细胞因子对小鼠造血干细胞基因转移效率影响的实验研究
白介素12论文(医学免疫学)
白介素12的研究新进展第一临床医学院 08中西医临床医学2008013020李玉兰 2008013175魏晓娜摘要：白介素12（IL-12）是近年来发现的一种异源二聚体分子，主要由单核/巨噬细胞及B淋巴细胞对细菌、细菌产物及细胞内寄生物等发生反应而产生，被认为是细胞免疫应答过程中的关键调节因子。
IL-12能激活NK 细胞、T细胞，并诱使其分泌大量IFN-γ，抑制肿瘤血管生成，对多种肿瘤的预防和治疗显示了良好的应用前景。
关键词：白介素12；T细胞；增殖；凋亡；抗肿瘤1、IL-12的发现与命名1989年，一项实验室的证据发现细菌感染或人EB病毒转染的B淋巴母细胞系可在内环境中产生一种因子，它能诱导干扰素-γ（IFN-γ）生成，并激活自然杀伤细胞（NK细胞），促进T细胞和NK细胞的生长。
在分析EBV转染的细胞系所分泌的因子时，NK细胞刺激因子（NKSF）被证实介导了人的T细胞与NK细胞的几种生物活性：诱导生成IFN-γ；增强细胞介导的细胞毒性；对静息T细胞有致有丝分裂作用。
NKSF在佛波酯刺激的EBV转染的RPM-8866细胞系的介导下有血中提纯，它有异源二聚体分子结构。
EBV转染的B细胞系协同白介素-2从大量可的松处理后的T 细胞诱导生成淋巴细胞激活杀伤细胞（LAKC）时，证实存在一种细胞毒性淋巴细胞成熟因子（CLMF）。
提纯并克隆CLMF的编码基因证实NKSF与CLMF是同一种细胞因子，现在统一命名为白介素12.【1】2、IL-12的分子结构IL-12是分子量为70KD（P70）的异源二聚体分子，由分子量分别为40KD（P40）与35KD（P35）的两条糖基链经二硫链连接组成。
P35cDNA序列编码一条219个氨基酸的多肽，其成熟蛋白分子量为27500，包含7个半胱氨基酸残基和3个可能的N 端糖基化位点。
P40cDNA序列编码一条328个氨基酸的多肽，其中N端的残基1-22为疏水信号肽部分，成熟蛋白分子量为34700，包含10个半胱氨基酸残基和4个可能的N端糖基化位点，以及一个理论上的肝素结合位点。
动物胚胎工程的研究现状及在生产中的应用
动物胚胎工程的研究进展及在畜牧业中的应用摘要：动物胚胎工程是用人工方法对动物卵母细胞或胚胎进行改造的技术。
胚胎工程技术研究的目的，是对哺乳动物的胚胎在体外进行人为控制操作，让其继续发育，进而获得优良或珍稀动物个体，并应用这类技术进行基础研究和应用开发性研究。
近年来动物胚胎程技术发展迅速，并逐步在畜牧业中推广运用，显示出良好的应用前景。
关键词：胚胎工程；进展；胚胎移植；动物克隆；胚胎干细胞动物胚胎工程是用人工方法对动物卵母细胞或胚胎进行改造的技术，包含胚胎移植、排卵控制、胚胎冷冻保存、体外受精与显微受精、胚胎分割、胚胎性别鉴定、胚胎冷冻保存、动物克隆和转基因动物等内容[1]。
目前，胚胎工程已在遗传学、医学、发育生物学、动物育种学上得到广泛应用。
将动物胚胎工程技术应用于畜牧业生产，取得了巨大的经济效益与社会效益。
一、动物胚胎工程技术的研究进展1、胚胎移植胚胎移植是胚胎工程的一项极其重要的基本技术，采用任何新技术所产生的胚胎，都必须通过胚胎移植才能得到后代。
科学家首先成功移植了兔胚胎，随后小鼠、大鼠及多种哺乳动物的胚胎移植试验相继获得了成功。
胚胎移植技术已被证实是奶牛繁育的一次重大变革，极大提高了优秀母牛的利用率，有利于产生更多优秀后备母牛和更多优质种公牛。
在现场条件下，奶牛的鲜胚移植妊娠率已达到60%～85%，冻胚移植妊娠率达50%～70%。
胚胎移植已在我国高技术研究和有关学科的基础研究中得到广泛的应用[2]。
2 、排卵控制排卵控制涉及排卵时间控制和排卵数量控制。
控制排卵时间的目的是得到特定发育阶段的卵母细胞，如做微注射转基因使用的原核胚。
排卵数量的控制又称为超数排卵[3]，是为了获得更多的卵子。
目前在控制排卵中常用的激素有FSH、LH、PMSG、HCG和PGF2a及类似物。
在正常情况下，哺乳动物一次排卵数极其有限。
经超数排卵处理，排卵数则可增加数倍至10余倍。
因此，在生产上或科学试验中，通过超数排卵处理可获得大量胚胎[4]。
内皮生长因子和胎盘生长因子对小鼠胎肝造血干细胞髓系分化的作用
造 血作 用 的影 响 。【 果 】 Ｅ Ｆ和 Ｐ Ｆ均可促 进胎 肝造 血 干细胞 髓 系分化 ，集 落数分 别 为对 照组 的 １１ Ｐ＜０ １和 结 ＶＧ １ Ｇ ４％（ ．） ０
１ ３ Ｐ＜００ ） ＰＧ ２ ％（ ． ； １ Ｆ可上调胎肝 造血细胞 ｐＡ ｔ 白表 达 ，其表达水 平为对照组 的 １３ Ｐ＜００ ） Ｖ Ｇ ５ －ｋ 蛋 ４ ％（ ． ： Ｅ Ｆ及其 与 ＰＧ ５ １Ｆ
ＶＥＧＦ ａ ｄ Ｐｌ Ｆ ｎ Ｇ
Ｘ ＡＯ Ｆ ｉ ｈ Ｘ Ｎ Ｗｅ － ｎ， Ｉ Ｇ Ｓ ｕｊ ， Ａ Ｇ Ｒ ｉ ｉｇ， Ｉ ｏ ｇｙｎ Ｎ ａ －ｏ ｇ ， Ｉ ｉ －ｕ Ｉ ｅ— ｅ， Ｉ ｎ ｕ Ｊ ｚ ｊ ＡＮ ｈ －ｎ Ｐ Ｎ ｕ— ｎ Ｌ ｎ － ｇ， Ａ Ｘｉ ｄｎ ＬＵ Ｘ ａ ｇｏ ｉ ｐ Ｙ ｏ ｏ ｎ
（ ．ｅ ａ ｍ ｎ ｏ ａｈｐ ｙｉ ｏｙ Ｚ ｏｇｈ ｎＳ ｈｏ ｏ ｄｃ ｅ ｕ ａ ｓｎＵ ｉ ｒｉ ， ｕ ｎｚｏ ０ ０ ｈｎ ； １ ｐ ｒ ｅ ｔ ｆ ｔｏ ｈ ｓ ｌｇ ， ｈｎ ｓａ ｃｏｌ ｆ Ｄ ｔ Ｐ ｏ Ｍｅｉｉ ，Ｓ ｎＹ ｔ ｅ ｎｖ ｓｙ Ｇ ａｇｈｕ５ ０ ８ ，Ｃ ｉａ ｎ — ｅ ｔ １
摘
要： 目的】 【 观察 Ｖ Ｇ （ Ｅ Ｆ 内皮生长因子） Ｐ Ｆ 胎盘生长因子 ） 和 １ （ Ｇ 对小鼠胎肝造血干细胞髓系分化的影响 ， 并探讨其
调控机制。【 方法 】 体外培养 Ｅ ３ ｌ 胎肝造血细胞 ， 培养造血集落 Ｃ ＵＧ 观察 Ｖ Ｇ 和 Ｐ Ｆ Ｆ —Ｍ， ＥＦ １ 对胎肝造血干细胞髓系分化的 Ｇ
联 合应用对 胎肝造血细胞 ｐＡ ｔ 白表 达水 平无 明显 影响 。Ｌ ２ ４ ０ 抑制胎肝造血 细胞 的增殖 ， － ｋ蛋 Ｙ ９ ０ ２可 并具有 明显的剂量 依赖 关 系 （ ＝０９４ ， ｒ ． ７ Ｐ＜００ ）在 Ｌ ２ ４ ０ 在 的条件 下加 入 Ｖ Ｇ ６ ．１ ， Ｙ ９ ０ ２存 Ｅ Ｆ或 ＰＧ ， Ｃ Ｕ Ｇ １ Ｆ 其 Ｆ — Ｍ产 率与 单独应 用 Ｌ ２ ４ ０ Ｙ ９ ０ ２相 比无
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
看来做小鼠MSC的战友越来越多。
一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
干细胞因子的研究与应用
干细胞因子的研究与应用
叶波平;张玉彬
【期刊名称】《药学进展》
【年(卷),期】2000(024)006
【摘要】干细胞因子（ＳＣＦ）是近１０年来发现的一种重要细胞因子。
它在临
床上可降低放、化疗的毒副作用，还可用于脐带血的培养过程，在今后的器官移植和基因治疗方面起重要作用；另外，利用ＳＣＦ处理造血干／祖细胞，还可以提高逆转录病毒介导的基因转移效率。
本文主要介绍ＳＣＦ及其受体的结构、细胞分布、表达调控和生物学功能，并探讨了ＳＣＦ在临床上的应用潜力。
【总页数】6页(P321-326)
【作者】叶波平;张玉彬
【作者单位】中国药科大学生物制药学院,江苏南京;中国药科大学生物制药学院,江苏南京
【正文语种】中文
【中图分类】R392.11
【相关文献】
1.银屑病患者皮损间充质干细胞分泌表皮生长因子、干细胞因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子水平检测 [J], 刘瑞风;杨元文;赵新程;闫鑫;张开明
2.调节Lnk/干细胞因子-干细胞因子受体通路对糖尿病状态骨髓间充质干细胞成骨功能的影响 [J], 李昊;周海伦;王琪;李伟
3.视黄醇对人脐带间充质干细胞表皮生长因子、干细胞因子、集落刺激因子1和白
血病抑制因子的影响 [J], 卓华丽;白利鹏;刘丹;余树民;李丹婷;刘茜;宋品;曹随忠;沈留红
4.干细胞因子和粒细胞集落刺激因子动员自身骨髓干细胞治疗缺血再灌注肾损伤☆ [J], 毕凌云;郭金岗;张瑞霞;赵静丽;梁斌;赵德安;杨达胜
5.干细胞因子和粒细胞集落刺激因子动员自身骨髓干细胞治疗缺血再灌注肾损伤[J], 毕凌云;郭金岗;张瑞霞;赵静丽;梁斌;赵德安;杨达胜;
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EGCG对小鼠调节性T细胞的产生及细胞因子TGF-β1表达的影响
