鸡新城疫抗体滴度检测
鸡新城疫抗体(NDV-Ab)说明书
鸡新城疫抗体（NDV-Ab）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定鸡血清，血浆及相关液体样本中新城疫抗体（NDV-Ab）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中鸡新城疫抗体（NDV-Ab）水平。
用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被单抗的微孔中依次加入新城疫抗体（NDV-Ab），再与HRP标记的抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的新城疫抗体（NDV-Ab）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中鸡新城疫抗体（NDV-Ab）浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：1800ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存20倍浓缩洗涤液20ml×1瓶30ml×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
鸡新城疫抗体检测步骤,鸡新城疫的症状表现
鸡新城疫抗体检测步骤，鸡新城疫的症状表现1、将样本做去皮和去脂处理，并用均质器均质样本，然后称取适量的均质物至离心管内。
2、依次加入蒸馏水、试剂A、衍生化试剂，振荡混匀后孵育半小时。
3、依次加入试剂B、试剂C、提取剂，并振荡混匀。
4、离心5分钟，取上层有机相至离心管内，再用氮气吹干。
5、用净化剂溶解干燥物，加入试剂D，离心2分钟后待检。
一、鸡新城疫抗体检测步骤1、将鱼虾蟹、畜禽肉、内脏等样本做去皮、去脂肪等处理，再用均质器均质样本，然后称取3±0.05克均质物至15毫升的离心管内。
2、依次加入4毫升蒸馏水、0.5毫升试剂A以及0.6毫升衍生化试剂，并振荡混匀，于65°C水浴中孵育半小时。
3、依次加入1毫升试剂B、0.4毫升试剂C、1瓶4毫升的提取剂，然后振荡混匀。
4、在室温下（20-25°C）以4000r/分钟的速度离心5分钟，取2毫升上层有机相至5毫升的离心管内，在50-60°C水浴中用氮气（或空气吹干仪）吹干。
5、取1毫升净化剂溶解干燥物，再加入0.5毫升试剂D振荡混匀，在室温下（20-25°C）以4000r/分钟的速度离心2分钟，最后待检。
6、若使用全血标本进行检测，标本的移动速度可能较慢，必要时可在加样1分钟后，向加样孔内滴入1滴PBS作辅助液，以促进标本移动。
二、鸡新城疫的症状表现1、急性型（1）病鸡呼吸困难，会发出“咕噜”的特殊怪声。
（2）病鸡的嘴、鼻中有大量黏液，产蛋量下降。
（3）病鸡出现下痢，其粪便的颜色为黄白色或绿色，有麻痹和神经症状。
2、最急性型此类症状大多出现在3-4周龄的小鸡身上，发病时通常不会表现出任何症状，但病发后小鸡会快速死亡。
3、亚急性或慢性型病鸡出现跛行、麻痹、痉挛、运动失调、肌肉抽搐等症状，产蛋鸡发病后期产量会有所降低，一般会发生于成年鸡身上。
4、非典型性新城疫病鸡出现咳嗽、呼吸困难的现象，且伴有分泌物、神经症状，若蛋鸡和种鸡发病，则产蛋量一般会急速降低。
新城疫抗体检测
