透射电镜样本制备
透射电镜生物样本制备流程及注意事项
透射电镜生物样本制备流程及注意事项透射电镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM）是一种使用电子束而不是光束进行成像的显微镜。
它可以提供高分辨率的图像，因此被广泛应用于生物样本的观察和研究。
然而，由于其特殊的工作原理和生物样本的复杂性，透射电镜生物样本的制备过程需要注意一些关键的步骤和细节。
下面将逐步介绍透射电镜生物样本制备流程及注意事项。
一、样品固定1.选择合适的固定剂：固定剂的选择应根据所研究的样本类型和要观察的细胞结构而定。
常用的固定剂包括戊二醛（glutaraldehyde）、乙酰化亚胺（acrolein）、纤维蛋白素（formaldehyde）等。
2.采取合适的固定时间和固定温度：固定时间和温度应根据固定剂的要求和样本的特性进行优化。
通常情况下，固定时间为数小时至数天，温度在4℃至25℃之间。
3.注意透射电镜样品的固定深度：样品应保持较小的厚度以便透射电子束的穿透。
二、样品剖解1.剖解细胞膜：通常采用超声波振荡或冷冻断裂等方法来剖解细胞膜。
超声波振荡可用于含有细胞膜的细胞或组织，而冷冻断裂则适用于脆弱细胞和膜脂体系。
2.剖解细胞核：利用离心裂解法可以将细胞核分离出来。
离心裂解可分为机械法和渗透法两种，机械法利用高速离心的作用将细胞核分离，而渗透法则是通过渗透剂将细胞核溶胀并破碎。
三、样品固化1.脱水：样品在固定后需要进行脱水处理，以便在后续的步骤中更好地渗透和浸透。
常用的脱水剂有乙醇、丙酮和乙醚等，脱水过程往往需要进行多次重复。
2.浸透：在脱水后，样品需要在树脂中进行浸透，使其固化为坚硬的样品。
通常采用环氧树脂或比较稳定的丙烯酸树脂来进行浸透。
这一步骤通常需要较长时间，如数小时甚至数天。
3.树脂填充：浸透后的样品需要在模具中进行树脂填充，并在适当的温度下进行固化。
树脂填充的过程需要注意排除气泡和避免过度填充。
四、样品切片1.选择合适的切割工具和方法：样品通常使用切片机和切片刀进行切割。
透射电镜制样流程
透射电镜制样流程透射电镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）制样是指通过一系列的化学和物理方法来制取透射电镜所需的样品。
透射电镜是一种高分辨率的显微镜，可以在纳米尺度下观察材料的原子结构和微观形态。
为了获取高质量的TEM图像，制样过程非常关键。
下面将详细介绍透射电镜制样的流程。
1.样品制备：样品可以是纳米颗粒、薄膜、纤维或生物样品等。
首先，准备适宜的基底材料，如碳膜覆盖的铜网格或碳膜覆盖的铜刀片。
样品通常需要制成非常薄的切片，通常在50到100纳米的厚度范围内。
制备方法包括机械切割、电解石蠟切片、离子切割或电离蚀刻等。
2.固定和固化：对于生物样品，需要先进行固定处理，以保持样品的形态和结构。
常用的固定剂包括戊二醛、酸性醛或重金属盐。
然后，固定的样品需要进一步处理以固化，如用过氧化物、树脂或聚合物进行浸渍，以增加样品的稳定性。
3.切割和悬浮：将固化的样品切割成适当的尺寸和形状。
使用超微切割机、离子切割仪或其他切割工具进行切割。
切割后，样品通常会悬浮在水或有机溶液中，以便进一步处理。
4.脱水和对比染色：脱水是将样品从水中逐渐转移到有机溶剂中的过程。
这种处理可以控制样品的体积，以减少对比染色和观察中的伪影。
脱水通常通过渗透固定液逐渐转移，然后通过有机溶剂（如醋酸乙酯、丙酮或丙二醇）进行交换。
5.嵌入：将样品嵌入到透明的聚合物或树脂中。
嵌入过程中，通常采用逐渐增加浓度的树脂混合物，以确保样品得到完全浸透。
然后，将样品与树脂进行硬化，通常在高温下进行。
6.超薄切片：将固化的样品切割成非常薄的切片。
使用超薄切片机和钻磨刀片进行切割。
切割后的切片应尽快收集并转移到透明的铜网格或铜刀片上。
7.超薄切片处理：超薄切片通常需要进行后继处理以增强对比度和解决其他问题。
