5--基因的重组与转移
基因重组和基因工程
5´
3´
5´ 3´
5´3´
5´ 拼 接
重
组
体
3´ 5´
3´ 内切酶
5´
(ruvC)
3´ 5´
5´ 3´
5´ 3´
片 5´ 段 3´ 重 组 体 53´´
3´ 5´
DNA
连接酶
3´ 5´
3´ 5´
二、细菌的基因转移与重组
（一）接合作用
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接 触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移 至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合 作用(conjugation)。
（三）转导作用
当病毒从被感染的（供体）细胞释放出 来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在 供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基 因重组即为转导作用(transduction)。
例 λ噬菌体的生活史
溶菌生长途径 (lysis pathway)
溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)
①两个同源染色体DNA排列整齐
5´
3´
3´
5´
3´
5´
5´
3´
②一个DNA的一条链断裂、并与另一个 DNA对应的链连接，形成Holliday中间体
③通过分支移动产生异源双链DNA
5´
3´
5´
3´
5´ 内切酶 3´
3´ 5´
5´
3´
(recBCD)
3´ 5´
5´
3´
5´
3´
5´ 分支迁移 3´
3´
5´ (recA) 3´
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
切除末端磷酸基
第五章细菌基因重组及遗传分析
第一节 转化（Transformation）
转化：是指受体细胞在特定生理条件下吸收外源DNA分子或 片段，并能表达外源DNA性状的过程。转化现象的发现和转 化因子的证实对促进现代分子生物学的诞生和发展产生了巨 大的推动作用。 转化是导致细菌基因重组的主要途径之一，转化现象在自然 环境中普遍存在于许多细菌中，包括一些革兰氏阳性菌和阴 性菌，只是转化频率很低。
转化的两个例子： ①.用两个带有不同抗性的肺炎双球菌群体混合, 可以发现带有双抗性的细菌。 细菌裂解 DNA残留 其它细菌摄取转化
②.枯草杆菌活细胞表面分泌DNA，可被其它细 胞摄取。
通过化学和非常规培养等方法处理受体细胞，不仅可以提高 转化频率，也可使遗传转化发生在自然条件难以转化或不能 转化的微生物中。 在实验室条件下，通常用CaCl2 、cAMP、低温培养、PEG 介导及电脉冲等方法转化细菌或其它微生物。细菌转化的过 程大体可分为三个阶段： 感受态的出现 DNA的吸附和进入 DNA的整合
如果a和b是连锁的，当DNA浓度降低时，ab共转化频率 的下降和a或b的转化频率的下降相同。假如a和b不连锁， ab共转化频率的下降将远远超过a或b的转化频率。
因为在较低浓度范围内，转化频率和转化DNA的浓度成 正比关系，如果两个基因在同一DNA分子上，那么浓度降 低10倍时，两个基因同时转化的概率也将减少10倍。 如果两个基因不在同一DNA分子上，DNA浓度下降时， 两个基因同时转化的概率将减少100倍，而不是10倍。
例外---流感嗜血菌（G-）
转化小体
转化的双链DNA （30-50kb）结 合到膜受体上
双链DNA被转 化小体摄取
然而，不同的细菌摄取DNA 的方式也不尽相同。在流感 嗜血菌中，其感受态细胞形成 一种结合双链DNA的膜结构， 称为转化小体 （transformasome）。该 小体吸附DNA后，与细胞的 内外膜相融合而转入细胞内 侧。进入细胞质前，再将双 链变成单链DNA。
高中生物第十一节：基因重组与基因转位——基因重组概念
课次：22教学目的：使学生了解重组的四种类型，了解位点特异重组和异常重组的特点，掌握同源重组的机制。
重点：同源重组的机制难点：同源重组的机制复习旧课：提问1人，了解教学效果。
导入新课：第九章遗传重组第一节概述DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组(genetic recombination)。
重组产物为重组体DNA (recombinant DNA) 。
DNA重组对生物进化起着关键的作用。
基因重组是指由于不同DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换和重新组合，形成新的DNA 分子的过程。
重组的类型：（1）同源重组(homologous recombination )：反应涉及到大片段同源DNA序列之间的交换。
其主要特点是需要RecA蛋白的介入。
（2）位点特异性重组（site-specific recombination）：重组发生在特殊位点上，此位点含有短的同源序列，供重组蛋白识别。
（3）转座重组（transposition recombination）：由转座因子产生的特殊的行为。