新城疫的抗体检测某些病毒具有凝集某种（些）动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的实验称血球凝集试验，以此来推断被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的血凝可为相应的抗体所抑制，即血球凝集抑制实验（HI），通过血凝与血凝抑制试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。
一目的意义1免疫监测（1）免疫效果评价（2）免疫时机确定2诊断疾病（根据有无抗体或抗体的高低）3流行病学调查二试验仪器与试剂1试验仪器离心机、离心管两支、50ml量筒一个、V型微量反应板、微量加样器（移液器）、塑料吸头（黄色）若干、1ml吸管1支、胶头滴管两支、微量振荡器、电热恒温培养箱、托盘天平。
2试验试剂鸡新城疫抗原、流感H5、H9抗原、1%鸡红细胞、生理盐水、3.8%柠檬酸钠抗凝剂、待检血清。
三方法1病毒的血凝试验1.1 3.8%柠檬酸钠抗凝剂的配制：用托盘天平称取柠檬酸钠3.8克溶于100ml蒸馏水或纯净水中，摇匀使其充分溶解即可，有条件的可121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温后置4℃冰箱中保存备用。
1.2 1%鸡红细胞制备过程：事先用5ml（或10ml）的注射器吸入抗凝剂若干（其量为所需血量的1/5）,从健康公鸡（未经新城疫疫苗注射）的心脏或翅下静脉采取2-4毫升血液,以2000转每分钟，离心5分钟，吸去上清液（注意要将血细胞泥表面的一种薄膜吸净）。
然后用生理盐水（用量为血细胞泥的5-10倍）洗红细胞，离心5分钟，弃去上清液，如此反复洗3-5次，直至上清液透明清亮为止，最后一次要用生理盐水将血细胞泥稀释成1%浓度，然后置4℃冰箱备用（一般可保存3天）。
1.3 红细胞凝集试验（血凝试验）操作方法（见表1）：（1）取一块洁净的96孔V型微量血凝反应板，用微量移液器从第一列第一孔开始依次加入生理盐水，每孔25微升，直至加到第十五孔（第一列12孔，第二列3孔）。
鸡新城疫抗体检测实验报告(一)
鸡新城疫抗体检测实验报告(一)背景介绍•鸡新城疫是一种常见的家禽传染病，严重影响鸡类养殖业。
•抗体检测可以有效判断鸡群是否感染鸡新城疫。
实验目的•确定一种高效准确的鸡新城疫抗体检测方法。
•提供可靠的数据支持，用于预防和控制鸡新城疫的传播。
实验设计•选取多个饲养场的鸡群作为实验对象。
•分为实验组和对照组，实验组注射疫苗，对照组不注射。
•定期进行血液检测，测量抗体水平。
实验步骤1.收集血样。
2.提取血清。
3.使用特定抗体试剂盒进行检测。
4.测量光密度值，判断鸡新城疫抗体水平。
5.记录实验结果。
实验结果•实验组鸡群的抗体水平明显高于对照组。
•实验组的鸡只无明显临床症状，对疫情具有稳定抵抗力。
•对照组鸡群出现多例感染病例，病死率较高。
结论与建议•鸡新城疫抗体检测方法可准确判断鸡群感染情况，为预防和控制疫情提供重要依据。
•注射疫苗可以提高鸡只的免疫力，减少感染风险。
•鼓励养殖场加强抗体检测工作，及时发现病例并采取相应措施。
致所有鸡农：鸡新城疫是一项严重威胁家禽行业的疾病。
本实验通过抗体检测方法，证明了注射疫苗可以提高鸡群的免疫能力，减少感染的风险。
希望您能严格按照抗体检测规程，提高鸡只的免疫力，保障养殖业的稳定发展。
感谢您的关注与支持！注意：本报告仅为实验结果总结，并非具体实验报告。
具体实验细节和数据可根据实际情况进行增删和修改。
实验方法•选取多个饲养场的鸡群作为实验对象。
•将实验组的鸡只注射鸡新城疫疫苗。
•对照组的鸡只不注射疫苗。
•按照一定周期，定期采集血液样本。
数据分析•对实验组和对照组的血液样本进行抗体检测。
•实验组的鸡只抗体水平明显升高，且持续稳定。
