琼脂糖凝胶电泳示意图
琼脂糖凝胶电泳-完整整理
基因组分析
分子诊断
用于分离和鉴定基因组DNA片段，如限制 性片段长度多态性分析、基因突变检测等 。
用于检测和鉴定基因突变、病原微生物DNA 等，如聚合酶链式反应（PCR）产物电泳、 单链构象多态性分析等。
基因克隆
测序
用于分离和纯化目的基模板，如末端测 序、全基因组测序等。
达差异。
04 琼脂糖凝胶电泳实验问题 与解决
常见问题
条带弥散
由于点样量过多或电压过高，导致条带弥散。
条带过宽
由于凝胶浓度不合适或样品浓度过高，导致 条带过宽。
条带拖尾
样品中蛋白质降解或核酸酶污染，导致条带 拖尾。
条带不亮
由于染料浓度过低或曝光时间过短，导致条 带不亮。
问题分析
条带弥散
可能是由于点样量过多或电压过高， 导致DNA在凝胶中扩散。
琼脂糖凝胶电泳-完 整整理
目录
CONTENTS
• 琼脂糖凝胶电泳介绍 • 琼脂糖凝胶电泳实验操作 • 琼脂糖凝胶电泳结果分析 • 琼脂糖凝胶电泳实验问题与解决 •凝胶电泳的定义
01
琼脂糖凝胶电泳是指在琼脂糖凝 胶中进行的电泳技术，主要用于 分离、鉴定和纯化DNA片段。
浓度比较
通过条带亮度，比较不同 样品中目标DNA片段的浓 度。
纯度评估
根据条带的亮度与背景噪 音的比例，评估DNA片段 的纯度。
结果应用
基因克隆
01
通过琼脂糖凝胶电泳检测目的基因是否被正确克隆到载体中。
突变分析
02
利用电泳结果判断是否存在基因突变或点突变。
基因表达分析
03
通过比较不同组织或细胞系中目的基因的表达水平，分析其表
01
条带分析
《基因工程与细胞工程》质粒DNA的限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切图谱实验
《基因工程与细胞工程》质粒DNA的限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切图谱实验【实验目的】1、掌握实用的分子生物学基本操作技术；2、提高处理DNA样品的操作技能；3、学会使用限制性内切酶对DNA样品进行酶切；4、学会配制琼脂糖凝胶；5、学会使用电泳技术分析和鉴定DNA分子。
【实验原理】1、质粒DNA的限制性酶切DNA的酶法操作是DNA重组技术中一项最常用的工具。
特别是一系列限制性内切核酸酶的使用，能够在特异性位点切割DNA，对从分子水平上认识基因的结构与功能和进行重组DNA技术研究是非常有用的。
限制性内切酶来源于细菌，能够在特异性的目标序列中（即限制性酶切位点）切割双链DNA，从而产生特定的DNA片段（即限制性酶切片段）。
内切酶是细菌限制与修饰体系中的一员，能够使细菌细胞免受外源性DNA的侵害，即通过切割噬菌体DNA中的特异性位点来限制细菌噬菌体的繁殖，从而抑制噬菌体对细菌细胞内的入侵。
细菌通过修饰限制酶的识别位点来防止限制酶破坏其自身的DNA，通常是利用对识别位点中1个碱基的甲基化修饰来实现的。
历年来，从细菌细胞内分离纯化的限制性内切酶的种类在不断增加，并越来越多的被分子生物学家应用到DNA的体外操作中。
每种限制酶都能识别1段特异的DNA序列，其中最常见的是长度为4-6 bp的回文序列（反向重复序列）。
同时，不同种类的限制酶在识别的切割位点是不同的，有些可能是在识别位点的中间切开，产生平末端（钝末端）；而另一些限制酶可能是将识别位点错位切开，生成5’或3’突出末端（黏性末端）。
表2列举了本实验中所使用的2种限制酶的识别位点和切割位点。
表2 2种限制酶的识别位点和切割位点注：↓或↑：表示酶切位点。
2、DNA限制性内切酶酶切图谱（1）图谱简介DNA限制性内切酶酶切图谱，又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。
在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP（限制性片段长度多态性）技术更是建立在它的基础上。
质粒DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳
化工专业实验实验名称质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳班级化21 姓名张腾学号成绩实验时间同组成员王乙汀、陈秉伦、梁有向1 实验目的（1）掌握碱裂解法提取质粒的原理和方法（2）掌握琼脂糖凝胶电泳分离鉴定DNA的原理和方法。
2 实验原理2.1质粒质粒（plasmid）是在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，是细菌染色体外的小型双链环状DNA复制子。
理论上讲，所有的细菌株系都含有质粒，有些质粒携带有帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息，即F质粒，有些则表达对一种抗生素的抗性，即R 质粒，还有一些携带的是参与或控制一些不同寻常的代谢途径的基因即降解质粒。
质粒的大小不定，小的不到1kb，大的超过500kb，每个质粒都有一段DNA复制起始点的序列，它帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。
对细菌的某些代谢活动和耐药性表型具有一定的作用。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。
细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。
根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。
每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。
按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。
一般分子量较大的质粒属严紧型。
分子量较小的质粒属松弛型。