转座的机制依赖DNA 的交错剪切和复制，但不依赖于同源序列。
（4）异常重组分为两类，末端连接和链滑动。
其特征时重组对中很少或没有序列同源性，所以也称为非同源性重组。
第二节同源重组1 同源重组1.1 同源重组（homologous recombination）:发生在同源DNA序列之间。
1.2 特征-进行同源重组的基本条件：1）在交换区具有相同或相似的序列：涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大；单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号2）双链DNA分子之间互补碱基进行配对3）重组酶4）异源双链区的形成:涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程；存在重组热点。
e.g.：Euk.减数分裂时的染色单体之间的交换；细菌的转化，转导，接合，噬菌体重组同源重组是同源依赖性的，而非序列依赖性。
【优化指导】高中生物 5-1 基因突变和基因重组课时演练 新人教版必修2
【优化指导】高中生物 5-1 基因突变和基因重组课时演练新人教版必修21．关于基因突变的说法中，不．正确的是( )①基因突变是广泛存在的，并且对生物自身大多是有害的②基因突变一定能够改变生物的表现型③人工诱变所引起的基因突变都是有利的④由环境引起的变异是不能够遗传的⑤基因中脱氧核苷酸的种类、数量和排列顺序的改变就是基因突变⑥紫外线照射使人患皮肤癌和人由于晒太阳而使皮肤变黑都属于可遗传变异A．①②③④B．①②⑤⑥C．②③④⑥ D．②③④⑤答案：C2．下列变化属于基因突变的是( )A．玉米子粒播于肥沃土壤，植株穗大粒饱；播于贫瘠土壤，植株穗小粒瘪B．黄色饱满粒与白色凹陷粒玉米杂交，F2中出现黄色凹陷粒与白色饱满粒C．在野外的棕色猕猴中出现了罕见的白色猕猴D．21三体综合征患者第21号染色体比正常人多一条解析：A选项属于不可遗传的变异，而B选项为基因重组，D选项中多了一条染色体，已超出基因的范围，属于染色体变异。
答案：C3．下列关于基因重组的说法不．正确的是( )A．生物体进行有性生殖的过程中控制不同性状的基因的重新组合属于基因重组B．减数分裂四分体时期，由于同源染色体的姐妹染色单体之间的局部交换，可导致基因重组C．减数分裂过程中，随着非同源染色体上的基因自由组合可导致基因重组D．一般情况下，水稻花药内可发生基因重组，而根尖则不能解析：基因重组有两种类型：自由组合型和交叉互换型，其中交叉互换型是指减数分裂四分体时期，位于同源染色体上的等位基因随着非姐妹染色单体的交叉而互换，导致基因重组。
答案：B4．有性生殖生物的后代性状差异，主要来自于基因重组，下列过程中哪些可以发生基因重组( )A．①② B．①③C．②③ D．③解析：基因重组发生在通过减数分裂形成配子的过程中，主要包括两种类型，一种是在四分体时期，位于同源染色体上非姐妹染色单体的交叉互换，一种是在减数第一次分裂后期，位于非同源染色体上非等位基因的自由组合。
5-1基因突变和基因重组
判断下列说吗是否正确：√ 1、 Nhomakorabea因突变在光学显微镜下看不见。
基因突变的诱发因素：
1.物理因素；
2.化学因素；
3.生物因素；
基因突变的特点：
1.普遍性
2.不定向性（随机性、可逆性） 3.突变率低
基因突变的意义： 基因突变是新基因产生的途径，是
生物变异的根本来源，是生物进化的原
始材料。
二、基因重组
阅读课文完成讨论题，并思考下列问题： 1.什么是基因重组？ 2.基因重组的类型有几种？分别发生在什么 时期？ 3.请举出一个已学过的基因重组的例子？ 4.基因重组为什么会导致发生变异？ 5.基因重组有什么意义？ 6.同一种生物具有多样性的原因是什么？
基因重组的类型：
1.发生在有性生殖细胞产生时，减数第1 次分裂后期，非同源染色体的自由组合 而导致非等位基因自由组合。 2.发生在减数第1次分裂的四分体时期， 同源染色体上的非姐妹染色单体之间发 生的交叉互换，导致基因重组。
杂种亲本自交：
P 黄色圆粒 YyRr YR Yr yR yr
×
黄色圆粒 YyRr YR Yr yR yr
2.基因重组：由于基因的新组合而产生 新的基因型，是生物变异的重要来源， 对生物进化也有重要意义。
配子 子代
黄色圆粒 黄色皱粒 绿色圆粒 绿色皱粒 9 ： 3 ： 3 ： 1
基因重组导致产生新的基因型，而 新的基因型就可能产生新的表现型（新 的性状组合）。
基因转移与重组概述
染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就 越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。
Hfr ×F-杂交
3.F′×F-杂交——性导
Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游 离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。
3.性导——F′×F-杂交
初
生
F′
F′×F-与F+×F-的不同点：