•对照组的鸡只抗体水平较低，易受感染。
结果讨论•实验结果证明，注射鸡新城疫疫苗可以有效提高鸡只的免疫力。
•抗体检测是一种可靠的方法，可以快速判断鸡群的感染情况。
•实验结果也表明，饲养场的防疫管理和养殖环境对感染鸡新城疫的影响较大。
结论•鸡新城疫抗体检测方法在预防和控制鸡新城疫方面具有重要意义。
鸡新城疫抗体检测实验报告
鸡新城疫抗体检测实验报告引言本实验旨在对鸡新城疫进行抗体检测，以评估鸡群对该病毒的感染情况。
通过收集血清样本并使用特定检测方法，我们能够确定鸡群中抗体的存在与水平。
这对于制定控制措施、监测疫情以及预防疾病的传播至关重要。
实验设计1. 样本采集我们在鸡群中随机选择了100只鸡进行样本采集，确保样本的代表性。
采集的方法包括抽取少量鸡脉血或者采集鸡羽毛根部进行检测。
2. 抗体检测方法我们采用了酶联免疫吸附试验（ELISA）方法进行抗体检测。
该方法通过将血清样本与鸡新城疫抗原结合，并使用酶标记的二抗检测抗体与其结合，最后通过底物发色反应来检测抗体的存在。
3. 阳性对照与阴性对照为了验证实验结果的准确性，我们使用了阳性对照和阴性对照。
阳性对照为已知感染鸡新城疫的鸡样本，而阴性对照为未感染的鸡样本。
实验结果我们对100个样本进行了抗体检测，并将结果进行统计和分析。
以下是实验结果的详细报告：1. 鸡新城疫抗体检测结果我们将鸡新城疫抗体检测结果分为三类：•强阳性：抗体水平高于阈值的样本。
•弱阳性：抗体水平介于阈值和阴性之间的样本。
•阴性：抗体水平低于阈值的样本。
2. 统计分析经过抗体检测，我们得到了以下统计分析结果：•强阳性样本数：25只鸡•弱阳性样本数：45只鸡•阴性样本数：30只鸡3. 结果解读我们的实验结果表明，在100只鸡样本中，25只鸡的抗体水平高于阈值，可以确认为感染了鸡新城疫。
另外，45只鸡的抗体水平介于阈值和阴性之间，可能存在早期感染的迹象。
剩余的30只鸡样本抗体水平低于阈值，说明它们未感染鸡新城疫。
结论与讨论本次实验通过鸡新城疫抗体检测方法对100只鸡样本进行了检测，并得出了实验结果。
结果表明鸡新城疫在该鸡群中流行的程度较高，25%的样本具有强阳性抗体水平。
我们认为，对鸡新城疫进行抗体检测有助于早期发现感染情况，及时采取控制措施以避免疫情的进一步传播。
此外，对鸡新城疫的抗体检测也可以作为鸡群健康监测的重要指标，帮助决策者制定防控策略和掌握疫情动态。
鸡病常规抗体检测结果分析及运用
3
H5（禽流感）
1、蛋/种鸡群H5抗体正常检测离散范围应为4log2—10log2，鸡群感染后，抗体异常上升，且离散范围大。
2、肉鸡群：因该病感染和死亡涉及非常快，且病变典型，抗体对比意思不大。
4
IB（传支）
1、蛋/种鸡群：IB免疫效果评价（ELISA检测）：免后三周抗体较免前抗体有所上升（500—2000），并且变异系数缩小，说明免疫有效，一般认为免疫抗体阳性率＞80%为免疫成功。从大量的检测结果中发现免后阳性率基本都在100%。鸡群在产蛋期抗体滴度大于10000的鸡群在我们长时间检测中也有发现，鸡群无疾病表现，目前不能说明什么，有待进一步的认识。
2、肉鸡群：以琼脂扩散试验(AGP)方法检测免后三周抗体≥50%为免疫合格。
6
REO（病关）
REO免疫效果评价（ELISA检测）：免后三周抗体较免前抗体均有大幅度上升（5000—15000），并且变异系数缩小，说明免疫有效，一般认为免疫抗体阳性率＞80%为免疫成功。从大量的检测结果中发现免后阳性率基本都在100%。
2、肉鸡群：如在发病后检测MG抗体，在未对其项目进行接种有阳性抗体且变异系数大，提示鸡群可能受外界毒株感染所致。
7
MG（支原体）
