研究生生物学教案：细胞分子生物学技术实验
分子生物学实验教案
机 5m 后关灯，关灯后 10 分钟打开照明灯，即可使用。 11. 电泳系统：
期保存在超低温环境下，就需要一个液氮罐（-196℃）具有经济、省力和较好地保 持细胞生物学特性的优点。 3．培养箱：37℃恒温箱用于细菌的固体培养和细胞培养。
CO2培养箱适用于培养各种细胞，可恒定地提供一定量的CO2（通常 5%），用来维 持培养液的酸度（pH值）。 37℃恒温空气摇床可进行液体细菌的培养。 4. 水浴锅：用于保温。 25-100℃水浴摇床可用于分子杂交试验，各种生物化学酶反应等试验的保温。 25-100℃水浴箱用于常规试验。 5. 烘箱：主用于烘干实验器皿，有些需要温度高些，有些需要温度低些。用于 RNA 方面 的实验用具，需要在 250℃烤箱中烘干，有些塑料用具只能在 42-45℃的烤箱中进行 烘干。 （二）水的净化装置：随着分子生物学的飞速发展，许多实验对水纯度的要求越来越高。 1. 蒸馏水皿：单蒸水常难以满足实验要求。双蒸水、三蒸水配液，许多实验要去离子水。
3
1. 真空加热干燥箱：核酸在硝酸纤维素膜和尼龙膜上固定，用于杂交实验。 2. 电泳凝胶干燥箱：电泳后的凝胶进行脱水干燥的仪器，一般可将凝胶干燥到一些玻
璃纸上，干燥后的凝胶易于保存。 3. 液氮冷冻干燥：适用于活性蛋白质样品的干燥与结晶。 4. 真空泵：许多实验都需要抽真空。如：乙醇沉淀后核酸样品的干燥，电泳凝胶的干
主用于核酸样品琼脂糖凝胶和 PCR 电泳结果的紫外观察和照像。 8. PCR 仪：PTC-200 基因扩增仪
分子生物学与细胞生物学实验基本技术
分子生物学与细胞生物学实验基本技术2005-02实验一组织块培养法一、目的学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。
二、概述组织块培养法是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养方法。
可以采用剪切法，即将组织块剪切成小块后，接种于培养瓶，组织小块贴壁24h或更长时间后，细胞就从组织四周游出。
但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。
用于组织块培养的培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理，如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长。
（本节以新生牛主动脉平滑肌培养为例）三、材料（一）仪器1.净化工作台2.恒温水浴箱3.冰箱（4℃、-20℃）4.倒臵相差显微镜5.培养箱（二）玻璃器皿1.培养皿（Φ100mm）2.吸管（弯头）3.烧杯（500ml、200ml、10ml）4.广口试剂瓶（500ml）5.玻璃瓶（250ml、100ml）6.培养瓶7.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.胶塞4.EP管（四）其他物品1.微量加样枪2.眼科组织剪（直尖、弯）3.眼科组织镊（直、弯）4.12.5cm组织镊（无钩、1×2钩）5.25cm敷料镊（无钩）6.止血钳（18cm直纹式、12.5cm直纹式、弯纹式）7.解剖剪（五）试剂1.D-Hanks液2.小牛血清3.RPMI16404.双抗（青霉素、链霉素）5.1N HCl6.7.4%NaHCO3四、操作步骤1.取材：打开胸腔，无菌操作下取出主动脉胸段，浸到预先配制好的含双抗（500u/ml青、链酶素）的D-Hanks液中漂洗。
2.组织的冲洗、修剪：取出主动脉，用锋利的剪刀修剪除去周围组织，再用D-Hanks冲洗主动脉3次，除去血块及杂组织等。
3.平滑肌组织分离：纵向剖开主动脉，撕下主动脉内层，取主动脉中层的平滑肌组织，无血清RPMI1640漂洗3次。
4.剪切：将平滑肌组织用锋利的眼科剪反复剪切至剪成1mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加1～2滴培养液，以保持湿润。
研究生分子生物学实验讲解
⑦取组织样品时要快速
RNA完整性的鉴定
RNA样品电泳后，可见28S、 18S及5S小分子RNA条带，则 说明完整性好。若有降解可能 是操作不当或污染了RNase。 28S和18S RNA比值约为2：1, 表明RNA无降解。如比值逆转， 则表明RNA降解。
