第五章-基因的重组与转移
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第五章细菌基因重组及遗传分析
第一节 转化（Transformation）
转化：是指受体细胞在特定生理条件下吸收外源DNA分子或 片段，并能表达外源DNA性状的过程。转化现象的发现和转 化因子的证实对促进现代分子生物学的诞生和发展产生了巨 大的推动作用。 转化是导致细菌基因重组的主要途径之一，转化现象在自然 环境中普遍存在于许多细菌中，包括一些革兰氏阳性菌和阴 性菌，只是转化频率很低。
转化的两个例子： ①.用两个带有不同抗性的肺炎双球菌群体混合, 可以发现带有双抗性的细菌。 细菌裂解 DNA残留 其它细菌摄取转化
②.枯草杆菌活细胞表面分泌DNA，可被其它细 胞摄取。
通过化学和非常规培养等方法处理受体细胞，不仅可以提高 转化频率，也可使遗传转化发生在自然条件难以转化或不能 转化的微生物中。 在实验室条件下，通常用CaCl2 、cAMP、低温培养、PEG 介导及电脉冲等方法转化细菌或其它微生物。细菌转化的过 程大体可分为三个阶段： 感受态的出现 DNA的吸附和进入 DNA的整合
如果a和b是连锁的，当DNA浓度降低时，ab共转化频率 的下降和a或b的转化频率的下降相同。假如a和b不连锁， ab共转化频率的下降将远远超过a或b的转化频率。
因为在较低浓度范围内，转化频率和转化DNA的浓度成 正比关系，如果两个基因在同一DNA分子上，那么浓度降 低10倍时，两个基因同时转化的概率也将减少10倍。 如果两个基因不在同一DNA分子上，DNA浓度下降时， 两个基因同时转化的概率将减少100倍，而不是10倍。
例外---流感嗜血菌（G-）
转化小体
转化的双链DNA （30-50kb）结 合到膜受体上
双链DNA被转 化小体摄取
然而，不同的细菌摄取DNA 的方式也不尽相同。在流感 嗜血菌中，其感受态细胞形成 一种结合双链DNA的膜结构， 称为转化小体 （transformasome）。该 小体吸附DNA后，与细胞的 内外膜相融合而转入细胞内 侧。进入细胞质前，再将双 链变成单链DNA。
第五章 重组和转座
• 整合反应由λ噬菌体int基因的产物整合酶
（integrase, Int）催化。Int是一种DNA结 合蛋白，对POP ’ 序列有强的亲和力。 • 整合反应还需要一种有大肠杆菌编码的一 种细菌蛋白，称为整合宿主因子IHF (integration host factor, IHF) 。 • Int和IHF可以在体外进行位点特异性重组。
单链侵入模型：异源双链首先只在两个DNA分子中的一个形成。 Holliday中间体形成以后通过支链迁移能够在另一个DNA分子上产 生异源双链，这样就解释了异源双链是如何形成的。
双链断裂模型
二、异源双链和基因转换：
• 同源性重组时，在两个DNA分子之间互补碱
基配对的区域称为异源双链区 （heteroduplex region）。 • 由于异源双链区存在不配对碱基，两条链 就会在不配对部位发生错配。修复与否， 可以通过子囊菌减数分裂时孢子的分离情 况加以判断。
•
Insertion sequences have inverted terminal repeats and generate direct repeats of flanking DNA at the target site. In this example, the target is a 5 bp sequence. The ends of the IS consist of inverted repeats of 9 bp, where the numbers 1 through 9 indicate a sequence of base pairs.