1、肉种鸡群：MG免疫效果评价（ELISA检测）：我们种鸡常规MG抗体检测检测分两次，第一次为免前检测，如免前鸡群MG抗体阳性的话，就可以考虑不进行免疫接种，第二次为免后7周，因鸡群免过MG疫苗后21天到49天的血清转化，故在免后7周检测抗体转阳情况，一般正常情况下抗体阳性率应在80%以上。
序号
检测项目
检测结果分析
备注
1
ND（新城疫）
1、蛋/种鸡群：ND抗体在正常检测离散范围应为6log2—12log2，离散范围越小越能说明鸡群免疫应答反应好，如抗体滴度＞13log2，且离散范围大如：6log2—15log2，提示鸡群可能受外界毒株感染所致。
鸡新城疫实验—HA与HI实验
某些病毒（如新城疫病毒，减蛋综合症）能凝集某些动物的红细胞，这种现象 虽非抗原抗体，但利用这一现象可检查样品中是否有病毒存在，测病毒滴度， 病毒红细胞血凝由于能被相应抗体所抑制，因此可以通过病毒的血凝抑制试验 测定抗体的效价。
实验试剂与器材
1、实验器材 小烧杯、电子天平、离心机、离心管、采血针、玻璃棒、微量移液器（50µl）、枪
实验步骤
孔口项 目
1
2
3
4
567
8
稀释液 50 50 50 50 50 50 50 50
病毒液
50
→ 50
→ 50
→ 50
→ 50
→→ 50 50
→ 50
9 10 11 12
50 50 不加 50
→ 50
→50 ，弃 50
50
不加
病毒液 稀释倍
数
1： 1： 1： 24 8
ห้องสมุดไป่ตู้
1： 1： 1： 1： 1： 16 32 64 128 256
实验试剂与器材
3*3 抗体制备 （1）、从鸡翅取血，放入离心管中（2000rmp , 3~5min） （2）、吸取上清，即为抗体（黄色清亮） 3*4 抗原制备 （1）、取新城疫病毒干粉，加生理盐水（灭菌过） （2）、溶解，即为抗原
实验步骤
1、HA实验步骤 （1）、前10孔与第12孔，每孔加50µl生理盐水 （2）、第11孔加50µl病毒液，第12孔不加，前10空依次倍比 （3）、每孔加入50µl红细胞 （4）、放37 ℃恒温箱20min，观察结果
……
1
10
11
12
每孔50µl生理盐水
50µl病 毒液
50µl生 理盐水
鸡新城疫免疫抗体水平评价试验
入） 。振荡 混匀 ， 在室 温 ２ ０ ～ ２ ５ 。 【 ＝ 下静 置 ４ ０分钟 后 ， 观
②疫苗 重组新城疫灭活疫苗。 ③ 试剂 新 城疫 血凝 抑制 试 验抗 原 ，新 城疫 血
凝 抑 制试 验 阳性血 清 ， １ ％鸡 红 细胞悬 液 ， 阿 氏液 ， ｐ Ｈ
察结 果 。 如果 环境 温度太 低或 者太 高 ， 可置 ２ ５ ℃温箱
数 作 为终点 ，终 点稀 释倍 数 除 以 ４即为 含 ４ Ｈ Ａ Ｕ抗 原稀释 倍数 。所 以 ， ４ Ｈ Ａ Ｕ抗 原稀释倍 数 为 １ ： ６ ４ 。
③血凝抑制（ Ｈ Ｉ ） 试验（ 微量法） 在微量反应板
ｌ ～ ｌ ｌ 孔加入 ０ ． ０ ２ ５毫升 Ｐ Ｂ Ｓ ． 第 １ ２孑 Ｌ 加入 ０ ． ０ ５毫 升 Ｐ Ｂ Ｓ 。 吸取 ０ ． ０ ２ ５毫升被 检血 清加入 第 １ 孑 Ｌ 内， 充分 混 匀后 吸 ０ ． ０ ２ ５毫 升于 第 ２孔 ，依 次倍 比稀 释 至 第
制 ｌ ｘ Ｐ Ｂ Ｓ ：量 取 ４ ０毫 升 ２ ５ ｘ Ｐ Ｂ Ｓ ，加 入 ８ ． ５克氯 化 钠， 加蒸馏水 定容 至 １ ０ ０ ０毫升 。
３ ． 试 验 方 法
性、 败血 性传 染病 。 此 病 的特征是 鸡呼 吸困难 、 下痢 ， 神 经 紊乱 ， 黏膜 和浆 膜 出血 坏 死 ， 精神沉郁 ， 离 群呆
参照 Ｇ Ｂ ／ Ｔ １ ８ ９ ６ ３ — ２ ０ ０ ３ （ 高 致病 性 新城 疫 诊 断技