(2) 如何保证RNA的纯度？
2、加250ul裂解液，颠倒4次混匀；加10ul碱性蛋 白酶溶液，颠倒4次混匀；室温放5分钟。 3、加350ul平衡液，颠倒4次混匀；10000rpm离 心10分钟。 4、上层清液转移到离心柱上。10000rpm离心1分 钟，弃去收集管中溶液。
5、加入750ul清洗液（已加乙醇），10000rpm 离心1分钟，弃去收集管中溶液。
RT：Reverse transcription
PCR的基本过程 三个基本步骤
①变性(denaturation):双链DNA模板解开成单链 94–96℃，速度快，1min
②退火(annealing)：两个寡核苷酸引物结合到单链模板 退火温度依赖Tm(Tm-5) Tm = 4(G+C) + 2(A+T) ℃
1. The electric charge effect（电荷效应） PH（8.3） > PI（4.0－4.5）, DNA -
2. The sieving effect （分子筛效应） a The molecular weight of DNA b The structure of DNA
共价闭环 DNA ＞ 直线 DNA ＞ 开环的双连 DNA
3. The concentration of agarose gel （琼脂糖凝胶的浓度）
EB（溴化乙锭）
分子生物学与细胞生物学实验
蛋白质分离与纯化
目的：从混合物中分离出目标蛋白质
原理：利用蛋白质的化学性质和生物学特性进行分离
操作步骤：样品制备、缓冲液选择、沉淀、洗涤、再溶解、纯化
注意事项：避免蛋白质变性、保持蛋白质活性、防止污染
生物信息学分析
实验目的：分析生物信息，了解生物分子的结构和功能
实验结果：获得生物分子的结构和功能信息，为后续研究提供依据
实验方法：包括显微镜观察、基因克隆、蛋白质分析等
细胞生物学：研究细胞结构和功能的科学
实验基本原理
分子生物学与细胞生物学实验的基本原理主要包括细胞生物学、分子生物学、遗传学和生物化学等领域的知识。
实验过程中，需要遵循一定的实验操作规程和实验伦理原则，以保证实验结果的准确性和可靠性。
实验过程中，需要掌握各种实验技术和方法，如细胞培养、基因编辑、蛋白质纯化等。
实验步骤：样本处理、数据收集、数据分析、结果解读
实验材料：生物样本、实验试剂、仪器设备
实验数据分析与解读
4
实验数据收集与整理
实验数据的来源：实验操作、观察记录、仪器测量等
实验数据的类型：定性数据、定量数据、图像数据等
实验数据的整理：数据清洗、数据整合、数据转换等
实验数据的存储：电子表格、数据库、云存储等
分子生物学与细胞生物学实验
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目录
01
添加目录项标题
02
实验基础知识
03
实验操作流程
04
实验数据分析与解读
05
实验注意事项与安全防范
06
实验案例分析
添加目录项标题
1
实验基础知识
2
分子生物学与细胞生物学概述
分子细胞生物学实验设计
1.请你设计一个离体实验证明SRP和SRP受体的功能。
答: 实验中首先要分离SRP、SRP受体和微粒体, 并要有克隆的分泌蛋白的基因, 然后在无细胞蛋白质合成系统中进行蛋白质合成实验。
主要做法是: 在无细胞翻译体系中如果不加SRP、SRP受体、微粒体，分泌蛋白只能合成一条带有信号序列的完整多肽；如果加入SRP、但不加入SRP受体和微粒体，新生肽的合成在完成70-100个氨基酸时被阻断,因为SRP已经与信号序列结合并中止了蛋白质的翻译,但由于找不到受体,SRP不能被释放,所以蛋白质不能继续合成；如果反应体系中加有SRP和SRP受体,但没有微粒体，也能够合成完整的具有信号序列的多肽，并且会伴随GTP的水解而释放出SRP颗粒。
如果在反应体系中同时加有SRP、SRP受体和微粒体，将会合成一条成熟的没有信号序列的多肽，并且释放到微粒体中。
2.请设计一个实验证明线粒体蛋白合成之后进入了线粒体。
答: 可通过基因工程和分子生物学方法进行研究，主要过程如下：①克隆线粒体基质蛋白基因;②在无细胞系统中合成酵母线粒体蛋白;③检测分离后将合成的蛋白质分成两组,一组直接加入胰蛋白酶,另一组先加入线粒体,然后再用胰蛋白酶蛋白酶处理;④结果分析: 如果加入线粒体的一组中的蛋白质对胰蛋白酶具有抗性,而不加线粒体的一组中蛋白质被胰蛋白酶水解, 即可证明加入线粒体后, 线粒体蛋白进入了线粒体。