3.Tn A家族:
• TnA是复制型转座的转座子，长约5kb左右 。 • 两端具有末端反向重复序列（而不是IS），长约38bp左右， •
高中生物课件-基因突变和基因重组
4、基因突变的结果 使一个基因成为它的等位基因（产生了新
的基因）
注意：
1、基因突变产生了新基因，新基因与原 基因互为等位基因；
2、基因突变不改变基因数量
讨论：有人说，基因突变就是指生物体基 因型的改变。你认为这种说法正确吗？试举例 说明。
这种说法不正确。基因突变是指DNA分 子中发生碱基对的增添、缺失或改变而引起 的基因分子结构的改变。基因突变使一个基 因突变成它的等位基因，从而会使生物的基 因型发生改变。但是基因型的改变并不都是 由基因突变引起的，基因重组和染色体变异 都可引起基因型改变。
A.有丝分裂间期 ——体细胞 （但一般不能传给后代，也可以通过无性 繁殖方式传给后代）
B.减数第一次分裂间期 ——生殖细胞 （可以通过受精作用直接传给后代）
注意： 基因突变容易发生在具有DNA 复制功能的细胞中（具有分裂 能力的细胞），已高度分化的、 失去分裂能力的细胞因其不发 生DNA复制，故不容易发生基 因突变。
胞内的不同DNA分子上、同一
DNA分子的不同部位。
不定向性：基因A可以突变为a1，也可以突变为
a2、a3、a4……等。基因突变也是可逆的，可以由 A突变为a，也可以由a突变为A。
基因突变的特点
①普遍性 ②低频性 ③多数有害性 ④随机性 ⑤不定向性
6、基因突变的意义
⑴是生物变异的根本来源； ⑵为生物的进化提供了原始材料； ⑶是形成生物多样性的重要原因之一（新基因产
不一定。
(1)有些基因突变并不引起生物性状的改变 ①突变发生在非编码区和内含子中 ，不会改变生物的性状。 ②显性纯合子中的一个基因突变后，该基因型控制的生物性状不 会改变。 ③由于可由多种密码子决定同一种氨基酸，因此某些基因突变也 不会引起生物性状的改变。
第五章基因突变和基因重组知识清单-高一下学期生物人教版(2019)必修2
第五章 基因突变和基因重组一、可遗传的变异（由遗传物质的变化引起）的，包括基因突变、基因重组、染色体变异。
二、基因突变（在光学显微镜下无法直接观察）1．概念：DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或替换等变化，而引起基因结构的改变。
2．原因：外因：①物理因素：X射线、激光等；②化学因素：亚硝酸盐，碱基类似物等；③生物因素：病毒、细菌等。
内因：DNA分子复制偶尔出现差错。
3．特点：（1）低频性（2）普遍性：一切生物都可以发生。
（3）不定向性：一个基因可以向不同的方向发生突变，产生一个以上的等位基因。
A→a1,a2,a3…（4）随机性：可以发生在生物个体发育的任何时期、可以发生在细胞内不同DNA分子上和同一DNA分子的不同部位。
（5）多害少利性4.结果：产生新基因（等位基因）;变异后性状不一定发生改变，如AA突变成Aa。
5.时间：细胞分裂间期（DNA复制时期）主要发生在有丝分裂前的间期或减数第一次分裂前的间期。
6.突变类型：AA→Aa(隐性突变)；aa→Aa（显性突变）。
A、a的根本区别是基因中碱基排列顺序的不同。
7.举例：镰状细胞贫血。
——诱变育种①方法：用射线、激光、化学药品等处理生物。
②原理：基因突变③实例：高产青霉菌株的获得，太空高产辣椒：①是生物变异的根本来源；②为生物的进化提供了原始材料；③是形成生物多样性的重要原因之一。
10.对于动物：基因突变只有发生在生殖细胞才能遗传给后代，发生在体细胞如肝细胞不能遗传给后代。
11.基因结构中碱基对的替换、增添、缺失对氨基酸序列的影响大小①突变部位：基因突变发生在基因的非编码区。
②密码子简并性：若基因突变发生后，引起了mRNA上的密码子改变，但由于一种氨基酸可对应多种密码子，若新产生的密码子与原密码子对应的是同一种氨基酸，此时突变基因控制的性状不改变。
③隐性突变：若基因突变为隐性突变，如AA中其中一个A→a，此时性状也不改变14、细胞癌变的原因：与细胞癌变相关的原癌基因和抑癌基因都发生了突变。
基因工程原理-第5章重组基因导入受体细胞
转化率＝
转化子 DNA分子数
＝
Ca2+诱导大肠杆菌转化法
① 低温下使磷质层形成液晶结构， Ca2+： 使膜间核酸酶分离 ② 与DNA结合，抗DNase
（1）感受态的制备
对数生长后期的菌体 5x107个/毫升
冰浴10分钟
含CaCl2缓冲液 15分钟 含CaCl2缓 冲液
（3）筛选转化子。
（2）DNA分子转化感受态细胞
菌间接合转移的有关基因
tra。
（Vir 区）
（Con区）
出毒性。占Ti质粒 1/3。
Ori区 ——复制起始区。
外源基因
Ti质粒载体
限制性酶 切开
（1）叶盘法转化植物细胞
（2）整体植株接种转化法
人为地在整体植株上造
成创伤部位，然后把农杆菌
接种在创伤表面，使农杆菌 按照天然的感染过程在植株
体内进行侵染。获得转化的
CHO，猴肾细胞等
• 受体动物：鼠、牛、羊、鱼等
第二节 重组基因导入受体细胞
一、重组基因导入原核受体细胞
接受DNA片段
（一）转化
1928年英国学者F·Griffth在肺炎双球菌中发现的，证
明了遗传的物质基础是DNA。
转化（transformation）——重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受 体细胞稳定维持和表达的过程，转化后的受 体菌，称转化子。 转化子 细胞数
（二）植物病毒介导基因转移 DNA病毒20%
