肯定的认识［２１。

脂联素在治疗领域的尝试也已开始，为了能够更好地了解脂联素的结构及作用机制，本研究利用Ｇａｔｅｗａｙ表达系统快速构建了人脂联素原核表达载体，表达并纯化了重组脂联素蛋白。

１材料与方法１．１材料大肠杆菌ＤＨＳａ及Ｂ１２１（ＤＥ３）均为本实验室保存，质粒ｐＭＤｌ８一Ｔ，ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶，ＤＮＡ凝胶回收试剂盒为大连宝生物公司产品。

质粒ｐＤＯＮＲ２０１，ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２以及Ｇａｔｅｗａｙ表达体系均为［ｎｖｉｔｒａｇｅｎ公司产品（澳大利亚新南威尔士大学齐建成教授馈赠）。

Ｍ－ＭＬＶ逆转录酶为ｐｍｍｅｇｎ产品。

兔抗人脂联素多克隆抗体购自Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ公司；辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的羊抗兔ｌｇＧ为北京中杉公司产品。

蛋白纯化试剂盒以及１６４０培养基为Ｎｏｖｏｇｅｎ公司产品。

蛋白复性用ＮＤＳＢ２０１由美国Ｓａｎｔａｃ［ｕｚ公司ＴｏｍｍｉｅＬｅｅＳｔａｄｉｎｇ先生馈赠。

异丙基硫代一８一Ｄ一半乳糖苷（Ｉ丌Ｇ），二硫苏糖醇（ＤＷｒ）等均为进口或国产分析纯试剂。

１，２方法１．２．１人脂肪组织总ＲＮＡ的提取和脂联素基因的克隆新鲜皮下脂肪组织标本取自一行子宫痛切除术且无代谢性疾病者。

提取总ＩＬＮＡ。

将１ｔｒｇ总ＲＮＡ．７２℃变性２ｍｉｎ后迅速冰浴降温，加入１５此逆转录酶混合液（２ＵＲｎａｓｅ抑制剂，・天津市教委基金资助项目（项目编号：２００３０２５）；天津市自然科学基金资助项目（项目编号：０４３６０９２１１）作者单位：３（ｍ０７０天津医科大学代谢病医虢　万方数据走津医药２００７年９月第３５卷第９期０．５ｒｎｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ，５；ｔｍｏｌ／Ｌ随机引物，１０ＵＭ—ＭＬＶ），２５０ｃ温育１０ｒａｉｎ，３７℃温育ｌｈ，９４℃加热５ｍｉｎ终止反应。

以１“Ｌ得到的ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增长度为８１７ｂｐ的含人脂联素基因读码框架的ＤＮＡ序列。

上游引物：５＇－ＧＥＴＣＡＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴ一３’，下游引物：５’～ｃＴｒＣＣＴＡＡＣＣＧＴＡＣＴＧＡ一３’。

ＰＥＲ产物经纯化回收后，与ｐＭＤ～１８Ｔ载体连接，｛勾建重组质粒ｐＭＤ一１８Ｔ／脂联素，送大连宝生物公司测序鉴定。

１．２．２人脂联素基因原桉表达载体的构建按照Ｇａｔｅｗａｙ表达体系操作手册，ＰＣＲ产物两端需带上该表达体系所特有的ａｔｔＢ位点，因此设计以下引物。

上游引物：５７－ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴ＇ＩＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＴ－３’，下游引物：５’』．．ＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴｃＧＴｒＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＴＡＧＡＧＡＡＧ“Ａｑ’（黑体部分分别为ａｔｔＢｌ、ａｔｔＢ２位点）。

纯化回收ＰＣＲ产物，进｛亍如下ＢＰ反应：２）ｘＬＰＣＲ产物，２ｐＬｐＤＯＮＲ２０１质粒，４山ＢＰ反应缓冲液，ＴＥ缓冲液２比混匀后加八２ｖ－ＬＢＰｃｌｏｏａｓｅ蛐ｇｙｍｅ，ｄｄＨ２０４山混匀，２５ａＣ孵育６０ｍｌｎ后，加人２止蛋白酶Ｋ溶媛，３７℃孵育１０ｍｉｎ，转化ＤＨ５ａ感受态细胞，接种于ＬＢ琼脂平板，筛选阳性克隆，提取质粒。

该质粒为插人载体。

进行ＬＲ反应：２斗Ｌ插入质粒（约１５０ｎｇ），２ｔｔＬｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２质粒，４“ＬＬ丑反应缓冲渡，ＴＥ２ｔｚＬ，混匀励ＩＩＡ．２仙ＬＬＲｃｌｏ，ｍｓｅｅｎｚｙｍｅ，其后步骤同上，转化ＢＬ２１感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒进行ＤＮＡ测序鉴定，阳性菌檬子－８０℃缳存。

