微生物学目的与要求

实验十病毒的形态学诊断、培养方法和血清学试验目的

（一）观察病毒包涵体，并掌握其诊断意义。

（二）掌握病毒的形态并了解病毒包膜的获得。

（三）了解病毒培养的三种方法。

（四）掌握病毒学中主要血清学反应的原理

（五）熟悉病毒血凝抑制试验的测定过程

内容

（一）病毒的形态学诊断

1. 病毒的电镜照片（示教）

2. 狂犬病毒包涵体（示教）

3. 麻疹病毒包涵体（示教）

（二）病毒的培养法（录像）

1. 病毒的动物接种法

2. 病毒鸡胚培养法

3. 病毒的组织培养法

（三）血凝抑制试验（操作）

一、病毒的形态学诊断

病毒形态学研究方法可分为两种：一种是应用电子显微镜技术，观察其大小，形态及排列特征，以帮助诊断；另一种是应用光学显微镜通过涂片染色或切片染色，观察包涵体。病毒感染细胞所产生的包涵体，其特征基本是固定的，故对病毒性疾病的诊断具有一定价值。

【方法】

（一）病毒的电镜照片（示教）

观察腺病毒、疱疹病毒的电镜照片，注意其形态结构、大小、排列、及其包膜的形成。

（二）狂犬病病毒内基（Negri）包涵体（示教）

用高倍镜或油镜观察经HE（苏木紫-伊红染色）染色的死于狂犬病的犬脑组织切片，注意包涵体在细胞内的形态、位置及染色性。

（三）麻疹病毒包涵体（示教）

用高倍镜或油镜观察经麻疹病毒培养后，HE染色的人胚或羊膜细胞标本片，注意包涵体在细胞内的位置、形态、染色性以及细胞融合情况。

二、病毒动物接种法

实验动物在病毒学研究中有四方面用途：①分离鉴定病毒，如乙脑病毒；②连续传代通过，以减弱有毒株对人的致病力，如狂犬病病毒；③制备抗血清；④病毒致病机理的研究。

常用的实验动物有小白鼠、地鼠、豚鼠、家兔、绵羊、鸡、猴等。在病毒学研究中，动物接种时为避免动物本身可能带有病毒，多采用实验室自己繁殖的动物。首先根据研究目的选择动物种类，对病毒致病机制的研究，则选择愈接近人类的高等动物（例如灵长类）研究结果愈有价值；其次要注意动物的年龄、性别和接种的途径等各种因素，一般年幼的动物比成年动物对病毒的敏感性高。至于接种的途径应根据病毒的嗜性决定，例如脑炎病毒以脑内注射最敏感。

（一）小白鼠尾静脉接种（录像）

【材料】

1. 动物：小白鼠

2. 病毒悬液

3. 碘酒、酒精、二甲苯、无菌0.25ml注射器、4号针头及小铝匣

【方法】

1. 将小白鼠固定在小铝匣内，露出尾部，用碘酒消毒尾部，然后用酒精棉球连续擦尾部皮肤（必要时用二甲苯擦）使血管扩张。

2. 尾背和左右两侧三根血管皆为静脉，可选一根扩张较好的静脉作接种用。左手拇指捏住尾部的远端，向下弯45°，右手持注射器，于弯处进针静脉，推液0.1毫升。

注意：推注时遇阻力且皮下隆起发白时，表示针头不在血管内应拔出重新进针；如针头在血管内，推注时不感阻力，且可看到血管中血液由于注入液体而后退。

接种后逐日观察动物发病情况。

（二）小白鼠鼻内接种（录像）

【材料】

小白鼠、流感病毒鼠肺适应株病毒悬液、无菌小试管、无菌毛细管、麻醉用乙醚、棉球及小玻瓶。

【方法】

1. 首先将沾有乙醚的棉球放入一清洁小玻瓶内。左手握小瓶，右手抓住小白鼠，将其头部塞入瓶口，进行全身麻醉。注意麻醉深度，不宜太浅或太深，太深时易遭致麻醉死亡或非特异性吸入性肺炎，太浅则易在滴种时打喷嚏。

2. 用无菌毛细吸管吸取病毒悬液少许，连同毛细吸管插在无菌试管中备用。

3. 用左手将小白鼠握在手掌中，大拇指及食指抓住小白鼠耳部使其头部朝前并

呈仰卧位置，另一手取事先吸有病毒悬液的吸管，慢慢滴出一点于滴管口而不使其自然掉落，呈悬滴状。将悬滴靠近动物鼻尖，动物在呼吸时自然吸入，一般为0.03～0.05毫升，不宜过多。

4. 小白鼠慢慢苏醒，在饲养盒中逐日开始发病，发病的症状常为毛耸、咳嗽、不食、甚至死亡。解剖尸体可观察到肺炎或血性病灶。

（三）小白鼠脑内接种（录像）

【材料】

脑炎病毒（小白鼠脑脊髓炎病毒）悬液。脑组织先用无菌生理盐水洗去血液，再加10％脱脂奶盐水研磨成10－1悬液，然后用3000转/分离心沉淀30分钟，吸取上清液供接种用。

小白鼠：3周龄，体重6～8克。

无菌0.25毫升注射器及针头（4号）、煮针锅、碘酊、棉签。

【方法】

1. 以无菌0.25毫升注射器抽取脑炎病毒悬液0.1毫升，去除注射器内的气泡。

2. 取出小白鼠，左手将小白鼠固定，固定时用大拇指和食指捏住小白鼠的头部，左手手掌轻轻按住小白鼠的体部。

3. 右手以棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠颞部皮毛（不碰到眼）。

4. 右手拿注射器在小白鼠颞部（眼与耳根连线的中点略偏耳朵的方向）刺入，进入颅腔，进针2～3毫米，不要插得太深，注射量为0.02～0.03毫升。

5. 注射完毕，将用过得注射器放入煮针锅内煮沸消毒。动物一般在3～4天后开始发病，食欲减退，活动迟钝，毛耸，震颤，慢慢发展为麻痹，瘫痪而死亡。

本法适用于一些脑炎病毒的分离培养。

三、病毒鸡胚培养法

鸡胚培养法常用于痘类病毒、粘病毒和疱疹病毒的分离、鉴定、制备抗原、生产疫苗以及研究病毒性质等。

鸡胚和实验动物一样，为一整体动物，有神经血管的分布及脏器的构造；鸡胚的组织分化程度低，病毒易于繁殖，感染了病毒的膜结构和液体中，含有大量病毒；鸡胚来源充足，操作简单、通常本身是无菌的，对接种的病毒不产生抗体为其优点，但除产生痘疱的病毒及引起鸡胚死亡的病毒外，通常不产生特异性的感染指征，必须利用第二个试验系统来测定病毒的增殖。

常用的鸡胚接种方法有四种，即绒毛尿囊膜上接种法、羊膜腔接种法、尿囊接种法及卵黄囊接种法。根据不同病毒和不同目的采用合适的接种方法。

（一）尿囊腔接种法（录像）

【材料】

副流感病毒10－3稀释液，10～12日龄鸡胚、无菌1毫升注射器及7号针头、电