植物病毒
RNA病毒80%
花椰菜花叶病毒：双链DNA病毒
（三）化学诱导DNA直接转化 （1）多聚物介导法 聚乙二醇 多聚赖氨酸 多聚鸟苷酸
（2）脂质体介导基因转化
脂质体
（四）物理方法介导DNA直接转化 （1）基因枪转化
人教版高中生物必修二第五章第1节《基因突变和基因重组》优秀课件(共42张PPT)
思考与讨论
GAA 突变 CTT GAA
GTA CAT GUA
_根__本__原因
氨基酸 谷氨酸
缬氨酸 _直__接__原因
蛋白质 正常
异常
病因：镰刀型细胞贫血症是由_______基__因引突起变的一种遗传 病，是由于基因的______结发构生了改变产生的。
（一）基因突变的概念：
DNA分子中发生碱基对的替换 、增添 和缺失 ， 而引起的 基因结构 的改变。
控制不同性状的_基__因__重__新__组__合__，_不__产__生__新基因，可 形成新的__基__因__型__。
发生时期：有__性__生__殖__过__程__中__(_减__数__分裂) 特点：_非__常__普__遍___
精典例题
1、在一个DNA分子中如果插入了一个碱基对，
则
D
A.不能转录
B.不能翻译
13、He who seize the right moment, is the right man.谁把握机遇，谁就心想事成 。21.8.1121.8.1111:32:2511:32:25August 11, 2021
❖
14、谁要是自己还没有发展培养和教 育好， 他就不 能发展 培养和 教育别 人。2021年8月 11日星 期三上 午11时 32分25秒11:32:2521.8.11
2、类型: ①基因自由组合: 非同源染色体上的非等位基因的
自由组合 ②基因互换: 同源染色体上的非姐妹染色体之间
发生局部互换.
基因重组能否产生新的基因？
非同源染色体上的 非等位基因自由组合
b
Ab 和 aB
B
B
AB 和 ab
b
自由组合
同源染色体的非姐妹染色单体 之间的局部交换
高二生物课件：必修二 第五章 第一节 基因突变和基因重组
蛋白质 氨基酸
正常
异常 缬氨酸 GUA
谷氨酸
GAA
mRNA
DNA
CTT
GAA
突变
C AT GTA
[探究] 镰刀型细胞贫血症的根本原因是什么？
DNA
CTT GAA
突变 CAT GTA GUA 缬氨酸
决 mRNA 定
GAA 谷氨酸
根本原因 _____ T 替换 A A T 直接原因 谷氨酸→ 缬氨酸
A T C A C C G G C C T A G T G G C C G G
二、基因突变的定义
DNA分子复制时发生碱基对的替换、 增添和缺失，而引起的基因结构的改变。
碱基对的替换：
由于碱基对的替换，是否一定会引起蛋白质的改变？
碱基对发生替换，蛋白质结 构不一定改变！
碱基对的缺失：
AACAG G T TA
物理：如：X射线、紫外线、激光等
外部因素 （诱变）
化学：如：亚硝酸、碱基类似物等 生物：包括病毒和某些细菌等
内部因素 （自发）
四、基因突变的特点
思考：是否只有有性生殖的生物才会发生 基因突变？进行无性生殖的生物能否发生 基因突变？病毒能否发生基因突变？
①普遍性
白眼果蝇
②随机、不定向
可以发生在个体发育的任何时期，生物体的任何细胞。 发生在细胞内的不同DNA分子上、同一DNA分子的不同 部位。
氨基酸
蛋白质 正常 异常 病因： 镰刀型细胞贫血症是由 DNA分子中碱基对替换
引起的一种遗传病。
[探究] DNA分子中的碱基对有哪几种变化，从 而导致基因结构的改变？
DNA片段
A A T C C G C T T A G G C G
高一生物必修2第五章《基因突变及其他变异》知识点总结
高一生物必修2第五章《基因突变及其他变异》知识点总结第五章基因突变及其他变异第1节基因突变和基因重组1、镰刀型贫血症的缘由：DNA的碱基对发生改变mRNA分子中的碱基发生改变氨基酸转变蛋白质转变性状转变2、基因突变概念：DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构的转变，叫做基因突变时间：细胞分裂的间期缘由：物理因素、化学因素、生物因素特点：a、普遍性 b、随机性：体细胞的突变不能直接传给后代，生殖细胞的则可能。
c、低频性 d、多数有害性 e、不定向性意义：它是新基因产生的途径；是生物变异的根原来源；是生物进化的原始材料。
3、基因重组概念：是指在生物体进行有性生殖的过程中，掌握不同性状的基因的重新组合。
类型：a、非同源染色体上的非等位基因自由组合。
〔减数第一次分裂后期〕b、四分体时期非姐妹染色单体的交叉互换〔四分体时期〕意义：生物变异的来源之一，是形成生物多样性的重要缘由。
第2节染色体变异1、缺失猫叫综合症果蝇的缺刻翅染色体结构的变异增添果蝇的棒状眼染色体变异易位夜来香的变异倒位染色体数目的变异：个别染色体增减；以染色体组的形式成倍增减2、染色体组〔1〕概念：是指细胞中的一组非同源染色体，在形态和功能上各不相同，携带着掌握生物生长发育的全部遗传信息。
例如：雌果蝇的一个卵细胞。
〔2〕特点：不含同源染色体，但含有每对同源染色体中的一条，一个染色体组中含有掌握生物性状的一整套基因。
3、多倍体二倍体或多倍体：由受精卵发育成的个体，体细胞中含几个染色体组就是几倍体；由未受精的生殖细胞〔精子或卵细胞〕发育成的个体均为单倍体〔可能有1个或多个染色体组〕。
特点：形态上加大，物质含量增高〔蛋白质、糖、脂肪含量增高〕，发育迟，牢固率低。