因为胰蛋白酶是水溶性的酶,不能进入线粒体,所以对胰蛋白酶的抗性说明线粒体蛋白进入了线粒体从而得到保护。
3.请设计一种方法检测跨膜蛋白的哪一部分位于膜的外侧,哪一部分位于膜的内侧?答:①用相对分子质量大而不能透过细胞质膜的胰蛋白酶处理胰蛋白酶完整的细胞:这种处理可以将跨膜蛋白的朝向外侧的肽水解,而位于脂双层和细胞质面的部分则不受影响。
②用非离子去垢剂或渗透休克提高膜的渗透性,让膜失去了对蛋白水解酶渗透的障碍作用, 结果使膜蛋白的细胞质部分被蛋白酶水解。
分子生物学实验教学教案
分子生物学实验教学教案一、实验原理1. 介绍分子生物学的定义和基本概念，理解分子生物学实验的目的和意义。
2. 掌握DNA提取、PCR扩增、DNA测序、基因克隆、蛋白质表达和纯化等基本实验技术。
3. 了解各种实验试剂的使用方法、实验仪器的操作和维护。
二、实验内容1. DNA提取与纯化2. PCR扩增目的基因3. DNA测序4. 基因克隆与载体构建5. 蛋白质表达与纯化三、实验材料与试剂1. 实验材料：细胞样本、DNA提取试剂、PCR反应体系、DNA测序试剂、基因克隆试剂、表达载体、细菌和酵母等。
2. 试剂：蛋白酶K、NaCl、EDTA、DNase、PCR酶、DNA连接酶、限制性内切酶、琼脂糖、DNA胶回收试剂、SDS等。
四、实验步骤与操作要点1. DNA提取与纯化：(1) 细胞裂解：向细胞样本中加入蛋白酶K和NaCl，充分混合后置于55-60℃水浴中保温1-2小时。
(2) 蛋白质去除：向上述混合物中加入SDS和DNase，充分混合后置于65℃水浴中保温1小时。
(3) DNA沉淀：向上述混合物中加入体积分数为70%的冷酒精，充分混合后置于-20℃冰箱中沉淀1小时。
(4) DNA纯化：将沉淀的DNA用70%的冷酒精洗涤两次，用无水酒精洗涤一次，空气中晾干。
2. PCR扩增目的基因：(1) 配制PCR反应体系：含DNA模板、引物、dNTPs、PCR酶等。
(2) PCR扩增：将反应体系置于PCR仪中，进行高温变性、低温复性和中温延伸等步骤。
(3) 琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
3. DNA测序：(1) 制备DNA测序模板：将PCR产物经过纯化后，作为测序模板。
(2) 进行DNA测序：使用DNA测序试剂和测序仪进行测序。
(3) 分析测序结果。
4. 基因克隆与载体构建：(1) 将目的基因插入到表达载体中。
(2) 将重组载体转化到细菌或酵母等宿主细胞中。
(3) 筛选和鉴定重组子。
5. 蛋白质表达与纯化：(1) 将重组质粒转化到表达菌株中，进行蛋白质表达。
细胞分子生物学研究
细胞分子生物学研究一、细胞与分子生物学基础细胞是生命的基本单位，是构成生物体系的最基础结构，也是生命活动的基本场所。
分子生物学是研究生物大分子结构、功能及其相互作用的学科，是研究生命活动的基础。
细胞与分子生物学互相依存，相辅相成，对于研究各种生物现象都有着至关重要的意义。
1、细胞结构与功能细胞由细胞膜、细胞质、细胞核组成，内含多种细胞器，如线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体等。
细胞膜是维持细胞结构和细胞内外环境稳定的重要组成部分，负责物质的运输和信号传导。
细胞质包括细胞内所有物质，进行各种代谢反应，提供能量和基础物质。
细胞核储存着遗传信息，指导细胞分裂、重建和调节。
2、生物大分子结构与功能生物大分子是指生物体系中的高分子有机物，包括蛋白质、核酸、多糖、脂质等。
蛋白质是生物体系中最重要的生物大分子之一，是构成生物体系中所有功能分子的基础，具有最广泛的功能。
核酸是构成生物体系中基因遗传物质的基础，以DNA和RNA为主要代表，负责储存、传递和表达遗传信息。
二、细胞分子生物学实验技术细胞分子生物学是基于细胞与分子生物学的研究，需要掌握各种先进实验技术进行图像分析、功能分析和定量分析。
1、PCR技术PCR技术是一种基于DNA的重复扩增的技术，能够从样品中扩增出一个特定的DNA片段，是研究遗传改变、定位基因、DNA 指纹鉴定等方面必须掌握的核心技术。