这可能包括染色、胶层增强或薄膜剥离等方法。
8.观察：将制备好的样品放入透射电镜中进行观察。
在观察前，样品需要在真空中或过氮气中去除气泡和其他杂质。
透射电镜样本的制备
喷雾法： 将染色液和悬液样品等量混合，用特制的
喷雾器喷到有膜的铜网上，待干后可用于电镜观察。 喷雾法的优点是雾滴较小，分布均匀，不易凝结成块。 但操作较麻烦，溶液混合时易产生沉淀，并且需要耗 费较多的样品和染色液，尤其容易造成病毒扩散，故 此法不常用。
漂浮法 ：先将带有支持膜的铜网在悬液样品的液滴 上漂浮(有支持膜的那面向下)，然后再在负染色液的 液滴上漂浮。在漂浮期间，样品和染色液被吸附在铜 网的支持膜上，漂浮时间与悬滴法相近。
负染
阴性染色，是相对于普通染色（称正染色）而言。首 先由hall在1955年提出。 Hall在病毒研究中用磷钨酸 染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的 "空洞"被清楚地显示出来。在超薄切片的染色中，染 色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现 黑色。而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正 染色。而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高 的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品，结 果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮。 两者之间的反差正好相反，故称为负染色
H2O
90% 丙酮
15min
100% 丙酮
20min 20min
浸透和包埋
通过脱水剂稀释包埋剂，最终让包埋剂逐渐取代脱水剂， 使其渗透到组织细胞中去
以包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的 固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片时的各种力的 作用，有利于超薄切片。
丙酮：包埋剂 2：1 丙酮：包埋剂 1：1 纯包埋剂 包埋
5mL 10mL 20mL 30mL 40mL 50mL
2.495 0.62 1.885 0.085 2.57 0.31 2.12 0.085 2.425 0.925 1.65 0.085
透射电镜样品制备步骤
透射电镜样品制备步骤透射电镜是一种重要的材料表征技术，它利用电子的波动性和微粒性来观察材料的结构和性质。
为了能够使用透射电镜观察样品，首先需要对样品进行制备。
透射电镜样品制备步骤如下：1.选择合适的样品：透射电镜样品可以是固体、液体、薄膜或纳米颗粒等。
根据研究目的和样品性质选择合适的样品。
2.样品预处理：根据样品性质的不同，进行必要的预处理。
例如，对于固体样品，可以选择切割、抛光或电解抛光等方法来得到平滑的表面。
3.样品固定：将样品固定到透射电镜样品架上。
不同的样品有不同的固定方法。
例如，对于固体样品，可以使用导电胶将其固定在样品架上。
4.薄层制备：对于厚度过大的样品，需要将其制备成透明的薄层以便透射电镜观察。
常用的方法有机械研磨、电子束刻蚀或离子束刻蚀等。
5.样品清洁：将样品放入超声波清洗机中进行清洗，以去除可能附着在样品表面的杂质或污染物。
6.特殊处理：如果需要对样品进行特殊处理，例如加热、冷冻处理或受到特定环境气氛的影响等，根据需要进行相应的处理。
7.样品干燥：将样品放入真空或氮气环境中，以确保样品干燥。
避免样品受到水汽的污染。
8.获得薄片：使用切片机将固态样品切割成适当厚度的薄片。
为了获得高质量的薄片，可以选择特殊的切片工具和技术，例如离子束切片或低速钻磨切片。
9.薄片形状整理：使用不同的研磨和抛光方法，将薄片的形状和表面进行调整，以确保样品的平滑度和一致性。
