第六章基因的重组与转移

EcoRI
EcoRI
EcoRI
5‘p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P
CIP处理
5’CCGG-OH HO-GGCCCTAG5’
5‘GATCCCGG-OH HO-GGCC5’
CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5’
接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！
第六章基因的重组与转移
BamHI adapter 5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
Blunt-ended DNA
P-
-OH
HO-
-P
CIP处理
5’GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC5’
T4 ligase
缺口
5‘GATCCCGGHO-GGCC
缺口
CCGG-OH -GGCCCTAG5’
虽然有缺口，Hale Waihona Puke Baidu仍然能与DNA片断连接。
第六章基因的重组与转移
三、PCR产物的连接
1. 在引物的5’端设计酶切位点 （1）设计原则
③优点：
能把任何 片段连接 起来
④缺点：
不能把 插入片 段再切 下来。
第六章基因的重组与转移
非酶切位点
（2）衔接物(linker)连接
① linker 用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限 制性内切酶识别位点序列的平端双链。
EcoRI linker： GGAATTCC CCTTAAGG
② linker的作用 用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然 后再用酶切，形成一个人工粘性末端。
第六章 基因的重组与转移
外源DNA
载体DNA
重组分子
转化或转导
电穿孔或显微注射
原核细胞 受体细胞 真核细胞
扩增或表达
表达
第六章基因的重组与转移
第六章基因的重组与转移
第一节 DNA片段的体外连接
一、粘性末端的连接
（一）同一种酶产生的黏性末端的连接
第六章基因的重组与转移
第六章基因的重组与转移
（二）不同种酶产生的黏性末端的连接
第六章基因的重组与转移
P-P
Blunt-ended DNA
5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
BamHI adapter
5‘p-GATCCCGGGGCC-
-CCGG -GGCCCTAG-P5’
CCGG GGCCCTAG-P5’
接头自我连接
5‘p-GATCCCGGGGCC-
CCGGGATCCCGG-OH GGC第C六C章基T因A的重G组与G转移GCC-P5’
第六章基因的重组与转移
③优点： 连上后就能用。
④缺点： 接头与接头会彼此以粘性末端接在一起， 影响与DNA片段的连接。
⑤防止自我连接 先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头， 水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）
第六章基因的重组与转移
P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5’
延伸
5’
模板
3’- PCR产物 互补序列 GCTAGCCGG -5’ 第六章基因的重组与转移
带酶切位点的PCR产物
5’- GCAGAATTC PCR产物 CGATCGGCC -3’
3’- CGTCTTAAG PCR产物 GCTAGCCGG -5’
EcoRI位点
BamHI位点
EcoRI BamHI
5’- AATTC PCR产物 C -3’ 3’-G PCR产物 GCTAG -5’
EcoRI位点
复性
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’
延伸
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 PCR产物
-3’
第六章基因的重组与转移
模板
3’
3’
模板
引物2 3-’ 互补序列 GCTAGCCGG -5’
BamH I 位点 复性
5’
模板
3’- 互补序列 GCTAGCCGG -5’
第六章基因的重组与转移
PCR产物
载体
dNTP A
Taq DNA聚合酶 dTTP
A
T
T
TA TA
第六章基因的重组与转移
四、DNA体外连接应注意的事项 1. 插入片断与载体的酶切位点互补 相同的粘性末端才能有效地连接。 尽量避免平端连接。 决不能进行非粘性末端连接。
第六章基因的重组与转移
（1）用相同的酶切
符合载体的多克隆位点； 避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。 （2）带酶切位点的引物的结构
3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。 （5’端多余的3~5bp属保护碱基）
第六章基因的重组与转移
模板
3’
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’ 引物1
第六章基因的重组与转移
第六章基因的重组与转移
第六章基因的重组与转移
③优点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2）能给载体连接上Polylinker:
④缺点： 如果插入片段内部也有该酶位点，不能 切下完整的插入片段
第六章基因的重组与转移
（3）DNA接头 (adapter)连接法 1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。 ① adapter 一头平末端、另一头粘性末端（某种酶 切位点序列）。 BamHI adapter 5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’ ② adapter的作用 用T4DNA连接酶连到DNA分子的两 端，直接成为人工粘性末端。
第六章基因的重组与转移
2. 人工加尾形成 “粘性末端” （1）同聚加尾 法 1972年，斯坦福大学的P. Labban 和P. Kaiser提出。 ①原理：
DNA末端转移酶能在没有模板的情况下 给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。 ②加尾—碱基互补
分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。
第六章基因的重组与转移
第六章基因的重组与转移
二、齐平末端（blunt end）的连接
1. 直接连接
5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易 被连接酶连接。
T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但 效率很低，只有粘性末端的1%。
5’ P3’ HO-
-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-
5’ P3’ HO-
-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
两头各有一个粘性末端！
第六章基因的重组与转移
2. 与T载体直接连接
（1）PCR产物两个3’端一般都有一个A Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双 链的3’端再加上一个多余的核苷酸 （优先加A）。
（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T 利用Taq DNA聚合酶，当原料中只 有dTTP时，被迫在平端载体上添加 T！