质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
实验15 琼脂糖凝胶电泳的原理和方法
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射 荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度 与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。
注意事项：
EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样，
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琼脂糖凝胶电泳的缺点： 1) 机械强度差，易破碎，浓度不能太低； 2) 易被细菌污染，不易保存，临用前配制； 3) 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后
必须立即固定染色； 4) 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。
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三、琼脂糖凝胶电泳的应用
目前，琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸，如 DNA鉴定、DNA限制性内切酶图谱制作等。由于这种方法操 作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基 因工程研究中常用实验方法之一。
常用荧光染料溴乙锭(EB)染色，在紫外光下观察D NA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出 照片，并进行有关的数据分析。
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五、琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白
原理 血浆脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以琼
脂糖凝胶为支持介质，在pH8.6巴比妥缓冲液 中电泳，根据各脂蛋白的组成、大小、形状 分离成不同区带。
HDL 少 少 多 多
小 高 快
pH 8.6 > pI ，各种脂蛋白均带负电，电泳时由 负极到正极；VLDL为圆形，受阻力小，LDL形态 不规则，受阻力大，所以VLDL跑在前。
CM
LDL
VLDL HDL
—
+
加样槽
β
前β
α
临床应用：高脂蛋白血症的分型 CM β 前β α
正常 Ⅰ型 Ⅱa型 Ⅱb型 Ⅲ型 Ⅳ型 Ⅴ型
琼脂糖凝胶电泳详解
一、简介琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶作为支持介质、利用核酸分子在电场中时的电荷效应和琼脂凝胶的分子筛效应，达到分离核酸混合物的一种电泳技术。
1、琼脂糖的分子筛效应1）琼脂糖（Agarose）来源于海洋红藻细胞壁，是一种大分子线性聚合物，基本结构是由D-半乳糖和3,6-anhydro-α-L-半乳糖通过β-1,4糖苷键结合而成的双糖单位在α-1,3糖苷键的连接下形成的一个长链。
琼脂糖具有亲水性，并几乎完全不存在带电基团，对敏感的大分子极少引起变性和吸附，是理想的惰性载体。
常用作电泳、层析等技术中的半固体支持物，用于生物大分子或小分子物质的分离和分析。
琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到40℃左右形成良好的半固体状凝胶。
琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成直径从50nm-200nm不等的孔径结构，孔径的大小由凝胶浓度控制。
琼脂糖凝胶中孔径的大小，影响了通过的核酸分子的大小以及通过的速度。
通常来说，琼脂糖凝胶的浓度越高，孔径越小，能够通过的核酸分子越小，迁移速度也越慢。
DNA片段越小，所需的胶浓度越大；而DNA 片段越长，所需的胶浓度则越小。
选择合适的胶浓度才能更好的分离片段。
2）琼脂的质量评价琼脂糖通常通过其凝胶强度和电内渗情况判断质量好坏。
强度越高，凝胶性能越好。
质量较好的琼脂糖强度通常在1200g/cm2以上，硫酸根含量在0.2%以下，电内渗在0.13以下。
琼脂糖是从琼脂中分离而来的。
琼脂由琼脂糖和琼脂果胶组成的，琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物，和琼脂糖结构相似，但带硫酸根和羧基组分，凝胶能力差。
在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除，否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取代电离基团，附着到琼脂糖的多糖基质上，造成电内渗（EEO）。
电内渗会导致缓冲液中产生正电荷反向离子，它们向负极移动，从而造成与DNA反方向迁移的液流，使DNA的分离效果变差。
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下:1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65?左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止 .3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.(5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min.(6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存实验原理闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA(cccDNA)、线性质粒DNA(L-DNA)和开环质粒DNA(ocDNA)。