10.网格制备：将薄片粘贴在透射电镜网格上。
网格可以增强样品的稳定性和保护，同时提供用于定位和标识的标记。
11.后续处理：根据研究目的和透射电镜分析的要求，可以对样品进行进一步处理。
例如，可以进行染色、脱膜、溅射或腐蚀等处理。
以上是透射电镜样品制备的一般步骤。
不同样品和研究目的可能会有所不同。
因此，根据具体的研究需求和样品特点，制备过程可以做相应的调整和优化。
透射电镜样品制备方法
透射电镜样品制备方法透射电镜（Transmission Electron Microscopy，简称TEM）是一种高分辨率的显微镜，能够观察到原子尺度的物质结构。
在进行透射电镜观察前，样品的制备是至关重要的一步。
本文将介绍透射电镜样品制备的方法，希望能够帮助大家更好地进行样品制备工作。
首先，样品的制备要求样品具有一定的薄度。
因此，在进行透射电镜观察前，通常需要将样品切割成极薄的切片。
对于生物样品，可以采用超薄切片机进行切割；对于金属、陶瓷等样品，可以采用离子蚀刻或机械打磨的方法制备薄片。
在进行切割或打磨时，需要保持样品表面的平整和光洁，以确保透射电镜观察时获得清晰的图像。
其次，样品的制备还需要考虑到样品的固定和染色。
对于生物样品，固定和染色是非常重要的步骤。
固定可以保持样品的形态和结构不变，而染色则可以使样品在透射电镜下更易于观察。
常用的固定剂包括乙醛、戊二醛等，而染色剂则根据需要选择不同的染色方法。
另外，样品的制备还需要考虑到样品的支撑。
在进行透射电镜观察时，样品通常需要支撑在一种载体上，以便于放置在透射电镜的样品台上。
常用的载体包括碳膜、网格和硅片等。
在选择载体时，需要考虑到载体的透明性、机械强度和热稳定性等因素。
最后，样品的制备还需要考虑到真空条件。
透射电镜通常在高真空环境下进行观察，因此样品制备时需要保证样品的干燥和密封。
特别是对于生物样品，需要进行脱水和干燥处理，以避免在真空环境下产生气泡或水蒸汽，影响透射电镜观察效果。
总之，透射电镜样品制备是透射电镜观察工作中至关重要的一步。
在进行样品制备时，需要考虑到样品的薄度、固定和染色、支撑和真空条件等因素，以确保最终获得清晰、准确的透射电镜图像。
希望本文介绍的方法能够对大家进行透射电镜样品制备工作有所帮助。
透射电镜制样方法
透射电镜制样方法
透射电镜制样方法主要包括以下步骤：
1. 样品制备：首先需要选择合适的样品，并进行必要的前处理。
根据需要，可以使用传统的金相方法，如切片、打磨和腐蚀等来制备样品；也可以使用更先进的方法，如离子切片、聚焦离子束等来制备样品。
2. 高真空处理：将样品置于高真空环境下进行处理，以去除气体和水分的影响。
这可以通过在真空槽中加热样品、通入惰性气体等方法来实现。
3. 制备薄片：将制备好的样品制备成足够薄的薄片，通常厚度要求在几十纳米至几百纳米之间。
这可以通过使用超薄切片机或聚焦离子束来实现。
4. 电导涂层：为了提高样品的导电性，可以在样品表面涂上金薄层或碳薄层。
这可以通过蒸镀、溅射、离子镀等方法来实现。
5. 透射电镜成像：将制备好的样品放入透射电镜中，调整仪器参数，如加速电压、透镜聚焦等，进行成像。
可以使用像差校正技术、电子衍射等方法来提高成像质量。
需要注意的是，不同样品的制备方法会有一定差异，制备薄片时要注意避免样品的破裂和变形，电导涂层要均匀且致密，成像时要注意样品与探针的相对位置等
细节问题。
此外，透射电镜制样方法还包括一些先进的技术，如原位制备、低温制备、离子减薄等，可以根据需要选择适合的方法进行制备。
透射电镜样品制备流程及注意事项
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透射电镜样品制备