EGCG对小鼠调节性T细胞的产生及细胞因子TGF-β1表达的影响罗小玲;沈筱芸;利基林【期刊名称】《中国免疫学杂志》【年(卷),期】2011(027)011【摘要】目的:探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对小鼠体内调节性T细胞(Treg)的产生及转化生长因子TGF-β1的表达和分泌的影响.方法:选择健康、雄性、体重相近的BALB/c小鼠40只,随机分为4组(n=10),设立不同剂量浓度的EGCG组(10、50、85 mg/kg)和对照组.EGCG组每天给予EGCG腹腔注射一次,连续注射3天,对照组每天给予等体积生理盐水腹腔注射一次,连续注射3天.采用流式细胞仪检测小鼠脾脏Treg细胞的产生.采用荧光定量PCR和ELISA方法分别检测小鼠脾脏细胞和外周血TGF-β1因子的表达和分泌水平.结果:与对照组相比较,EGCG处理组小鼠体内的Treg细胞的比例上升,TGF-β1的基因表达水平和蛋白分泌水平均明显增高,当EGCG剂量为85 mg/kg时,其促进作用最明显.结论:EGCG可促进小鼠体内的Treg细胞产生,增强TGF-β1表达和分泌.【总页数】4页(P974-977)【作者】罗小玲;沈筱芸;利基林【作者单位】广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部,南宁,530021;广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部,南宁,530021;广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部,南宁,530021【正文语种】中文【中图分类】R392.9【相关文献】1.不同剂量电离辐射对小鼠脾脏调节性T细胞及TGF-β1表达的影响 [J], 孟凡旭;单玉兴;董娟聪;金顺子2.过继性转移TGF-β诱导CD4+ CD25+调节性T细胞对自然流产模型小鼠胚胎丢失率的影响 [J], 邱添;滕银成;徐亮3.中药三叶青及其组方干预荷MFC胃癌小鼠调节性T细胞和相关细胞因子表达的研究 [J], 冯正权;马盼杰;索晨光4.地塞米松对哮喘小鼠CD4+ CD25+调节性T细胞及IL-4 TGF-β水平的影响 [J], 马祥;刘洪;李群英;梁宗安5.西罗莫司促进TGF-β分泌对小鼠调节性T细胞体外增殖的影响 [J], 麦明杰;陈星权;叶秀娟;朱平;郑少忆;刘怀普;黄晶晶;肖泽周;王全兴因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
cxcr2基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞的构建与鉴定
基金项目:国家自然科学基金项目(８１８７１６９７)作者简介:张莉(１９９１－)ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ主要研究重症机制及防治研究ꎮ通信作者:雷迎峰ꎬ副教授ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｙｆｌｅｉ＠ｆｍｍｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎻ侯立朝ꎬ博士生导师ꎬ教授ꎬＥ￣ｍａｉｌ:４５２７８４３６＠ｑｑ.ｃｏｍ 论㊀著ｃｘｃｒ２基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞的构建与鉴定张莉１ꎬ刘永飞２ꎬ叶传涛３ꎬ边培育３ꎬ雷迎峰４ꎬ侯立朝１１.空军军医大学西京医院麻醉与围术期医学科ꎬ陕西西安７１００３２２.空军军医大学唐都医院麻醉科ꎬ陕西西安７１００３８３.空军军医大学唐都医院传染科ꎬ陕西西安７１００３８４.空军军医大学微生物学教研室ꎬ陕西西安７１００３２摘要:目的㊀构建小鼠ＣＸＣ型趋化因子受体２(ＣＸＣＲ２)基因ｃｘｃｒ２过表达的骨髓间充质干细胞(Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓ￣ｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌꎬＢＭＳＣ)并进行鉴定ꎮ方法㊀全骨髓贴壁法分离培养小鼠ＢＭＳＣꎬ采用流式细胞术检测干细胞抗原１(ｓｔｅｍｃｅｌｌａｎｔｉｇｅｎ￣１ꎬＳＣＡ￣１)㊁ＣＤ４４㊁ＣＤ４３㊁ＣＤ４５㊁ＩＡ/ＩＥ表达率ꎬ并诱导成骨分化ꎮ以含有小鼠ｃｘｃｒ２的质粒为模版进行ＰＣＲ扩增ꎬ将获得的ｃｘｃｒ２克隆到慢病毒载体ꎬ命名为ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺꎻ将其与慢病毒包装质粒共转染ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞ꎬ收获慢病毒后ꎬ通过离心法感染ＢＭＳＣꎬ经过１μｇ/ｍＬｚｅｏｃｉｎ压力选择建立了稳定表达ＣＸＣＲ２的小鼠ＢＭＳＣ(ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ)ꎮ采用流式细胞术和ＲＴ￣ＰＣＲ分别检测其ＣＸＣＲ２蛋白和ｍＲＮＡ表达水平ꎬＴｒａｎｓｗｅｌｌ趋化实验检测其迁移能力ꎮ结果㊀９０％以上的第３代ＢＭＳＣ表达ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１ꎬ几乎不表达ＩＡ/ＩＥ㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４５ꎬ且成功诱导成骨分化ꎮ菌液ＰＣＲ㊁质粒双酶切后ꎬ琼脂糖凝胶电泳鉴定结果得到特异㊁大小正确的条带及测序鉴定正确ꎬ表明成功构建了ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ表达质粒ꎮ流式细胞术和ＲＴ￣ＰＣＲ结果显示ꎬＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ的ＣＸＣＲ２蛋白和ｍＲＮＡ表达水平均明显高于对照组ＢＭＳＣꎬ差异有统计学意义(Ｐ<０.００１)ꎮＴｒａｎｓｗｅｌｌ结果显示ꎬＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ迁移能力高于对照组ＢＭＳＣꎬ差异有统计学意义(Ｐ<０.０１)ꎮ结论㊀利用慢病毒系统成功构建了稳定表达ＣＸＣＲ２的ＢＭ￣ＳＣꎬｃｘｃｒ２基因修饰ＢＭＳＣ后可明显增加ＢＭＳＣ的迁移能力ꎮ关键字:ＣＸＣ型趋化因子受体２ꎻ小鼠ꎻ骨髓间充质干细胞ꎻ细胞迁移中图分类号:Ｒ７８文献标志码:Ａ文章编号:１００５￣５６７３(２０１９)０１￣００１９￣０７ＤＯＩ:１０.１３３０９/ｊ.ｃｎｋｉ.ｐｍｉ.２０１９.０１.００４Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｘｃｒ２ｇｅｎｅｉｎｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓＺＨＡＮＧＬｉ∗ꎬＬＩＵＹｏｎｇ￣ｆｅｉꎬＹＥＣｈｕａｎ￣ｔａｏꎬＢｉａｎＰｅｉ￣ｙｕꎬＬＥＩＹｉｎｇ￣ｆｅｎｇꎬＨＯＵＬｉ￣ｃｈａｏ∗ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙꎬＸｉｊｉｎｇＨｏｓｐｉｔａｌꎬＡｉｒＦｏｒｃｅＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＸｉ'ａｎ７１００３２ꎬＳｈａａｎｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅꎬＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ:ＬＥＩＹｉｎｇ￣ｆｅｎｇꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｙｆｌｅｉ＠ｆｍｍｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎻＨＯＵＬｉ￣ｃｈａｏꎬＥ￣ｍａｉｌ:４５２７８４３６＠ｑｑ.ｃｏｍＡｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(ＢＭＳＣ)ｗｉｔｈｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｃｘｃｒ２ｇｅｎｅ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＢＭＳＣｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｗｈｏｌｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｄｈｅｒｅｎｔｍｅｔｈ￣ｏｄꎬａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒａｔｅｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌａｎｔｉｇｅｎ１(ＳＣＡ￣１)ꎬＣＤ４４ꎬＣＤ４３ꎬＣＤ４５ꎬＩＡ/ＩＥｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅ￣ｔｒｙꎬａｎｄｔｈｅｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗａｓｉｎｄｕｃｅｄ.Ｔｈｅｃｘｃｒ２ｃＤＮＡｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄꎬａｎｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｏｆｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｏｕｓｅｃｘｃｒ２ｇｅｎｅｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄꎬａｎｄｎａｍｅｄａｓｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ.ＨＥＫ￣２９３Ｔｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｏ￣ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｐａｃｋａｇｉｎｇｐｌａｓｍｉｄｓａｎｄｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ.ＴｈｅＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆＢＭＳＣｗｉｔｈｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺｖｉｒｕｓ.ＣＸＣＲ２ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄＲＴ￣ＰＣＲ.Ｔｈｅｍｉ￣ｇｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｏｆＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣｗａｓｔｅｓｔｅｄｂｙＴｒａｎｓｗｅｌｌｅｘｐｅｒｉ￣ｍｅｎｔ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀ＣＤ４４ａｎｄＳＣＡ￣１ｗｅｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙｏｖｅｒ９０％ｏｆｔｈｅｔｈｉｒｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＢＭＳＣｃｅｌｌｓꎬｂｕｔＩＡ/ＩＥꎬＣＤ３４ａｎｄＣＤ４５ｈａｒｄｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄꎬａｎｄｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｎｄｕｃｅｄ.ＡｆｔｅｒＰＣＲａｎｄｄｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬｔｈｅａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｂａｎｄｓｗｅｒｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｃｏｒｒｅｃｔ.ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗａｓｉｄｅｎｔｉｃａｌꎬｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺｐｌａｓｍｉｄｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃ￣ｔｅｄ.ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄＲＴ￣ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＣＸＣＲ２ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｍＲＮＡｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌＢＭＳＣ.ＴｈｅｔｒａｎｓｗｅｌｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙｏｆＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣｗａｓａｐｐａｒｅｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌＢＭＳＣ(Ｐ<０.００１).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＴｈｅＢＭＳＣｓｓｔａｂｌｙｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＣＸＣＲ２ｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｓｙｓｔｅｍ.Ｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｘｃｒ２ｃａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉ￣ｔｙｏｆＢＭＳＣ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＣＸＣｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ２(ＣＸＣＲ２)ꎻＭｏｕｓｅꎻＢｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(ＢＭＳＣ)ꎻＣｅｌｌｍｉｇｒａ￣ｔｉｏｎ㊀㊀间充质干细胞(ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌꎬＭＳＣ)是一类具有自我增殖㊁多向分化潜能的成体干细胞[１]ꎮＭＳＣ具有很强的免疫调节功能ꎬ在免疫和炎症性疾病的治疗中具有良好的潜力[２－４]ꎮ鉴于ＭＳＣ移植后归巢靶组织的数量有限㊁产生的治疗性和抗炎分子效力不够强ꎬ最近多项研究对ＭＳＣ进行基因修饰ꎬ从而增加了ＭＳＣ的治疗效能[５－７]ꎮＣＸＣ型趋化因子受体２(ＣＸＣｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ２ꎬＣＸＣＲ２)属于Ｇ蛋白是偶联受体家族ꎬ是趋化因子ＣＸＣＬ１㊁ＣＸＣＬ２㊁ＣＸＣＬ３㊁ＣＸＣＬ５㊁ＣＸＣＬ６㊁ＣＸＣＬ７和ＣＸＣＬ８的配体[８]ꎮ趋化因子在炎症性疾病中广泛表达ꎬ趋化因子与趋化因子受体结合能调节中性粒细胞㊁单核细胞的迁移ꎬ将它们募集到炎症部位发挥相应的作用ꎮ研究通过构建ｃｘｃｒ２基因修饰的ＢＭＳＣꎬ并观察修饰后ＢＭＳＣ到达炎症部位的迁徙能力ꎬ为后续炎症性疾病的ＢＭＳＣ治疗策略奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀细胞与质粒㊀ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞株㊁Ｓｔｂｌ３感受态细胞㊁ｐＣＩ￣ｎｅｏ￣ＣＤ４０Ｌ￣ＧＺ㊁ｐＬｅｎｔｉ￣ＣＤ４０Ｌ￣ＧＺ㊁ｐＣＭＶ３￣ＧＦＰＳｐａｒｋ￣ＣＸＣＲ２载体质粒㊁辅助包装质粒ｐｓＰＡＸ２和ｐＭＤ２.