实验六 印记基因v1(1)

实验六印记基因一．实验目的学习印记基因的鉴定方法。

二．实验原理（一）背景知识基因组印记是指组织或细胞中，基因的表达具有亲本选择性的现象，即只有一个亲本的等位基因表达，而另一亲本的等位基因不表达或很少表达，相应的基因则称为印记基因。

只表达父本而不表达母本等位基因的印记基因称为母本印记基因；只表达母本而不表达父本等位基因的印记基因称为父本印记基因。

B830012L14Rik是一个非编码RNA基因，位于12号染色体上的印记基因簇中，目前该基因功能尚不明确。

在该基因的第一外显子序列中存在一个SNP位点，在B6小鼠中该位点为A（AA），在ICR小鼠中则为碱G（GG）。

而B6与ICR小鼠的子代杂交个体中则为AG。

若该基因非印记表达，则在子代个体的cDNA基因型为AG。

而该基因若印记表达，则在子代杂合个体的cDNA基因型为OA或OG。

通过对比父本或母本的基因型，便可判断该印记基因的表达模式。

（二）技术原理：1. PCR聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是一种分子生物学技术，用于体外扩增特定的DNA片段。

PCR技术主要过程是，通过人类合成的一小断单链DNA片段（叫做引物）与模板DNA特定的区域特异性结合，进而以四种dNTP为底物，通过DNA聚合酶沿着引物和模板形成的双链部分的3’端聚合形成DNA片段实现DNA体外扩增的过程。

其中，最重要的是热稳定的DNA聚合酶，由于该酶在97度以上的高温也能保持稳定，所以我们可以通过94～97度这个温度范围内处理DNA形成单链，然后降温（根据引物不同而有差异，一般为50-55度）直至适量的引物结合到模板上。

最后温度提升至72度，聚合酶聚合形成双链DNA。

表1. PCR体系组分及其作用组分作用DNA模板（template）含有需要扩增的DNA片断2个引物（primer）决定了需要扩增的起始和终止位置DNA聚合酶（polymerase）复制需要扩增的区域脱氧核苷三磷酸（dNTP）是指4种脱氧核糖核酸，用于构造新的互补链缓冲体系提供适合聚合酶行使功能的化学环境H2O 为了保持各个组分的浓度，在体系中加水稀释注：部分品牌缓冲液不含有Mg2+，那么还需要添加对应浓度的Mg2+。

酶请最后加入，水请最先加入。

PCR步骤包括DNA变性、退火、延伸三个步骤。

（1）DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

（2）退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

（3）延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

PCR的循环参数（1）预变性（Initial denaturation）模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

（2）循环中的变性步骤循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。

（3）引物退火（Primer annealing）退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。

然后在此次实验基础上做出预估。

退火温度对PCR的特异性有较大影响。

（4）引物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。

但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000 bp以上，含Pfu 及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。

（5）循环数大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。

（6）最后延伸在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

2. DNA纯化DNA在离液序列高的高盐溶液中易于溶解，并能保持其稳定性。

50℃下，溶胶液中的盐溶液溶解含有DNA的琼脂糖凝胶，利用试剂盒中的硅质吸附柱在高盐缓冲系统下，专一吸附DNA分子，而凝胶则过柱弃掉。

吸附DNA的硅质柱经漂洗液漂洗后，再用洗脱缓冲液过柱，将柱上吸附的DNA洗脱下来，即可用于后续实验。

乙醇可以竞争水化DNA的水分子，使得水分子与DNA之间的氢键断裂，DNA相互聚集形成沉淀，促使DNA吸附到硅质吸附柱上。

异丙醇可以代替乙醇，效果更好，所以当回收小片段DNA（≤500bp）时，向溶胶液中加入异丙醇，以提高小片段吸附硅质柱的效率，提高纯化回收效率。

三．实验材料试剂及仪器正交：小鼠C57BL/6J♂×ICR♀杂交子代IBF1的组织DNA、脑组织cDNA及其母本ICR小鼠的组织DNA。

反交：小鼠ICR♂×C57BL/6J♀杂交子代BIF1的组织DNA、脑组织cDNA及其母本C57BL/6J小鼠的组织DNA。

Takara Taq酶，PCR缓冲液，dNTP（deoxy-ribonucleoside triphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸），灭菌的去离子水，无水乙醇，异丙醇，博大泰克胶回收试剂盒，琼脂糖，1×TE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），DL2000。