术》 中 的血凝 （ ＨＡ） 和血 凝抑 制 （ Ｈ Ｉ ） 试 验进 行 。
４ ． 血凝 试验 （ ＨＡ） （ 微 量 法） 测 定
死。 嗉囔 内有 充满 臭味 的稀 薄液 体和 气体 ， 腺 胃黏膜
新城疫病毒的鸡胚培养与病毒滴度检测
5. 封孔
• 用熔好的石蜡或消毒胶布封闭注射孔。 用熔好的石蜡或消毒胶布封闭注射孔。
6. 孵育与观察
• 气室朝上于37℃温箱中孵育； 气室朝上于37℃温箱中孵育； • 以后每天检卵1~2次。 以后每天检卵1~2次 • 弃去24h内的死亡鸡胚： 弃去24h内的死亡鸡胚： 内的死亡鸡胚 – 机械损伤、细菌或霉菌污染等引起。 机械损伤、细菌或霉菌污染等引起。
8. 新城疫病毒滴度的检测 血凝试验（HA） 血凝试验（HA）
• 凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数,称为该病毒的 凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数, 血凝滴度。 血凝滴度。
六、思考题
1. 鸡胚接种过程中，应该注意的问题？ 鸡胚接种过程中，应该注意的问题？ 2. 接种病毒后，24h内鸡胚死亡原因？ 内鸡胚死亡原因？ 接种病毒后，24h内鸡胚死亡原因 3. 如何判断新城疫病毒的血凝滴度？ 如何判断新城疫病毒的血凝滴度？ 4. 临床上还有哪些病毒具有血凝性？ 临床上还有哪些病毒具有血凝性？
7. 病毒的收获与鸡胚的观察
① 收集24h后死亡鸡胚，置4℃冰箱过夜，以免收获时流血; 收集24h后死亡鸡胚 后死亡鸡胚， 冰箱过夜，以免收获时流血; ② 取出冷却的鸡胚，消毒气室端卵壳表面； 取出冷却的鸡胚，消毒气室端卵壳表面； ③ 用镊子击破气室部卵壳并去除壳膜，撕破绒毛尿囊膜； 用镊子击破气室部卵壳并去除壳膜，撕破绒毛尿囊膜； ④ 以眼科镊镊住绒毛尿囊膜，用吸管吸取 以眼科镊镊住绒毛尿囊膜， 尿囊液，置无菌容器中保存备用。 尿囊液，置无菌容器中保存备用。 一般能尿囊液6 10mL。 一般能尿囊液6-10mL。 ⑤ 取出鸡胚胎，于平皿内观察胚胎有无病 取出鸡胚胎， 理变化，如出血、蜷缩、侏儒胚等。 理变化，如出血、蜷缩、侏儒胚等。
鸡新城疫抗体水平检测
实验内容
血凝与血凝抑制试验原理
• 某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)具有血凝素，能够与动 物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象(HA)。这种红细胞 凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞 凝集抑制试验(HI)。
实验器材
禽用采血器、托盘天平、离心管、移液枪、离心机、微型 振荡器、96孔v型反应板、生理盐水、鸡新城疫病毒液、待 检血清等
鸡新城疫抗体水平检测
--血凝与血凝抑制实验
主讲人：李明书
由副粘病毒引起的高度接触性传染病。又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟。 主要特征是呼吸困难、便稀、神经紊乱、粘膜和浆膜出血。死亡率 高，珠鸡、火鸡、雉、孔雀也能感染。鸭、鹅对本病有抵抗力。
血凝与血凝抑制试验
• 通过已知病毒，检查待检血清中是否含有相应的抗体及抗体效价， 监测疫后鸡群抗体水平的动态变化，评价疫苗免疫效果。
鸡新城疫病毒血凝试验判读
新城疫病毒血凝抑制试验判读
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鸡新城疫抗体滴度的检测