Ｇ均由空军军医大学微生物实验室保存并提供ꎮ１.２㊀实验动物㊀ＳＰＦ级４~６周Ｃ５７ＢＬ/６小鼠４只ꎬ１６~１８ｇꎬ均购自空军军医大学动物实验中心ꎮ１.３㊀主要试剂及仪器㊀ＤＭＥＭ培养基㊁青霉素㊁链霉素均购自ｈｙｃｌｏｎｅ公司ꎻ胎牛血清购自Ｓｉｇｍａ公司ꎻ成骨诱导分化培养基试剂盒购自广州赛业公司ꎻＰＥ标记抗小鼠ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１㊁ＩＡ/Ｅ㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４５抗体均购自ＢＤ公司ꎻＰＥ标记ＣＸＣＲ２抗体购自Ｂｉｏ￣ｌｅｇｅｎｄ公司ꎻ质粒大量提取ＤＮＡ试剂盒购自Ｏｍｅｇａ公司ꎻ先锋ＲＮＡ快速提取试剂盒㊁ＤＮＡ凝胶回收试剂盒㊁质粒小量提取ＤＮＡ试剂盒均购自Ａｘｙｇｅｎ公司ꎻＰｒｉｍｅＳＴＡＲＤＮＡ聚合酶㊁限制性内切酶ＮｈｅＩ㊁ＭｌｕＩ㊁ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ㊁Ｔ４ＤＮＡ连接酶㊁逆转录试剂盒㊁ＴａｋａｒａＳＹＢＲｇｒｅｅｎ试剂盒均购自Ｔａｋａｒａ公司ꎻ转染试剂ＭＡＸ由本室配制ꎻｍＣＸＣＬ２蛋白购自亿翘神州公司ꎮＣＯ２培养箱㊁Ｔ２５细胞培养瓶均购自Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司ꎻＩＸ７１倒置荧光显微镜购自Ｏｌｙｍｐｕｓ公司ꎻ流式细胞仪购自于美国ＢＤ公司ꎻ４ħ离心机购自德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司ꎻ超速离心机购自Ｂｅｃｋｍａｎ公司ꎻＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０ＰＣＲ仪购自罗氏公司ꎮ１.４㊀ＢＭＳＣ的分离、鉴定㊀采用全骨髓贴壁法培养小鼠ＢＭＳＣ[９]ꎮ将小鼠颈椎脱臼法处死ꎬ置于７５％乙醇中浸泡消毒５ｍｉｎꎻ于超净台中剪开皮肤ꎬ剥开肌肉ꎬ分离小鼠双侧股骨ꎬ剪去两端软骨ꎻ用１ｍＬ注射器吸取含１０％血清㊁１％双抗的ＤＭＥＭ培养基反复冲洗骨髓腔ꎬ直至骨髓腔发白ꎻ收集细胞悬液于Ｔ２５培养瓶中ꎮ将其放入３７ħ５％ＣＯ２培养箱中培养ꎬ首次４８ｈ后换液ꎬ以后视细胞状态而定ꎬ约２ｄ换液１次ꎮ传至第３代ꎬ常规消化细胞ꎻ按流式抗体说明书通过流式细胞术检测干细胞表面标志分子ＣＤ４５㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１㊁ＩＡ/ＩＥꎬ并按诱导分化培养基试剂盒说明书诱导ＢＭＳＣ成骨分化ꎬ茜素红染色鉴定ꎮ１.５㊀ｃｘｃｒ２过表达的慢病毒载体构建及慢病毒包装１.５.１㊀ｃｘｃｒ２基因片段的制备㊀根据Ｇｅｎｂａｎｋ中的ｃｘｃｒ２设计引物ꎬ以质粒(ｐＣＭＶ３￣ＧＦＰＳｐａｒｋ￣ＣＸＣＲ２)为模板进行ＰＣＲ扩增ꎮ引物序列如下:Ｆ:ＧＡＣＧＴＣＧＣＴＡＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡ(含ＮｈｅＩ和ＢａｍＨＩ酶切位点)ꎻＲ:ＧＡＣＧＴＣＡＣＧＣＧＴＧＡＧＧＧＴＡＧＴＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＧ(含ＭｌｕＩ酶切位点)ꎮ引物由擎科泽西生物技术公司合成ꎮＰＣＲ反应体系为模板ＤＮＡ２μＬꎬ上㊁下游引物各１.５μＬꎬ５ˑＰｒｉｍｅＳＴＡＲＢｕｆｆｅｒ１０μＬꎬｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ４μＬꎬＰｒｉｍｅＳＴＡＲＤＮＡ聚合酶０.５μＬꎬ加超纯水至５０μＬꎮＰＣＲ反应条件为:９８ħ变性１０ｓꎬ５５ħ退火５ｓꎬ７２ħ延伸７５ｓꎬ３０个循环ꎮＰＣＲ产物进行１.０％琼脂糖凝胶电泳鉴定后ꎬ按照ＤＮＡ凝胶回收试剂盒说明书回收ＤＮＡ片段ꎮ１.５.２㊀重组质粒ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ的构建及鉴定㊀用ＮｈｅＩ和ＭｌｕＩ分别对ｃｘｃｒ２ＰＣＲ产物和ｐＣＩ￣ｎｅｏ￣ＣＤ４０Ｌ￣ＧＺ进行双酶切ꎬ并分别进行胶回收ｃｘｃｒ２基因片段和ｐＣＩ￣ｎｅｏ￣ＧＺꎬ用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接后ꎬ用Ｓｔｂｌ３感受态细菌转化ꎬ涂布含有氨苄抗性的琼脂培养基ꎬ过夜培养后挑出单克隆并接种ꎬ３７ħ培养１２~１６ｈ后ꎬＰＣＲ鉴定得到阳性克隆保存甘油菌ꎬ并收集菌体沉淀ꎬ按质粒小量提取ＤＮＡ试剂盒说明书提取质粒ꎬ命名为ｐＣＩ￣ｎｅｏ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺꎮ之后ꎬ将其与ｐＬｅｎｔｉ￣ＣＤ４０Ｌ￣ＧＺ用ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ酶切ꎬ分别获得目的片段ｃｘｃｒ２￣ＧＺ和ｐＬｅｎｔｉ载体ꎬ连接后将连接产物转化Ｓｔｂｌ３感受态细菌ꎬ操作同前法ꎬ菌液ＰＣＲ鉴定单克隆菌落ꎬ鉴定正确菌落委托擎科泽西生物技术公司进行双向测序ꎬ测序结果于ＮＣＢＩ￣ＢＬＡＳＴ网站(ｈｔｔｐｓ://ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/)进行比对ꎬ序列正确菌落命名为ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺꎮ１.５.３㊀ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ慢病毒的包装㊀将重组质粒ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ１２μｇ与ｐｓＰＡＸ２９μｇ㊁ｐＭＤ２.Ｇ６μｇ混合后ꎬ加入转染试剂(ＭＡＸ溶液)８１μＬꎬ轻柔混匀ꎬ待其形成ＤＮＡ￣脂质体复合物后ꎬ转染ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞ꎮ将细胞放置于３７ħ５％ＣＯ２培养箱孵育４８ｈꎬ收集上清后加入ＤＭＥＭ培养液ꎬ７２ｈ后再次收集上清液ꎬ使用０.４５μｍ滤器过滤细胞碎片ꎬ收集病毒上清液ꎬ２０％蔗糖作为垫子ꎬ以１０００００ˑｇ离心４ｈꎬ超速离心法沉淀浓缩和纯化慢病毒ꎬ收集并分装ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ病毒液ꎬ于－８０ħ保存ꎮ１.６㊀ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ稳定转染ＢＭＳＣ的构建及筛选㊀将第３代的小鼠ＢＭＳＣ铺于６孔板中ꎬ培养至细胞汇合度达到６０％~７０％时ꎬ每孔加入２ｍＬｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ病毒液和ＤＭＥＭ培养基的混合液(按１ʒ１比例)３７ħꎬ１０００ˑｇ离心感染２ｈꎬ弃去病毒液ꎬ加入含有１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基于３７ħ５％ＣＯ２培养箱中继续培养ꎬ４８ｈ后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＧＦＰ)的表达ꎮ然后加入含有１μｇ/ｍＬｚｅｏｃｉｎ的培养液２ｍＬ进行筛选ꎬ每３~４ｄ更换该培养液ꎬ直至不表达绿色荧光的细胞全部死亡ꎮ经过１４~２１ｄ的筛选后ꎬ获得了稳定表达ＣＸ￣ＣＲ２的小鼠ＢＭＳＣ(ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ)ꎬ同时设置未处理的ＢＭＳＣ作为对照组ꎮ１.７㊀稳定转染细胞系鉴定１.７.１㊀流式细胞术检测ＣＸＣＲ２蛋白表达㊀常规消化ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣꎬ加入预冷的缓冲液(ＰＢＳ加入１％胎牛血清)洗涤２次后ꎬ调整细胞浓度为１ˑ１０５个/孔后加入１μＬＰＥ标记ＣＸＣＲ２抗体ꎬ避光冰浴３０ｍｉｎꎻ洗涤２次后ꎬ用２００μＬＰＢＳ重悬ꎬ用流式细胞仪检测ＣＸＣＲ２蛋白的表达ꎮ１.７.