实验材料和试剂(一)实验样品质粒pUC118(二)试剂1(l DNA/HindIII分子量标准2(溴酚蓝指示剂点样缓冲液0.2% 溴酚蓝50% 蔗糖3(1mg/ml溴化乙锭溶液4(电泳缓冲液(TAE)40 mmol/L Tris-乙酸1 mol/L EDTA(配制方法:24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml)5(0.7% 琼脂糖凝胶(配制方法:称取琼脂糖0.35克，加入50ml TAE电泳缓冲液)(三)仪器微量移液器电泳仪水平电泳槽透射紫外观察仪实验步骤1(选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析【实验目的】1.学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；2.掌握群体遗传学基因频率与基因型频率的计算方法。
【实验原理】1. 凝胶电泳是分离、鉴定、纯化及制备DNA片段最常用的方法，可分为两类，一类是琼脂糖凝胶电泳，适用于l kb和大于l kb以上DNA；另一类是聚丙烯酰胺凝胶电泳，适用于小于l kb的DNA。
琼脂糖凝胶电泳是一种简便易行的分离、纯化和鉴定DNA片段的方法。
分为水平板和垂直板两种，一般采用水平电泳。
2. 琼脂糖凝胶在DNA分子泳动时兼有“分子筛”和“电荷”的双重作用。
3. DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
4. 由于琼脂糖凝胶具有网络结构，因此电泳时，带电颗粒的分离速度不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小。
5. 由于实验中相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极移动。
6. 相对分子质量小者泳动快，大的泳动慢。
7. 溴化乙锭是分子生物学实验中常用的DNA荧光染料，含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团，它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。
DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。
溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍。
所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5μg/mL）时，可以检测到少至10ng的DNA条带8. TBE（成分：Tris，EDTA，硼酸，蒸馏水）的作用：a.稳定体系酸碱度（正负极氧化还原反应，使正极变酸、负极变碱性）b. 使溶液具有导电性，以利于DNA分子的迁移c. 其中的EDTA螯合镁离子，防止电泳时激活DNA酶9.引物二聚体: 引物二聚体是引物的3’端间相互错配扩增形成的。
引物二聚体的出现是必然的，只是或多或少的问题，电泳时看不到引物二聚体带也不代表没有二聚体出现，只是含量低我们的肉眼看不到而已。
琼脂糖凝胶电泳解析
D23-TA克隆酶切鉴定 1~3 阳性克隆 6~8 阳性克隆/EcoRI 4 假阳性克隆（载体环化） 9 假阳性克隆/EcoRI 5 DL2000
图4 S基因克隆到T载体中
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
5.1kb 2000bp
1 PCDNA3/EcoR 1 酶切 2，3，7，8，9，10 PCD12/ EcoR 1 酶切 4,5 PCD12/ EcoR 1 酶切(酶切不全） 6 DL2000
1 Marker 2 S2（1875bp） 3 S1（2172bp）
2nd扩增S1，S2 1 S1 2 S2 3 DL2000
S1，S2产物纯化 1，4 DL2000 2 S1
3 S2
PCR扩增某病毒S基因
二、琼脂糖凝胶电泳的原理是什么
▪ 1 带电颗粒在电场中将受到电场力的作用而发生泳 动。
▪ 2 电泳缓冲液中充满了离子，因而导电，DNA分子 在PH 7~8时带负电，因此在电场作用下向正极泳动。
3 上样，电泳，染色
加样：取10μL DNA样品与2μL 6×上样液混匀，用微量移液 枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例 增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个 样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操 作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
电泳：加完样后,合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持 在60-80V（1～5v/cm），电流在40mA以上。当溴酚蓝 条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。
①-2 ①-7 ①-8 ①-9 ①-10 ③-2 ③-5 ③-13 ⑥-13 ⑥-14 ⑥-16 ⑥-20 M
⑥-24 ⑦-1 ⑦-2 ⑦-4 ⑦-5 ⑦-6 ⑦-13 ⑦-14 ⑧-3 ⑧-4 ⑧-7 ⑧-8 M
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粗分离 透析除去分子较小的杂质