（红血球凝集抑制法）
1 红细胞血凝与血凝抑制的原理
红细胞凝集的实质是红细胞膜上的特异性抗原(凝集原，agglutinogen)和相应抗体(凝集素，agglutinin)发生抗原抗体反应。
当病毒的悬液中先加入特异性抗原，且这种抗原的量足以封闭病毒颗粒或其凝集素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其凝集素直接接触，这是红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制，也称为血凝抑制反应。
新城疫病毒属于副黏病毒属，是最主要的红细胞凝集性病毒，具有神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)，可使红细胞凝集。
2 实验材料
鸡新城疫抗原(NDV，南京天邦生物科技有限公司)；生理盐水；肝素钠；96 孔V 型微量血凝板；微量移液枪
3 红细胞凝集
3.1 1%鸡红细胞悬液的制备
取无免疫过的成年公鸡，翅静脉采血10~15 mL，肝素抗凝，2000 r/min 离心10 min，弃上清，注意要将血细胞泥表面的一层薄膜洗净。
然后用血细胞泥5~10 倍的PBS洗涤，2000 r/min 离心10 min，弃上清，如此反复洗涤 3 次至上清液透明，弃上清液后得到红细胞泥。
再用PBS配成1%鸡红细胞悬液（红细胞泥：PBS=1ml:100ml）。
4℃保存，不超过5d。
3.2 红细胞凝集(4 单位抗原的滴定)
在96 孔微量血凝板上，从左到右每空各加50 μL 生理盐水，另加一排作为重复。
再向每排的第 1 孔加入50 μL 新城疫抗原，依次向后倍比稀释直至第11 孔，第12 孔作为对照，无抗原液。
然后向每孔加入1%鸡红细胞悬液50 μL，将微量板振荡混匀20~30 次（于微型振荡器上震荡1 m in），置于37℃温箱感作30 min 后每5 min 观察一次，待对照孔红细胞已经沉淀时观察结果。
结果观察：将反应板倾斜45 度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动着为沉淀，表明红细胞未被凝集或不完全被病毒凝集；如果红细胞铺平孔底，凝集成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，表明红细胞被病毒所凝集。
以100%凝集的抗原最大稀释孔位该抗原的血凝价，即1 个凝集单位；从该孔向前移2 孔的抗原稀释度作为4 单位抗原的稀释度。
抗原应稀释的倍数=血凝滴度÷4 (若血凝价为26，病毒抗原应稀释倍数为24（16），即16ml生理盐水+1ml抗原即为4个单位血凝单位的病毒抗原)。
4 红细胞凝集抑制
在96 孔微量血凝板上，从左到右每孔中各加50 μL 生理盐水，再向每排的第 1 孔加入50 μL 待测血清，依次向后倍比稀释直到第10 孔，然后向每孔加入50 μL 4 单位抗原，振荡混匀20~30 次，置于37℃温箱感作20 min。
取出再向每孔中加入1%鸡红细胞悬液50 μL，振荡混匀20~30 次，置于37℃温箱感作20 min 后每5 min 观察一次。
结果判定：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度，用被检血清最大稀释度的倒数或以 2 为底的对数(log2)表示，如某份血清的最高血凝抑制稀释度为1:128，则该血清的HI 抗体滴度为128 或7(log2)。
当鸡的血清HI 抗体滴度超过1000 时，可判定为新城疫感染。