２㊀Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ检测ｃｘｃｒ２ｍＲＮＡ的表达㊀按照先锋ＲＮＡ快速提取试剂盒说明书分别提取未感染正常ＢＭＳＣ和ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ的总ＲＮＡꎬ并用微黑子核酸测定仪定量ꎮ取５００ｎｇ总ＲＮＡ用逆转录试剂盒制备ｃＤＮＡꎬ然后按照ＴａｋａｒａＳＹＢＲｇｒｅｅｎ试剂盒说明书用Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０ＰＣＲ仪进行荧光定量ＰＣＲꎮ根据目的基因设计Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ引物ꎬ序列如下:ｃｘｃｒ２:Ｆ:ＡＴＧＣＣＣＴＣＣＴＡＴＴＣＴＧＣＣＡＧＡＴꎻＲ:ＧＴＧＣＴＣＣＧＧＴＴＧＴＡＴＡＡＧＡＴＧＡＣ￣３ꎻβ￣ａｃｔｉｎ:Ｆ:ＴＧＡＣＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧꎻＲ:ＡＡＧＣＴＧＴＡＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＧＴꎮ以β￣ａｃｔｉｎ为内参基因ꎬ检测试验组(ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ)及对照组(ＢＭＳＣ)细胞中上述目的基因ｍＲ￣ＮＡ的相对表达量ꎮＰＣＲ引物由擎科泽西生物技术公司合成ꎮ１.８㊀Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ趋化试验㊀在２４孔Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ的上室中接种ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ或ＢＭＳＣꎬ接种密度为１ˑ１０５个/孔ꎬ下室加入６００μＬ趋化缓冲液或正常缓冲液ꎮ实验分为４组:①小室上室加入培养的ＣＸＣＲ２￣ＢＭ￣ＳＣꎬ下室加入含１００ｎｇ/ｍＬｍＣＸＣＬ２正常培养液ꎬ命名为ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎻ②小室上室加入培养的ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣꎬ下室不加任何刺激物ꎬ命名为ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣正常组ꎻ③小室上室加入培养的ＢＭ￣ＳＣꎬ下室加入含１００ｎｇ/ｍＬｍＣＸＣＬ２正常培养液ꎬ命名为ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎻ④小室上室加入培养的ＢＭＳＣꎬ下室不加任何刺激物ꎬ命名为ＢＭＳＣ￣正常组ꎮ每组均放置于３７ħ㊁５％ＣＯ２培养箱孵育１２ｈ后用棉签擦去上室内细胞ꎬ用４％多聚甲醛固定１５ｍｉｎꎬ倒置风干后用０.１％的结晶紫染色２０ｍｉｎꎬ在显微镜下对上室底部反面的细胞进行计数ꎬ每组设３个复孔ꎬ每孔随机计数５个视野(２００ˑ)下迁移至膜背面的细胞数ꎮ１.９㊀统计学方法㊀应用ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ５和ＳＰＳＳ１７软件进行统计分析ꎮ基因ｍＲＮＡ的相对表达量采用ｔ检验进行比较ꎻ各组迁移的细胞数采用单因素方差分析进行比较ꎬ两两比较采用ＳＮＫ检验ꎬＰ<０.０５为差异有统计学意义ꎮ２㊀结㊀果２.１㊀ＢＭＳＣ分离及鉴定２.１.１㊀小鼠ＢＭＳＣ形态㊀在显微镜下可以看到ꎬ刚分离的骨髓细胞大多悬浮并呈圆形ꎬ２４ｈ后见大量贴壁细胞ꎬ７２ｈ后贴壁细胞大多呈纺锤型㊁梭形和圆形ꎬ大约１２ｄ细胞长满ꎮ随着培养时间和传代次数的增加ꎬ细胞形态逐渐形似呈梭形ꎬ见图１ꎮ㊀注:Ａ.培养３ｄ的细胞形态ꎻＢ.培养１２ｄ的细胞形态ꎮ图１㊀小鼠ＢＭＳＣ形态(２００ˑ)Ｆｉｇ.１㊀Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(２００ˑ)２.１.２㊀ＢＭＳＣ表面标志分子流式鉴定㊀流式结果显示ꎬ超过９０％的细胞表达ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１ꎬ但几乎不表达ＩＡ/ＩＥ㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４５ꎬＢＭＳＣ表面标志分子鉴定ꎬ见图２ꎮ㊀注:Ａ.ＣＤ４４ꎻＢ.ＳＣＡ￣１ꎻＣ.ＣＤ４５ꎻＤ.ＣＤ３４ꎻＥ.ＩＡ/ＩＥꎮ图２㊀ＢＭＳＣ表面标志分子鉴定Ｆｉｇ.２㊀Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｆｏｒｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ２.１.３㊀诱导ＢＭＳＣ成骨分化㊀成骨诱导２１ｄ后ꎬ细胞呈结节状ꎬ茜素红染色呈红色ꎬ见图３ꎮ表明成骨分化诱导成功ꎮ提示分离获得的小鼠ＢＭＳＣ符合国际细胞治疗协会制定的间充质干细胞标准ꎮ图３㊀ＢＭＳＣ成骨诱导分化(２００ˑ)Ｆｉｇ.３㊀Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆｏｒｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(２００ˑ)２.２㊀ｃｘｃｒ２慢病毒载体的构建㊀琼脂糖电泳结果显示ꎬ扩增的目的条带单一㊁特异ꎬ之后菌液ＰＣＲ鉴定㊁酶切鉴定㊁测序分析结果均表明成功构建了慢病毒载体ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺꎬ见图４ꎮ２.３㊀ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ稳定转染ＢＭＳＣ的构建及筛选㊀将ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ质粒与慢病毒包装质粒共同转染ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞ꎬ获得慢病毒后浓缩感染ＢＭ￣ＳＣꎬＢＭＳＣ经过Ｚｅｏｃｉｎ压力选择３周后ꎬ可在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光ꎬ对照组未见绿色荧光ꎬ见图５ꎮ２.４㊀稳定转染细胞系鉴定㊀流式鉴定大约７８.５％的细胞表达ＧＦＰꎬ７５.７％的细胞表达ＣＸＣＲ２ꎮＲｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ结果显示ꎬ试验组的ｃｘｃｒ２ｍＲＮＡ表达水平明显高于对照组ꎬ差异具有统计学意义(Ｐ<０.００１)ꎮ提示ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ构建成功ꎬ见图６ꎮ㊀注:Ａ.ｃｘｃｒ２基因片段的制备ꎻＢ.ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ菌液ＰＣＲ鉴定ꎻＣ.ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ质粒双酶切鉴定ꎻＤ.测序结果在ＮＣＢＩＢＬＡＳＴ比对ꎮ图４㊀ｃｘｃｒ２真核表达载体的构建Ｆｉｇ.４㊀Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｃｘｃｒ２ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ㊀注:Ａ.过表达ＣＸＣＲ２的ＢＭＳＣ的荧光图片ꎻＢ.未感染正常对照ＢＭＳＣ的荧光图片ꎮ图５㊀ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ稳定转染ＢＭＳＣ荧光表达(４００ˑ)Ｆｉｇ.５㊀ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢＭＳＣｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｂｙｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ(４００ˑ)㊀注:Ａ.流式细胞仪检测ＧＦＰ表达ꎻＢ.流式细胞仪检测ＣＸＣＲ２表达ꎻＣ.Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ检测过表达ＣＸＣＲ２的小鼠ＢＭＳＣ中ｃｘｃｒ２ｍＲＮＡ表达ꎮ∗∗∗.Ｐ<０.００１ꎮ图６㊀ＣＸＣＲ２修饰的ＢＭＳＣ的鉴定结果Ｆｉｇ.６㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＸＣＲ２ｍｏｄｉｆｉｅｄＢＭＳＣ２.５㊀ｃｘｃｒ２基因修饰的ＢＭＳＣ迁移能力增强㊀Ｔｒａｎ￣ｓｗｅｌｌ结果显示ꎬＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组在含有１００ｎｇ/ｍＬ的ｍＣＸＣＬ２的趋化液中穿过小室的数目明显高于ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎬＴｒａｎｓｗｅｌｌ实验检测细胞迁移ꎬ见图７ꎮ表明ｃｘｃｒ２基因修饰ＢＭＳＣ可增强其趋化潜能ꎮ㊀注:Ａ.ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎻＢ.ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣正常组ꎻＣ.ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎻＤ.ＢＭＳＣ￣正常组ꎻＥ.２４ｈ后不同组别穿过膜下的细胞数ꎮ∗∗.Ｐ<０.０１ꎮ图７㊀Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验检测细胞迁移(２００ˑ)Ｆｉｇ.７㊀Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｂｙｔｒａｎｓｗｅｌｌａｓｓａｙ(２００ˑ)３㊀讨㊀论２０世纪７０年代ꎬＦＲＩＥＤＥＮＳＴＥＩＮ等[１０]首次利用贴壁法从骨髓分离得到ＢＭＳＣꎮ由于其来源方便ꎬ易于分离培养ꎬ且具有多向分化㊁免疫调节㊁输送治疗剂的能力ꎬ是较好的组织工程细胞和基因载体细胞ꎬ常被用于免疫与炎症性疾病的基础和临床研究[１１－１２]ꎮ通过静脉或腹腔移植的ＭＳＣ会沿着趋化梯度向受损组织迁移ꎬ在靶组织中检出率有限(只有不到１％)ꎬ大大降低了其治疗效应ꎮ可能的原因是ＭＳＣ表面趋化因子受体的表达较低ꎮ研究发现ꎬ趋化因子及其受体在ＢＭＳＣ的归巢中起着重要作用ꎬＢＭＳＣ表面的趋化因子受体通常支配着血管内循环细胞的黏附和滚动[１３－１４]ꎮＣＨＥＮ等[１５]研究发现ꎬｃｘｃｒ４过表达的ＢＭＳＣ在小鼠结肠炎模型中可增强ＢＭＳＣ向受损肠黏膜的归巢ꎬ对治疗结肠炎有较好的疗效ꎮＨＯＥＧＬ等[１６]研究发现ꎬ在内毒素所致的肺损伤中趋化因子ＣＸＣＬ１㊁ＣＸＣＬ２高表达ꎬＮＫ细胞通过ＣＸＣＲ２介导参与中性粒细胞向肺部炎症部位的募集ꎮ因此ꎬ对ＢＭＳＣ基因修饰趋化因子受体成为提高归巢能力的新策略[１７－１８]ꎮ研究通过全骨髓贴壁法分离培养ＢＭＳＣꎬ使用ＤＭＥＭ培养基进行培养ꎬ经过换液㊁传代去除了杂细胞ꎬ从而获得了纯度较高的ＢＭＳＣꎮ为了检测其是否符合干细胞标准ꎬ通过流式检测干细胞表面标志ＳＣＡ￣１㊁ＣＤ４４㊁ＣＤ４３㊁ＣＤ４５㊁ＩＡ/ＩＥꎬ结果显示ꎬ其高表达ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１ꎬ几乎不表达ＩＡ/ＩＥ㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４５ꎬ通过诱导成骨分化观察到茜素红染色阳性的钙结节沉积ꎮ上述结果表明通过全骨髓贴壁法培养出符合细胞表型㊁具有分化潜能的ＢＭＳＣꎮ由于小鼠的ＢＭＳＣ具有感染率低的特点ꎬ研究通过慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染至ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞获得慢病毒ꎬ经超速离心沉淀法浓缩纯化ꎬ获得ｃｘｃｒ２过表达的慢病毒ꎮ通过离心法进行感染ꎬ利用抗性筛选提高阳性细胞的比例ꎬ从而使得ＣＸＣＲ２能稳定表达ꎮ荧光显微镜可以观察到稳定表达ＣＸＣＲ２的ＢＭＳＣ具有绿色荧光ꎻ流式细胞和ＲＴ￣ＰＣＲ结果显示ꎬＣＸＣＲ２蛋白和ｍＲＮＡ表达水平均明显高于正常ＢＭＳＣꎬ证实成功构建稳定表达ＣＸ￣ＣＲ２的ＢＭＳＣꎮ通过Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ趋化试验比较了ｃｘｃｒ２修饰的ＢＭＳＣ与普通ＢＭＳＣ的迁移和归巢ꎮ结果表明ꎬｃｘ￣ｃｒ２修饰的ＢＭＳＣ更容易迁移ꎬ提示ＣＸＣＲ２参与了ＢＭＳＣ的迁移与归巢ꎮ综上所述ꎬ研究成功构建了ｃｘｃｒ２修饰的ＢＭ￣ＳＣꎬ为进一步研究其直接移植治疗临床疾病及其作用机制奠定了基础ꎮ参考文献[１]㊀ＵＬＬＡＨＩꎬＳＵＢＢＡＲＡＯＲＢꎬＲＨＯＧＪ.Ｈｕｍａｎｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ￣ｃｕｒｒｅｎｔｔｒｅｎｄｓａｎｄｆｕｔｕｒｅｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ[Ｊ].ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＲｅｐꎬ２０１５ꎬ３５(２):１￣１８.[２]㊀ＲＯＳＴＡＭＩＭꎬＨＡＩＤＡＲＩＫꎬＳＨＡＨＢＡＺＩＭ.Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｅｎｇｉ￣ｎｅｅｒｅｄａｄｉｐｏｓｅｍｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇＨＩＶ￣ｂａｓｅｄｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓａｓｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｆｏｒａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＲｅｐｒｏ￣ｇｒａｍꎬ２０１８.ＤＯＩ:１０.１０８９/ｃｅｌｌ.２０１８.０００６.[３]㊀ＳＨＡＨＫꎬＺＨＡＯＡＧꎬＳＵＭＥＲＨ.Ｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏｔｒｅａｔｏｓｔｅｏ￣ａｒｔｈｒｉｔｉｓｗｉｔｈｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＩｎｔꎬ２０１８ꎬ２０１８:５３７３２９４.[４]㊀ＬＥＢＬＡＮＣＫꎬＭＯＵＧＩＡＫＡＫＯＳＤ.Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍ[Ｊ].ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕ￣ｎｏｌꎬ２０１２ꎬ１２(５):３８３￣３９６.[５]㊀ＣＨＥＮＸꎬＺＨＡＮＧＹꎬＷＡＮＧＷꎬｅｔａｌ.Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｍｏｄｉｆｉｅｄｗｉｔｈｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅ￣１ｈａｖｅｅｎｈａｎｃｅｄｐａｒａｃｒｉｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄａｔｔｅｎｕａｔｅｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ￣ｉｎｄｕｃｅｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｎｄｏｘｉｄａ￣ｔｉｖｅｄａｍａｇｅｉｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍꎬ２０１８ꎬ４９(１):１０１￣１２２.[６]㊀ＸＵＸＰꎬＨＵＡＮＧＬＬꎬＨＵＳＬꎬｅｔａｌ.ＧｅｎｅｔｉｃｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩｔｙｐｅ２ｒｅｃｅｐ￣ｔｏｒｉｎｃｒｅａｓｅｓｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｔｏｉｎｊｕｒｅｄｌｕｎｇｉｎＬＰＳ￣ｉｎｄｕｃｅｄａｃｕｔｅｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙｍｉｃｅ[Ｊ].ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＴｒａｎｓｌＭｅｄꎬ２０１８ꎬ７(１０):７２１￣７３０.[７]㊀ＳＴＥＷＡＲＴＡＮꎬＭＡＴＹＡＳＪＪꎬＷＥＬＣＨＫＯＲＭꎬｅｔａｌ.ＳＤＦ￣１ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｎｈａｎｃｅｓＧＡＰ￣４３￣ｐｏｓｉ￣ｔｉｖｅａｘｏｎａｌｇｒｏｗｔｈｆｏｌｌｏｗｉｎｇｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙ[Ｊ].ＲｅｓｔｏｒＮｅｕｒｏｌＮｅｕｒｏｓｃｉꎬ２０１７ꎬ３５(４):３９５￣４１１.[８]㊀ＨＥＲＴＺＥＲＫＭꎬＤＯＮＡＬＤＧＷꎬＨＩＮＥＳＯＪ.ＣＸＣＲ２:ａｔａｒｇｅｔｆｏｒｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ?[Ｊ].ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＴｈｅｒＴａｒｇｅｔｓꎬ２０１３ꎬ１７(６):６６７￣６８０.[９]㊀ＳＯＬＥＩＭＡＮＩＭꎬＮＡＤＲＩＳ.Ａｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ[Ｊ].ＮａｔＰｒｏｔｏｃꎬ２００９ꎬ４(１):１０２￣１０６.[１０]㊀ＦＲＩＥＤＥＮＳＴＥＩＮＡＪꎬＣＨＡＩＬＡＫＨＪＡＮＲＫꎬＬＡＬＹＫＩＮＡＫＳ.Ｔｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｆｂｒｏｂｌａｓｔｃｏｌｏｎｉｅｓｉｎｍｏｎｏｌａｙｅｒｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆｇｕｉｎｅａ￣ｐｉｇｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｎｄｓｐｌｅｅｎｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＫｉ￣ｎｅｔｉｃｓꎬ１９７０ꎬ３:３９５￣４０３.[１１]㊀ＦＲＥＮＥＴＴＥＰＳꎬＰＩＮＨＯＳꎬＬＵＣＡＳＤꎬｅｔａｌ.Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ:ｋｅｙｓｔｏｎｅｏｆｔｈｅｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｎｉｃｈｅａｎｄａｓｔｅｐ￣ｐｉｎｇ￣ｓｔｏｎｅｆｏｒｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｍｅｄｉｃｉｎｅ[Ｊ].ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌꎬ２０１３ꎬ３１:２８５￣３１６.[１２]㊀ＬＩＸꎬＷＡＮＧＭꎬＪＩＮＧＸꎬｅｔａｌ.Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｎｄａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ￣ｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ:ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎꎬｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ￣ｔｉｏｎꎬａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｃａｒｔｉｌａｇｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＣｒｉｔＲｅｖＥｕｋａｒｙｏｔＧｅｎｅＥｘｐｒꎬ２０１８ꎬ２８(４):２８５￣３１０.[１３]㊀ＩＤＯＲＮＭꎬＴＨＯＲＳＰ.Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｅｘｅｒｃｉｓｅｔｏｔａｃｋ￣ｌｅｔｈｅｉｎａｄｅｑｕａｃｙｏｆＴｃｅｌｌｈｏｍｉｎｇｔｏｔｈｅｔｕｍｏｒｓｉｔｅ[Ｊ].Ｃｅｌｌｓꎬ２０１８ꎬ７(８):Ｅ１０８.[１４]㊀ＺＨＡＮＧＸꎬＨＵＡＮＧＷꎬＣＨＥＮＸꎬｅｔａｌ.ＣＸＣＲ５￣ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓｅｘｈｉｂｉｔｅｎｈａｎｃｅｄｈｏｍｉｎｇａｎｄｃａｎｄｅ￣ｃｒｅａｓｅｃｏｎｔａｃｔｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ[Ｊ].ＭｏｌＴｈｅｒꎬ２０１７ꎬ２５(６):１４３４￣１４４７.[１５]㊀ＣＨＥＮＺꎬＣＨＥＮＱꎬＤＵＨꎬｅｔａｌ.ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄＣＸＣｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ４ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｍｐｒｏｖｅｄｔｈｅｔｈｅｒａｐｅｕ￣ｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｎｃｏｌｉｔｉｓｖｉａｍｕｃｏｓａｒｅｐａｉｒ[Ｊ].ＥｘｐＴｈｅｒＭｅｄꎬ２０１８ꎬ１６(２):８２１￣８２９.[１６]㊀ＨＯＥＧＬＳꎬＥＨＲＥＮＴＲＡＵＴＨꎬＢＲＯＤＳＫＹＫＳꎬｅｔａｌ.ＮＫｃｅｌｌｓｒｅｇｕｌａｔｅＣＸＣＲ２＋ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔｄｕｒｉｎｇａｃｕｔｅｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙ[Ｊ].ＪＬｅｕｋｏｃｙｔｅＢｉｏｌꎬ２０１７ꎬ１０１(２):４７１￣４８０.[１７]㊀ＧＯＬＣＨＩＮＡꎬＲＥＫＡＢＧＡＲＤＡＮＭꎬＴＡＨＥＲＩＲＡꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏ￣ｍｏｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌ￣ｂａｓｅｄｔｈｅｒａｐｙ:ｓｐｅｃｉａｌｆｏｃｕｓｏｎｔｈｅｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｙａｎｄｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓｔｕｄｉｅｓ[Ｊ].ＡｄｖＥｘｐＭｅｄＢｉｏｌꎬ２０１８.ＤＯＩ:１０.１００７/５５８４＿２０１８＿２５６.[１８]㊀ＫＡＲＰＪＭꎬＬＥＮＧＴＧ.Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｈｏｍｉｎｇ:ｔｈｅｄｅｖｉｌｉｓｉｎｔｈｅｄｅｔａｉｌｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌꎬ２００９ꎬ４(３):２０６￣２１６.收稿日期:２０１８￣１０￣１６㊀修回日期:２０１８￣１２￣１２编辑:陈凌云。
慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用
慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用摘要：慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。
经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。
基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统，慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗载体研究的热点。