一、样品要求1．粉末样品基本要求（1）单颗粉末尺寸最好小于1μm；（2）无磁性；（3）以无机成分为主，否则会造成电镜严重的污染，高压跳掉，甚至击坏高压枪；2．块状样品基本要求（1）需要电解减薄或离子减薄，获得几十纳米的薄区才能观察；（2）如晶粒尺寸小于1μm，也可用破碎等机械方法制成粉末来观察；（3）无磁性；（4）块状样品制备复杂、耗时长、工序多、需要由有经验的老师指导或制备；样品的制备好坏直接影响到后面电镜的观察和分析。
所以块状样品制备之前，最好与TEM 的老师进行沟通和请教，或交由老师制备。
二、送样品前的准备工作1．目的要明确：（1）做什么内容（如确定纳米棒的生长方向，特定观察分析某个晶面的缺陷，相结构分析，主相与第二相的取向关系，界面晶格匹配等等）；（2）希望能解决什么问题；2．样品通过X-Ray粉末衍射（XRD）测试【粉末衍射标准联合委员会】、并确定结构后，再决定是否做HRTEM；这样即可节省时间，又能在XRD的基础上获得更多的微观结构信息。
3．做HRTEM前，请带上XRD数据及其他实验结果，与HRTEM老师进行必要的沟通，以判断能否达到目的；同时HRTEM老师还会根据您的其他实验数据，向您提供好的建议，这样不但能满足您的要求，甚至使测试内容做得更深，提高论文的档次。
三、粉末样品的制备1．选择高质量的微栅网（直径3mm），这是关系到能否拍摄出高质量高分辨电镜照片的第一步；（注：高质量的微栅网目前本实验室还不能制备，是外购的，价格20元/只；普通碳膜铜网免费提供使用。
）2．用镊子小心取出微栅网，将膜面朝上（在灯光下观察显示有光泽的面，即膜面），轻轻平放在白色滤纸上；3．取适量的粉末和乙醇分别加入小烧杯，进行超声振荡10~30min，过3~5 min 后，用玻璃毛细管吸取粉末和乙醇的均匀混合液，然后滴2~3滴该混合液体到微栅网上（如粉末是黑色，则当微栅网周围的白色滤纸表面变得微黑，此时便适中。
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2.495 0.62 1.885 0.085 2.57 0.31 2.12 0.085 2.425 0.925 1.65 0.085
4.99 9.98 14.97 19.96 24.95 1.24 2.48 3.72 4.96 6.2 3.77 7.54 11.31 15.08 18.85 0.17 0.34 0.51 0.68 0.85 5.14 10.28 15.42 20.56 25.7 0.62 1.24 1.86 2.48 3.1 4.24 8.48 12.72 16.96 21.2 0.17 0.34 0.51 0.68 0.85 4.85 9.7 14.55 19.4 24.25 1.85 3.7 5.55 7.4 9.25 3.3 6.6 9.9 13.2 16.5 0.17 0.34 0.51 0.68 0.85
透射电镜样本制备
超薄切片制样程序
• 取材：处死实验动物后半分钟到1分钟内，最多15分钟取出1mm3的组织块
透射电镜样本制备
• 固定： • 脱水：
透射电镜样本制备
透射电镜样本制备
包埋板
切片
修块 切片
透射电镜样本制备
透射电镜样本制备
透射电镜样本制备
超薄切片机
机械推进式：通过微动螺悬及微动杠杆使标本臂向刀 刃作微小推进。
热胀冷缩式推进：利用机内金属杆在加热或冷却的微 小变化来推进。
透射电镜样本制备
判断切片厚度：利用切片反射的光和从切片下水面反射光 发生干涉，不同厚度切片在显微镜下呈现不同的干涉色， 干涉色与切厚度的关系是：
利用重金属离子对不同细胞结构的结合能力不同，使 各细胞结构对电子产生不同散射程 度以增强反差。
透射电镜样本制备
染色剂
透射电镜样本制备
30min左右
与CO2接触会形成不溶性碳 酸铅沉淀 10min左右
半薄切片制作
可进行定位，克服超薄切片盲目性，提高电镜观察的 效果。
修块时，将切片修得大一些，切成1μm的厚片，甲苯胺 蓝染色观察。
透射电镜样本制备
Epon812 DDSA（十二烷基琥珀酸酐） MNA （甲基内次甲基邻苯二甲酸酐） DMP-30（2,4,6三，二甲氨基甲基苯酚）
固化剂：控制软度 固化剂：控制硬度 加速剂