纯化 纯度鉴定
通过凝胶色谱法将分子量 较大的杂质蛋白质除去
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳
鉴定血红蛋白纯度
跳转
1.洗涤红细胞
阅读思考：洗涤的目的是什么？
洗涤过程： 3g柠檬酸钠
吸出血浆
5倍体积生理盐水
血液 100mL
低速离心 2 min
血浆 红细胞
红细胞
搅拌10min
重复洗涤3次，直至上清液没有黄色
2)原理
分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子大 小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速 度，从而实现样琼品脂中糖各凝种胶分电子泳的示分意离图。
3)类型: •琼脂糖凝胶电泳
•聚丙稀酰胺凝胶电泳
4)实例：SDS——聚丙稀酰胺凝胶电泳
原理： SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复 合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋 白质分子原有电荷量。使电泳迁移率完全 取决于分子的大小。 用途: 测定蛋白质的分子量
血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁 血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧 化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。
鸡的红细胞 人的红细胞
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA， 便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞 核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提 取血红蛋白
一.基础知识
(一)蛋白质分离和提取的原理
3）凝胶色谱法的原理—分子筛效应
大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。
4）分离过程
混合物 洗 大分子流动快 上 柱 脱 小分子流动慢
收集 大分子
收集 小分子
洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白 质分子的差速流动。
2.电泳
1)概念 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程
1.作用
抵制外界的酸或碱对溶液pH值的影响， 维持pH基本不变
2.配制
通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配 制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以 制得在不同PH范围内使用的缓冲液。
3.提问：在本课题中使用的缓冲液是
磷酸缓冲液
二.实验操作
样品处理
(1)红细胞的洗涤 (2)血红蛋白的释放 (3)分离血红蛋白溶液
3.分离血红蛋白
红细胞破 碎混合液
高速离心 10min
用滤纸过滤，除去脂溶 性沉淀层，于分液漏斗 中静置片刻后，分出下 层的红色透明液体。
（无色透明） （白色薄层固体） （红色透明液体）
（暗红色）
粗分离——透析
①过程
②透析目的
1mL 20mmol/L磷酸缓冲液
除去样品中分子量较小的杂质
纯化——凝胶色谱法
根据蛋白质各种特性的差异： •分子的形状、大小 •电荷性质和多少 •溶解度 •吸附性质 •对其他分子亲和力
（二）蛋白质提取和分离的方法 •凝胶色谱法：又称分配色谱法 •电泳法
1.凝胶色谱法 (分配色谱法)
1）概念
根据相对分子质量的大小分离蛋白质的 有效方法
2）材料：凝胶
凝胶是微小的多孔性球体，多糖类化 合物如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯 穿的通道。
1.凝胶色谱柱的制作 2.凝胶色谱柱的装填 3.样品的加入和洗脱
注意事项
1. 红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 为什么？
2. 凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡
3. 色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱 液不能断流。
4. 色谱柱成思考： 1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入
了哪些物质？ 2.为了加速释放过程，采取了什么措施？
目的分析： 1. 蒸馏水的作用是____使__红__细__胞__大__量__吸__水__胀__裂________。 2. 加入甲苯的作用是___溶__解__红__细__胞__的__细__胞__膜_________。 3. 充分搅拌的目的是___加__速__红__细__胞__的__破__裂___________。
鉴定蛋白质的纯度
讨论：如何测定蛋白质的分子量？
使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋 白质的分子量时，可选用一组已知分子量的 标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的 标准蛋白的电泳区带位置，可以测定未知蛋 白质的分子量。
(三)缓冲溶液
说出人体血液中缓冲液?
如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4