F因子为附加体质粒，既可以脱离染色体在细 胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上
（三）接合
F因子的四种细胞形式（掌握）
①F-菌株(“雌性”菌株)：不含F因子，无性菌毛，但可以 通过接合作用接收F因子而变成F+菌株。 ②F+菌株(“雄性”菌株)：F因子独立存在，细胞表面有性
菌毛。 ③Hfr菌株：F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性 菌
溶源转变特点
1. 噬菌体不携带任何供体菌的基因； 2. 噬菌体是完整的，而不是缺陷的； 3. 噬菌体基因的整合到宿主染色体上导致宿 主获得新性状，未通过基因重组而形成的稳 定转导子； 4. 宿主获得新性状具有不稳定性。
（三）接合(conjugation)
通过细胞与细胞的直 接接触而产生的遗传信 息的转移和重组过程。
（一）转化
供体菌
DNA片段
受体菌
转化子（transformant）：转化后的受体
感受态
来自Trp+细胞的DNA
色氨酸缺陷型 没有色氨酸野生型生长
在缺乏色氨 酸培养基上 有菌落产生 （野生型）
自然转化的必要条件
1、建立感受态的受体细胞 感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞。 自然感受态：细胞一定生长阶段的生理特性，受自 身的基因控制（感受态因子）。 人工感受态：通过人为诱导，使细胞具有摄取DNA 的能力，或将DNA导入细胞内。
人教生物必修2课后习题：5-1 基因突变和基因重组
第1节基因突变和基因重组课后·训练提升合格考过关检验1.下图表示正常人和患者的某基因的部分区域比对,这种基因突变是碱基的()A.替换B.增添D.重组,患者该基因的部分区域中,有一对碱基T—A与正常人不同,说明发生了碱基的替换。
2.辐射对人体危害很大,可能会导致基因突变。
下列相关叙述正确的是()A.碱基的替换、增添和缺失都是由辐射引起的B.环境所引发的变异可能为可遗传的变异C.辐射能导致人体的遗传物质发生定向改变,如物理因素、化学因素和生物因素等。
环境所引发的变异,若导致遗传物质发生改变,则为可遗传的变异。
辐射导致的基因突变是不定向的。
基因突变是碱基的增添、缺失或替换,并不会导致某个基因的缺失。
3.下列关于细胞癌变的叙述,错误的是()A.癌细胞膜上糖蛋白减少,因此易分散和转移B.癌变前后,细胞的形态和结构有明显差别C.原癌基因对于正常细胞来说主要是阻止细胞不正常的增殖,细胞表面发生变化,细胞膜上的糖蛋白等物质减少,导致癌细胞容易分散和转移,A项正确。
细胞癌变后,细胞的形态和结构发生显著变化,B项正确。
原癌基因控制细胞正常的生长和繁殖,抑癌基因对于正常细胞来说主要是阻止细胞不正常的增殖,C项错误。
病毒的致癌基因可整合到宿主基因组诱发癌变,D项正确。
4.某二倍体植物基因A1中插入了一个碱基对后形成基因A2,下列分析正确的是()A.利用光学显微镜可观察到A1的长度较A2短B.正常情况下A1和A2可存在于同一个配子中C.该变异可能导致翻译过程提前终止,A项错误。
A1与A2为一对等位基因,应该位于同源染色体上,因此正常情况下是不可能出现在同一个配子中的,B项错误。
该变异为基因突变,可能导致转录形成的mRNA上终止密码子的提前,因此可能导致翻译过程提前终止,C 项正确。
基因突变可以发生在个体发育的任何时期,D项错误。
5.多代均为红眼的果蝇群体中,出现了一只白眼雄果蝇。
让一只红眼雌果蝇与此白眼雄果蝇交配,F2又出现了白眼果蝇。
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
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0.5g质粒 DNA
2°C离 心收集菌 体
On ice 混合
冰冷的水 重悬菌体
电转仪调为 2.5kV,25F 脉冲控制器 200-400
10-100L转化液涂 含抗菌素的平板
37°C中速 震荡60分钟
冰冷的水 重悬菌体
2°C离 心集菌
转化
加入 1mLSOC 培养液
4. 平板培养 基培养细菌
非酶切位点
（2）衔接物(linker)连接
① linker 用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限 制性内切酶识别位点序列的平端双链。
EcoRI linker： GGAATTCC CCTTAAGG
② linker的作用 用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然 后再用酶切，形成一个人工粘性末端。
17
第二节 重组体导入细菌细胞
外源DNA导入细菌的几种方法 （1）转化（transformation) 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 （2）转染（transfection) 大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。 （3）转导（transduction) 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。