包埋剂配方
季节配比 包埋液成份
春秋 夏 冬
Epon812 DDSA MNA DMP-30 Epon812 DDSA MNA DMP-30 Epon812 DDSA MNA DMP-30
透射电镜样本制备
透射电镜样本制备
灌注固定
通过血液循环的途径将醛类固定液灌流到所要男友定 的组织中，待组织适度硬化后，切取所需组织。此法 固定迅速而均匀，可同时保存酶的活性和组织超微结 构。
适用于取材柔软组织或难以浸透、死后变化快的组织 和器官，如对中枢神经系统、视网膜和肾脏等组织的 固定。
透射电镜样本制备
脱水
H2O 50% 丙酮
15min
H2O 70% 丙酮
15min
H2O
90%丙酮
15min
100%丙 酮
20min 20min
透射电镜样本制备
浸透和包埋
通过脱水剂稀释包埋剂，最终让包埋剂逐渐取代脱水剂， 使其渗透到组织细胞中去
透射电镜样本制备
以包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的 固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片时的各种力的 作用，有利于超薄切片。
透射电镜样本的制备
透射电镜样本制备
透射电镜样本制备
➢超薄切片制样 ➢负染
超薄切片
由于电子的穿透能力弱，一般的组织细胞的切片，无法在 电镜下获得清晰的图像。阻碍了电子显微镜的发展。
1957年，英国Huxley发明超薄切片机。
透射电镜样本制备
超薄切片制片过程
透射电镜样本制备
透射电镜样本制备
取材
固定
目的：尽可能完整保存细胞在活体状态时的超微结构 细节，避免自身酶的分解而出现自溶，或因外界微生 物的侵入繁殖而产生腐败，致使细胞的超微结构遭受 破坏。同时使细胞内的各种成分固定下来，避免在以 后的冲洗和脱水时溶解和流失。
透射电镜样本制备
固定方法
化学固定：浸泡固定，原位固定，灌注固定 物理固定：冷冻固定，微波固定，临界点干燥固定
透射电镜样本制备
灰色 银白色 金黄色 紫色
40-50nm 50-70nm 70-90nm 90nm以上
分辨率高，反差小
分辨率低，反差好 电子束不易穿过
透射电镜样本制备
Formvar（PVF）溶于纯二氯乙烯制成0.2-0.5%的制膜液
FORMVAR膜制备
染色
组织细胞的成分主要由碳、氢、氧、氮等低原子序数 的元素组成，不能形成足够的反差。
理想固定剂
透射电镜样本制备
常用固定剂
固定方法——戊二醛-锇酸双固定
先用2.5%戊二醛固定2h以上。 缓冲液多次清洗（pH7.4 0.2mol/L磷酸缓冲液洗三次，
15min/次）。 1%锇酸固定2h。
透射电镜样本制备
透射电镜样本制备
清洗
组织在固定后，应用清洗液洗去残留的固定液 残留的醛可与锇酸反应产物细的电子致密的还原锇。 锇酸可与乙醇作用生成沉淀。
清洗液采用与固定液同系列的缓冲液。（磷酸缓冲液， 二甲砷酸钠缓冲液）
脱水 去除样品中的水，为包埋剂的均匀浸透做准备
透射电镜样本制备
Байду номын сангаас
透射电镜样本制备
常用脱水剂
乙醇，与环氧树脂的互溶性差，需用环氧丙烷作为 中间溶剂进行转换。
丙酮
市售的无水丙酮含少量水分，可加入 无水硫酸钠或硫酸铜等干燥剂吸去水分。
丙酮：包埋剂 2：1 丙酮：包埋剂 1：1 纯包埋剂 包埋
37℃1h 37℃1h 37℃1h 37℃过夜，45℃24h，65℃24h
透射电镜样本制备
理想包埋剂
Epon812：环氧树脂包埋剂。淡黄色液体，黏度较低， 易渗入组织，对细胞结构保存好，在配制时需充分搅 拌。聚合后成为具有稳定三维空间结构的固体。
透射电镜样本制备
取材具体方法
将动物麻醉或急性处死，暴露的所需脏器。 用锋利剪刀剪下一小块组织，放到滴有预冷固定液的
蜡片上。 将组织切成细长条，再将其切成小块（1mm3）。 将小块移至装有预冷固定液的清洁小瓶内。 若组织块带有血液而使小瓶内固定液浑浊，应更换新
鲜固定液，然后置于4℃冰箱内固定。