人工诱导多倍体最常用而且最有效的方法是用秋水仙素来处理萌发的种子或幼苗，其作用机理是能抑制纺锤体的形成，导致染色体不能移向细胞两极，染色体完成了复制但不能减半，从而引起细胞内染色体数目加倍。
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两头各有一个粘性末端！
第五章-基因的重组与转移
2. 与T载体直接连接
（1）PCR产物两个3’端一般都有一个A Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双 链的3’端再加上一个多余的核苷酸 （优先加A）。
（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T 利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有 dTTP时，被迫在平端载体上添加T！
CIP处理
5’CCGG-OH HO-GGCCCTAG5’
5‘GATCCCGG-OH HO-GGCC5’
CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5’
接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！ 第五章-基因的重组与转移
BamHI adapter 5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
EcoRI位点
复性
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’
延伸
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 第五章-基因的重组与转移 PCR产物
-3’
模板
3’
3’
模板
引物2 3-’ 互补序列 GCTAGCCGG -5’
BamH I 位点 复性
5’
模板
3’- 互补序列 GCTAGCCGG -5’
延伸
5’
模板
3’-
PCR产物 互补序列 第五章-基因的重组与转移 GCTAGCCGG -5’
带酶切位点的PCR产物
5’- GCAGAATTC PCR产物 CGATCGGCC -3’
3’- CGTCTTAAG PCR产物 GCTAGCCGG -5’
EcoRI位点
BamHI位点
EcoRI BamHI
5’- AATTC PCR产物 C -3’ 3’-G PCR产物 GCTAG -5’
BamHI adapter
5‘p-GATCCCGGGGCC-
-CCGG -GGCCCTAG-P5’
CCGG GGCCCTAG-P5’
接头自我连接
5‘p-GATCCCGGGGCC-
CCGGGATCCCGG-OH GGC第五C章C-基T因A的重G组G与转G移CC-P5’
第五章-基因的重组与转移
③优点： 连上后就能用。
T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但 效率很低，只有粘性末端的1%。
5’ P3’ HO-
-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-
5’ P3’ HO-
-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
第五章-基因的重组与转移
2. 人工加尾形成 “粘性末端”
（1）同聚加尾 法 1972年，斯坦福大学的P. Labban 和P. Kaiser提出。
Blunt-ended DNA
P-
-OH
HO-
-P
CIP处理
5’GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC5’
T4 ligase
缺口
5‘GATCCCGGHO-GGCC
缺口
CCGG-OH -GGCCCTAG5’
虽然有缺口，第五但章-基仍因的然重组能与转移与DNA片断连接。
三、PCR产物的连接
1. 在引物的5’端设计酶切位点 （1）设计原则
1. 两段DNA的连接 依靠粘性末端
第五章-基因的重组与转移
2. DNA片断与载体的连接 依靠粘性末端
第五章-基因的重组与转移
第五章-基因的重组与转移
ligase nick
第五章-基因的重组与转移
二、平齐末端（blunt end）的连接
1. 直接连接
5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易 被连接酶连接。
第五章 基因的重组与转移
外源DNA
载体DNA
重组分子
转化或转导
电穿孔或显微注射
原核细胞 受体细胞 真核细胞
扩增或表达
表达
第五章-基因的重组与转移
第五章-基因的重组与转移
第一节 DNA片段的体外连接
一、粘性末端的连接 DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与 3’-OH连到一起。
第五章-基因的重组与转移
第五章-基因的重组与转移
③优点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2）能给载体连接上Polylinker:
④缺点： 如果插入片段内部也有该酶位点，不能 切下完整的插第入五章-片基因的段重组与转移
（3）DNA接头 (adapter)连接法
1978年康耐尔大学的吴瑞教授发明。 ① adapter
符合载体的多克隆位点； 避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。 （2）带酶切位点的引物的结构