外源基因 导入细胞 的方法
连接反应体系中，插入片断比载体多10 倍以上。
（2）用碱性磷酸酶处理载体
载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连 接。但可以与插入片断以单链连接。
载体
5’
3’
插入片断
五、载体和外源DNA插入片段的连接结果
1. 载体自身环化连接（能存活） 2. 载体之间互相连接（能存活） 3. 插入片段互相连接（不能存活） 4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活） 5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活）
T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率 很低，只有粘性末端的1%。 5’端与3’端并 列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。 而且目的DNA再切不下来
5’ P3’ HO-
-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-
5’ P3’ HO-
-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
2. 人工加尾形成 “粘性末端”
cI857
DNA 其它基因
阻遏 蛋白
溶源状态（DNA不转录、不翻译）
32℃
阻遏 蛋白
DNA转录、翻译合成外壳蛋白
44℃—45℃
（4） 互补型噬菌体
在cI857基因突变的噬菌体的基础上， 选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。
噬菌体1 外壳蛋白基因E发生了无义突变，不 能合成头部蛋白，但能合成其它外壳 蛋白（尾部蛋白）。
10-100L转 化液
涂于含抗 菌素的平 板
37℃过夜
二、体外包装的噬菌体的转导
（1）体外包装（in vitro packaging）
把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA 包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。 （2）转导（transduction）
通过受体菌细胞表面的DNA接受器位 点（receptor site)，使带有外源基因的 重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。
（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T 利用Taq DNA聚合酶，当原料中只 有dTTP时，被迫在平端载体上添加 T！
PCR产物
载体
dNTP A
Taq DNA聚合酶 dTTP
A
T
T
TA TA
2. 在引物的5’端设计酶切位点
（1）设计原则 符合载体的多克隆位点；
避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。 （2）带酶切位点的引物的结构
噬菌体2 外壳蛋白基因D发生了无义突变，不 能合成头部的包装识别蛋白，但能合 成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。
(5) 体 外 包装好的重组噬菌体感染受体菌，使 受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每g DNA能形成106噬菌斑）。
第五章 基因的重组与转移
外源DNA 转化或转导
载体DNA 连接 重组分子
电穿孔或显微注射
原核细胞 受体细胞 真核细胞
扩增或表达
表达
第一节 DNA片段的体外连接
一、粘性末端的连接 DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与 3’-OH连到一起。
ligase nick
二、齐平末端（blunt end）的连接 1. 直接连接
（3）cI857基因突变的噬菌体
cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因， 感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保 持溶源性。 但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致 cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、 外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。
但由于该噬菌体的S基因上有一个突变， 所以细菌还不裂解。
要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。 ④储存感受态菌要在-70℃以下 ⑤使用感受态菌时必须迅速融化
融化后一般不能再次冻存使用。
转化率 每gDNA转化成功的细菌克隆数。