灭菌1.5ml离心管，灭菌的200ulPCR管，灭菌枪头（白色、黄色、蓝色），微量移液器（10ul，20ul，100ul，1000ul），离心管架，泡沫浮板，PE一次性手套，废物缸，200ml锥形瓶，制胶器。

小型台式离心机，微波炉，水平电泳槽，电泳仪，水浴锅（50℃）等。

四． 实验步骤（一） PCR1. 按照表2比例配制20ul PCR 反应体系于灭菌的200uL PCR 管中。

为减少频繁微量操作带来的误差，可根据实际情况，配制数倍于反应体系的混合工作液（mix ），再进行分装。

配制混合工作液的倍数应略多于实际需要的分装数。

表2. PCR 体系表组分含量（10ul ） H 2O 6ul PCR buffer （PCR 缓冲液）1ul dNTP0.8ul 正向引物0.6ul 反向引物0.6ul DNA 聚合酶：rTaq0.05ul DNA 模板 1ul2. 在PCR 仪上设置PCR 循环参数，待反应完成后，取下PCR 反应管，备用。

94℃ 4min94℃ 30S64℃ 30S72℃ 30S72℃ 5min20℃ ∞（二） PCR 扩增产物DNA 纯化（博大泰克胶回收试剂盒）1. 配制1%琼脂糖凝胶备用。

2. 将60ulPCR 反应液和10ul 6×loading buffer 混匀，用1.0%的琼脂糖凝胶进行分离电泳。

3. 用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA 片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5或2.0ml 离心管中。

尽量切去不包含DNA 片段的凝胶。

一般情况下，电泳的DNA上35cycles样量≥50ul。

4.按1:3的比例（凝胶质量毫克数：溶胶液体积微升数）加入Extraction Buffer。

例如：100mg凝胶应加入300ulExtraction Buffer。

对于每人份试剂量，凝胶质量不能超过400mg。

5.于恒温水浴或金属浴中50℃温育，直到凝胶融化。

一般温育时间为10分钟。

温育过程中每隔2-3分钟混匀一次。

如果温育后，混合液体颜色变紫，请加入10ul 3M KAc（pH5.0），使混合液颜色变回黄色。

6.可选：按1:1的比例（凝胶质量毫克数：异丙醇体积微升数）加入异丙醇，并混合均匀。

如DNA片段大于500bp/小于4kb，不需要加异丙醇。

7.将混合液全部转移到Spin column 内，于6000g离心1分钟，并弃去接液管内液体。

如混合液体积大于750ul，可先转移750ul，其余的液体待离心弃液后，再转移。

8.向Spin column内加500ul Extraction Buffer，于12000g离心30~60秒，并弃去接液管中液体。

9.向Spin column内加750ul Wash Buffer，于12000g离心30-60秒，并弃去接液管内液体。

可重复一次。

如果回收的DNA片段将用于盐浓度敏感的实验，请在加入Wash Buffer后静置2~5分钟，再离心。

10.再次于12000rpm离心2分钟，然后将Spin column转移到无菌的1.5ml离心管中。

如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。

11.向Spin column内加12ul灭菌的去离子水，并于室温静置1分钟。

12.于12000g离心1分钟，微量离心管内溶液中含有目的DNA片段。

回收的DNA可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20℃。

13.2ul上样，用1%琼脂糖凝胶检验胶回收纯化情况，余下的回收DNA存于-20℃待用。

（三）DNA测序纯化回收的DNA片段，经电泳检测无杂带，且浓度较大，则可送交测序公司进行DNA测序。

五．实验结果1.采集PCR产物的电泳检测结果2.采集PCR产物纯化的检测结果。

3.测序结果图六．分析与讨论对测序结果进行分析，鉴定印记基因的表达模式。