3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。
（5’端多余的3~5bp属保护碱基）
第五章-基因的重组与转移
模板
3’
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’ 引物1
④缺点： 接头与接头会彼此以粘性末端接在一起， 影响与DNA片段的连接。
⑤防止自我连接 先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头， 水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）
第五章-基因的重组与转移
P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5’
5‘p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P
① linker 用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限 制性内切酶识别位点序列的平端双链。
EcoRI linker： GGAATTCC CCTTAAGG
② linker的作用 用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然 后再用酶切，形成一个人工粘性末端。
第五章-基因的重组与转移
第五章-基因的重组与转移
第五章-基因的重组与转移
PCR产物
载体
dNTP A
Taq DNA聚合酶 dTTP
A
T
T
TA TA
第五章-基因的重组与转移
四、DNA体外连接应注意的事项 1. 插入片断与载体的酶切位点互补 相同的粘性末端才能有效地连接。 尽量避免平端连接。
①原理：
DNA末端转移酶能在没有模板的情况下 给DNA的3’-OH端加上 Nhomakorabea氧核苷酸。
②加尾—碱基互补
分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。
第五章-基因的重组与转移
③优点：
能把任何 片段连接 起来
④缺点：
不能把 插入片 段再切 下来。
第五章-基因的重组与转移
非酶切位点
（2）衔接物(linker)连接
一头平末端、另一头粘性末端（某种酶 切位点序列）。 BamHI adapter 5‘p-GATCCCGG-OH3’
GGCC-p5’ ② adapter的作用
用T4DNA连接酶连到DNA分子的两 端，直接成为人工粘性末端。
第五章-基因的重组与转移
P-P
Blunt-ended DNA
5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
第五章-基因的重组与转移
2. 与T载体直接连接
（1）PCR产物两个3’端一般都有一个A Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双 链的3’端再加上一个多余的核苷酸 （优先加A）。
（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T 利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有 dTTP时，被迫在平端载体上添加T！
CIP处理
5’CCGG-OH HO-GGCCCTAG5’
5‘GATCCCGG-OH HO-GGCC5’
CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5’
接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！ 第五章-基因的重组与转移
BamHI adapter 5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
EcoRI位点
复性
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’
延伸
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 第五章-基因的重组与转移 PCR产物
-3’
模板
3’
3’
模板
引物2 3-’ 互补序列 GCTAGCCGG -5’
BamH I 位点 复性
5’
模板
3’- 互补序列 GCTAGCCGG -5’
延伸
5’
模板
3’-
PCR产物 互补序列 第五章-基因的重组与转移 GCTAGCCGG -5’
带酶切位点的PCR产物
5’- GCAGAATTC PCR产物 CGATCGGCC -3’
3’- CGTCTTAAG PCR产物 GCTAGCCGG -5’
EcoRI位点
BamHI位点
EcoRI BamHI
5’- AATTC PCR产物 C -3’ 3’-G PCR产物 GCTAG -5’
BamHI adapter
5‘p-GATCCCGGGGCC-
-CCGG -GGCCCTAG-P5’
CCGG GGCCCTAG-P5’
接头自我连接
5‘p-GATCCCGGGGCC-
CCGGGATCCCGG-OH GGC第五C章C-基T因A的重G组G与转G移CC-P5’
第五章-基因的重组与转移
③优点： 连上后就能用。