１．２．３重组脂联素蛋白的表达、纯化和复性将阳性菌株的过夜培养物转接于珀液体培养基中，３７℃振荡培养至Ｏｎ锄为０．６左右，加ＡＩＰＴＧ（终浓度为１ｍｍｄ／Ｌ），诱导６ｈ，离心集菌。

超声碎菌，１００００。

ｇ离心１５ｒａｉｎ收集上清和沉淀。

沉淀部分（包涵体）经处理后用组氨酸纯化试剂盒（Ｑｉａｇｅｎ）避行纯化。

纯化蛋白缓慢加入复性液（５０ｎｍｌｏｌ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣＬ．２００ｎｕｎｏＹＬＮａＣＩ，１５ｍｏｉ，ＬＮＤＳＢ２０１，ｐＨ８．０）及２ｍｍｏｌ／Ｌ半胱氨酸（Ｃｙｓ）／还原性Ｃｖｓ，４０ｃ搅拌混匀并放置１ｈ后透析。

１．２．４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测蛋白样品行１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳后，用ｓｅｍｉ－ｄｒｙ方法转移到硝酸纤维素膜上，封闭液室温振荡封闭１ｈ，加入以封闭棱稀释的一抗（Ｉ：３０００）４℃过夜，洗涤后加人ＨＲＰ～羊抗兔ｉｇＧ（１：５０００），室温孵育１ｈ，洗膜后ＤＡＢ显示条带。

１．２．５重组脂联素的活性检测透析、浓缩的重组脂联素蛋白样品经Ｂｒａｄｆｏｒｄ法定量，设４个浓度组，分别为５００、１０００、２０００、５０００峭几，及对照组（高糖加蛋白透析液），原代大鼠肝细胞培养啭细胞完全贴壁后，换成含葡萄糖（２５ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ）和不同浓度重组脂联素的培养液继续孵育１６ｈ。

ＲＴ－ＰＣＲ法测定各组肝细胞中葡萄糖“—磷酸酶的转录水平。

由大连宝生物公司合成葡萄糖＿６—磷酸酶引物，上游引物５＇－ＧＣＧＣＴ－ＧＴＣＴＧＴＧＴＡＴＧＧＧ３’，下游引物５’—ＧＣＴｆＧＧＣＧＡＴＧＣＴＡＣ—ＣＴＧＡ一３‘，Ｂ—ａｃｔｉｎ上游引物５’一ＣＧＧＧＡＣＣＴＧＡＣＡＧＡＣＴＡＣ—ＴＡＣ一３７，下游引物５＇－ＧＴＡＣＴＣＴＣ－ＣＴｒＣＴＧＡＣＣＡ－３＇ｏＰＣＲ扩增条件为：９４ｃｃ预变性３ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ；５４℃退火４５ｓ；７２６４５℃延伸３０ｓ；葡萄糖一６一磷酸酶扩增３３个循环，１３－ａｃｔｌｎ扩增２３个循环；最后７２℃延伸３ｍｉ”。

ＰＣＲ产物行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统照相并＿Ｉ；｜于软件分析。

２结果２，１人脂联素基因的克隆及表达载体的构建从人脂肪组织提取总ＲＮＡ，经ＲＴ—ＰＣＲ法扩增得到包含脂联素基因读码框架的８１７ｂｐ的脂联素基因片段．构建的ｐＭＤｌ８一刚自联素为３５０９ｂｐ。

经ＢＰ反应后得到的插入载体长度为３１７３ｂｐ，ＬＲ反应所得到的表达载体ｐＤＥＳＴ４２／ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ长度为６４７７如，经１％琼脂糖凝胶电泳显示，大小均与预期相符，见图１，测序结果ＤＮＡ序列与预期一致，未发现错配碱基。

ｌ：８１７ｂｐ目目联素ｅＤＮＡ片＆；２：ｐｂｌＤｌ８一嘴联索载体；３、８：ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；４：ａｔｔＢ一脂联素；５：ｐＭＤｌ８－ＴｔａｔｌＢ一脂联素：６：ｐＤＯＮＲ２０ｌ／ａｔｔＢ川自联幕；７：ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ一脂联素图１～自联索基因的克隆和表达载体构建２．２重组脂联素蛋白的鉴定表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ一脂联素转化人ＢＬ２１菌株，表达的融合蛋白绝大部分以包涵体形式存在，由于载体上带有一羧基端融合标签及纯化标签，所以融合蛋白分子质量约为３０ｋｕ。