近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展，笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。
关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。
其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。
理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［１］。
由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。
1 慢病毒及其载体的简介慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。
慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu 和2个调节基因tat和rev［２］。
慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。
病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA 包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。
目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［３］。
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细胞因子对小鼠造血干细胞基因转移
效率影响的实验研究
我们观察了造血干细胞因子(SCF)、白细胞介素(IL)-3、IL-6不同
组合方式对小鼠造血干细胞基因转移效率的影响，以期发现能有效地提高基因转移效率的细胞因子或其组合。
材料和方法
1包装细胞系已转染逆转录病毒载体GCGPXSN的包装细胞株PA317-PCGPXSN 由上海东方肝胆外科医院惠赠。
GCGPXSN中含有绿色荧光蛋白(GFP)和新霉素磷酸转移酶(Neo R)基因，系在逆转录病毒载体GCXPXSN的第一个多克隆位点插入GFP cDNA构建而成。
2病毒上清制备及滴度测定将PA317-PCGPXSN细胞常规方法培养至70%～80%汇合后，换用新鲜培养液培养24小时，收集培养液上清。
病毒滴度测定及计算按文献［1］进行。
3基因转移处死BALB/c小鼠(购自兰州生物制品研究所)，制备2×106／ml 的骨髓细胞悬液。
按附表分别加入rhIL-3,rhIL-6(均为200U/ml，由日本
Kirin公司惠赠)及rmSCF(100ng/ml，由军事医学科学院沈倍奋教授惠赠)，培养24小时后离心弃上清，加入总滴度为7.6×105cfu/ml的病毒上清及8μg/ml polybrene(美国Sigma公司产品)，加细胞因子如上述浓度，阴性对照未转染。
继续培养24小时，收集细胞按下述不同方法检测基因转移效率。
4 基因转移效率的测定
4.1流式细胞术测定基因转移效率：将上述完成基因转移工作的骨髓细胞制备成2×106／ml的细胞悬液，应用流式细胞仪(FACS caliber,美国BD公司)分别获取10000个细胞。
4.2CFU-GM检测：按琼脂半固体培养法于96孔细胞培养板中培养。
其中
G418(+)8孔，G418(-)8孔。
7天后计数CFU-GM集落数，计算转移效率。
附表基因转移实验分组
4.3聚合酶链反应(PCR)检测：PCR扩增所需NeoR基因引物为［2］：
P 1:5′CAAGATGGATTGCAC-GCAGG3′；P
2
：5′CCCGCTCAGAAGAACTCGTC3′(由北京
天象人生物工程公司合成)，其间扩增片段长度为790bp。
从半固体培养基中挑取阴性对照组，SCF/IL-3/IL-6联合应用组之G418(+)组及G418(-)组克隆各12个用于PCR扩增。
取10μl扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并计算转移效率。
4.4Southern blot印迹杂交：应用含有Neo R基因的质粒PLXSN(美国
Miller教授惠赠)经PCR扩增后用地高辛标记试剂盒(美国BM公司)制备探针。
PCR扩增引物同上。
探针制备方法参照试剂盒说明书进行。
Southern blot印迹杂交方法参照文献［3］进行。
5统计学处理FACS测定值的统计学处理用直方表示。
CFU-GM测定值的统计学处理用χ2检验进行。
结果
1病毒滴度测定结果为1.9×105cfu/ml。
2流式细胞术测定结果阳性对照组基因转移率为0.06%，应用细胞因子后基因转移效率有明显提高(0.07%～0.20%)，而以SCF/IL-3，SCF/IL-3/IL-6联合应用尤为显著，由0.06%提高至0.20%。
3CFU-GM测定结果SCF，IL-3，IL-6单独使用及SCF/IL-6，IL-3/IL-6联合应用可使基因转移效率提高到20.45%～28.69%，与阳性对照组相比较差异显著(P<0.01)。
SCF/IL-3及SCF/IL-3/IL-6联合应用可使基因转移效率进一步提高至44.60%～46.40%，提高转移效率4.2倍，与SCF，IL-3，IL-6单独使用及SCF/IL-6，IL-3/IL-6联合应用组相比较差异非常显著(P<0.005)。
4PCR测定结果12个G418(+)克隆全部扩增到特异性片段，而12个G418(-)克隆中有7个克隆扩增到特异性片段，转移效率为58.33%，高于CFU-GM测定结果。
5Southern blot印迹杂交结果12个G418(-)克隆经PCR扩增，用上述方法制备的探针进行杂交。
7个克隆的PCR产物得到特异性的杂交带，进一步证明质粒GCGPXSN已转移入小鼠造血干细胞。
讨论
SCF，IL-3，IL-6可不同程度地作用于造血干细胞和多向造血祖细胞，促进其增殖分化，亦可提高它们对某些造血生长因子的敏感性［4］。
故我们尝试将其单独或联合使用以期提高基因转移效率。
从测定结果可以看到，SCF/IL-3联合使用能十分有效地提高逆转录病毒载
体介导的基因转移效率，SCF/IL-3/IL-6联合应用似不再能有更明显的提高。
考虑此系SCF与IL-3协同刺激造血干细胞由G
0或G
1
期进入S期，提高了增殖
期细胞比例，而IL-6与SCF，IL-3无明显协同作用［5］。
由于CFU-GM测定方法受Neo R基因表达量及G418浓度影响，而PCR测定方法不受Neo R基因表达量的影响，故PCR方法能较准确地反映基因转移效率。
应用FACS可测知基因转移成功的细胞个数，并借助于分选系统进行收集，用于临床基因治疗或探讨自体骨髓移植后造血重建机制和复发原因的研究。
参考文献
1Miller AD, Falaw M, Verma JM. Generation of helper free amphotropic retrovirus that transduce a dominant-acting, methotrexate-resist dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol, 1985, 122:175-181.
2Morgan RA, Cornetta K, Anderson WF. Application of the polymerase chain reaction in retroviral-mediated gene transfer and the analysis of gene-marked human TIL cells. Human Gene Ther, 1990, 1:135-143.
3J 萨姆布鲁克，EF 弗里奇，T 曼尼阿蒂斯主编. 分子克隆实验手册. 第2版. 金冬雁，等译. 北京：科学出版社，1992. 474-481.
4侯健，王东星，胥军民主编. 人类细胞因子手册. 上海：同济大学出版社，1996. 79-96，124-141，243-248.
5Miller DG, Adam MA, Miller AD. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only cells that are actively replicating at the time of transfection. Mol Cell Biol, 1990, 110:239-246.。