T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但 效率很低，只有粘性末端的1%。
5’ P3’ HO-
-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-
5’ P3’ HO-
-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
第五章-基因的重组与转移
2. 人工加尾形成 “粘性末端”
（1）同聚加尾 法 1972年，斯坦福大学的P. Labban 和P. Kaiser提出。
Blunt-ended DNA
P-
-OH
HO-
-P
CIP处理
5’GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC5’
T4 ligase
缺口
5‘GATCCCGGHO-GGCC
缺口
CCGG-OH -GGCCCTAG5’
虽然有缺口，第五但章-基仍因的然重组能与转移与DNA片断连接。
三、PCR产物的连接
1. 在引物的5’端设计酶切位点 （1）设计原则
1. 两段DNA的连接 依靠粘性末端
第五章-基因的重组与转移
2. DNA片断与载体的连接 依靠粘性末端
第五章-基因的重组与转移
第五章-基因的重组与转移
ligase nick
第五章-基因的重组与转移
二、平齐末端（blunt end）的连接
1. 直接连接
5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易 被连接酶连接。
第五章 基因的重组与转移
外源DNA
载体DNA
重组分子
转化或转导
电穿孔或显微注射
原核细胞 受体细胞 真核细胞
扩增或表达
表达
第五章-基因的重组与转移
第五章-基因的重组与转移
第一节 DNA片段的体外连接
一、粘性末端的连接 DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与 3’-OH连到一起。
第五章-基因的重组与转移
第五章-基因的重组与转移
③优点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2）能给载体连接上Polylinker:
④缺点： 如果插入片段内部也有该酶位点，不能 切下完整的插第入五章-片基因的段重组与转移
（3）DNA接头 (adapter)连接法
1978年康耐尔大学的吴瑞教授发明。 ① adapter
符合载体的多克隆位点； 避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。 （2）带酶切位点的引物的结构
3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。
（5’端多余的3~5bp属保护碱基）
第五章-基因的重组与转移
模板
3’
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’ 引物1
④缺点： 接头与接头会彼此以粘性末端接在一起， 影响与DNA片段的连接。
⑤防止自我连接 先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头， 水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）
第五章-基因的重组与转移
P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5’
5‘p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P
① linker 用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限 制性内切酶识别位点序列的平端双链。
EcoRI linker： GGAATTCC CCTTAAGG
② linker的作用 用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然 后再用酶切，形成一个人工粘性末端。
第五章-基因的重组与转移
第五章-基因的重组与转移
第五章-基因的重组与转移
PCR产物
载体
dNTP A
Taq DNA聚合酶 dTTP
A
T
T
TA TA
第五章-基因的重组与转移
四、DNA体外连接应注意的事项 1. 插入片断与载体的酶切位点互补 相同的粘性末端才能有效地连接。 尽量避免平端连接。
①原理：
DNA末端转移酶能在没有模板的情况下 给DNA的3’-OH端加上 Nhomakorabea氧核苷酸。
②加尾—碱基互补
分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。
第五章-基因的重组与转移
③优点：
能把任何 片段连接 起来
④缺点：
不能把 插入片 段再切 下来。
第五章-基因的重组与转移
非酶切位点
（2）衔接物(linker)连接
一头平末端、另一头粘性末端（某种酶 切位点序列）。 BamHI adapter 5‘p-GATCCCGG-OH3’
GGCC-p5’ ② adapter的作用
用T4DNA连接酶连到DNA分子的两 端，直接成为人工粘性末端。
第五章-基因的重组与转移
P-P
Blunt-ended DNA
5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’