转化方法 （1）热休克法（heat shock） 简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。 （2）电转化法 转化效率高（高于109/gDNA）。
BamHI
3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确
（1）DNA定向插入
（2）起始密码
尤其当载体上有ATG起始密码的时 候，更要注意。
EcoRI
EcoRI
ATGGAATTC 载体
ATGCGGAATTCT 插入片断
ATGGAATTC T 重组 但移码突变！
4. 防止载体自身环化连接
（1）提高插入片断的用量
-3’
模板
3’
3’
模板
引物2 3-’ 互补序列 GCTAGCCGG -5’
BamH I 位点 复性
5’
模板
3’- 互补序列 GCTAGCCGG -5’
延伸
5’
模板
3’- PCR产物 互补序列 GCTAGCCGG -5’
带酶切位点的PCR产物
5’- GCAGAATTC PCR产物 CGATCGGCC -3’
18
一、转化（transformation) 感受态大肠杆菌的制备
1. 目的
增加受体菌 细胞膜的通 透性。
2. 菌种
使用丧失了限制体系的大肠杆菌。 如K12系列的大肠杆菌。
3. 制备原理 用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。
4. 制备过程
培养大 肠杆菌
OD600至 0.3-0.4
On ice 510 min
3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。 （5’端多余的3~5bp属保护碱基）
模板
3’
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’ 引物1
EcoRI位点
复性
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’
延伸
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 PCR产物
（1）同聚加尾 法 1972年，斯坦福大学的P. Labban 和P. Kaiser提出。
①原理：
DNA末端转移酶能在没有模板的情况下 给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
②加尾—碱基互补
分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。
③优点：
能把任何 片段连接 起来
④缺点：
不能把 插入片 段再切 下来。
（1）用相同的酶切
EcoRI
EcoRI
EcoRI
（2）用同尾酶切
BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII 都产生GATC4个碱基的粘性末端。
2. DNA插入的方向正确
（1）用双酶切
由于产生的粘性末端不同，只能以 固定方向连接。
EcoRI
BamHI EcoRI
BamHI
EcoRI
③优点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2）能给载体连接上Polylinker:
④缺点： 如果插入片段内部也有该酶位点，不能 切下完整的插入片段
三、PCR产物的连接
1. 与T载体直接连接
（1）PCR产物两个3’端一般都有一个A Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双 链的3’端再加上一个多余的核苷酸 （优先加A）。
3’- CGTCTTAAG PCR产物 GCTAGCCGG -5’
EcoRI位点
BamHI位点
EcoRI BamHI
5’- AATTC PCR产物 C -3’ 3’-G PCR产物 GCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
四、DNA体外连接应注意的事项 1. 插入片断与载体的酶切位点互补
相同的粘性末端才能有效地连接。 尽量避免平端连接。 决不能进行非粘性末端连接。
4℃离心 收集菌
On ice 30 min
4℃离心 收集菌
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
4℃离心 收集菌
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
分装、-70 ℃ 冻存
感受态细胞 （competent cells)
①生长状态 制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。
②必须在冰冷的条件下制备。 ③CaCl2处理
（1）热休克法
10ng载 体DNA
100L感 受态菌
10-100L转化 液涂含抗菌素 的平板
吸附DNA
On ice混 合，静置 10分钟
摄入DNA 42ºC 1分钟
37℃摇1小时
加入1mL LB培养基
（2）电转化法
LB培养受体菌至 OD600=0.5-0.6
冰浴15分钟， 2°C离心集菌
少量冰冷 的水重悬