2、蛋白质分析技术蛋白质分析技术是研究蛋白质结构、功能、表达等方面的一系列技术，包括蛋白质电泳、蛋白质质谱学等。
3、细胞培养技术细胞培养技术是研究细胞生物学的基本技术，相应的培养条件、培养基的选择、细胞培养操作等都是影响实验结果的重要因素。
三、细胞分子生物学研究进展近年来，随着技术的不断发展，细胞分子生物学研究蓬勃发展，涌现出大量的前沿研究成果。
1、基因组学与遗传学随着基因测序技术的不断提高，基因组学和遗传学研究得到迅速发展，为遗传病的诊断和治疗提供了重要的理论基础。
分子生物学实验方案
分子生物学实验方案实验目的：本实验旨在通过分子生物学技术，研究基因组中特定基因的表达，以及相关信号转导通路的调控机制。
实验原理：1. RNA提取：从细胞或组织中提取总RNA，利用RNA纯化试剂盒抽提RNA样本。
2. cDNA合成：通过逆转录酶反应，利用mRNA模板合成互补的cDNA，并去除RNA模板。
3. 实时定量PCR：使用合适的引物和荧光探针，通过荧光信号实时监测PCR增殖过程，分析特定基因的表达量。
4. 蛋白质免疫印迹：将细胞提取物或组织样本中的蛋白质，通过SDS-PAGE电泳分离，转移到膜上，用特异抗体与目标蛋白结合，再用二抗识别抗体结合，最后显色检测目标蛋白。
实验步骤：1. RNA提取- 准备待检测细胞或组织的样本。
- 使用RNA纯化试剂盒按照说明书进行RNA提取。
2. cDNA合成- 准备反应体系，包括RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs。
- 在PCR仪中进行cDNA合成反应，设定适当的温度和时间。
3. 实时定量PCR- 准备PCR反应体系，包括cDNA模板、引物、探针和荧光染料。
- 在实时荧光定量PCR仪中设定合适的温度程序和循环次数。
- 分析实时PCR数据，计算目标基因的表达量。
4. 蛋白质免疫印迹- 准备待检测细胞或组织的提取物。
- 使用SDS-PAGE分离细胞提取物中的蛋白质。
- 将蛋白质转移到膜上。
- 进行膜上抗体反应，并用二抗结合以增强信号。
- 检测目标蛋白的表达水平。
实验注意事项：1. 实验操作需在无菌环境下进行，以避免外源性RNA或蛋白的干扰。
2. 实验过程中，需使用质量可靠的试剂和仪器设备，确保实验结果准确可靠。
3. 操作时应注意个人防护，避免接触有害物质和受伤。
4. 实验中的样品处理需严格按照操作规程，以确保样品完整性和纯度。
实验结果与分析：通过以上实验方案，可以获得目标基因的表达水平及相关信号转导通路的调控机制。
实时定量PCR结果可用于定量分析目标基因在不同样本中的表达量的差异。
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研究生生物学教案：细胞分子生物学技术实验
一、引言
本教案旨在介绍研究生生物学课程中的细胞分子生物学技术实验内容。
通过这
些实验，研究生将能够深入了解和掌握细胞分子生物学领域的基本操作和技巧，培养科研素质和实验技能。
二、实验目标
1.掌握DNA分离与纯化技术。
2.理解PCR（聚合酶链式反应）原理及其应用。
3.学习基因克隆的方法和原理。
4.熟悉蛋白质表达与纯化技术。
5.实践基因组编辑技术CRISPR-Cas9。
三、实验内容
3.1 DNA分离与纯化
•实验原理：该实验旨在通过裂解细胞获得DNA，并利用离心等方法进行DNA的纯化。
•实验步骤：
•组织样品处理；
•细胞裂解；
•蛋白质沉淀；
•DNA沉淀与洗涤；
•最后的DNA溶解。
3.2 PCR技术
•实验原理：PCR是一种重复性进行的体外DNA复制方法。
该实验旨在利用PCR技术扩增目标DNA段。
•实验步骤：
•DNA模板的准备；
•寡核苷酸引物设计；
•PCR反应体系配制；
•PCR程序设置；
•PCR产物分析。
3.3 基因克隆
•实验原理：基因克隆是将感兴趣的DNA序列插入载体，并转化到宿主细胞中，使其能够稳定地表达目标蛋白质。
•实验步骤：
•DNA片段切割与连接；
•载体的选择与准备；
•受体菌株的选择与转化；
•克隆子筛选与验证。
3.4 蛋白质表达与纯化
•实验原理：该实验旨在通过大肠杆菌表达系统表达目标蛋白质，并利用亲和层析等纯化技术纯化蛋白质。
•实验步骤：
•表达载体构建与转化；
•菌液培养与感诱液处理；
•细胞裂解与终浓缩液处理；
•蛋白质纯化与分析。
3.5 CRISPR-Cas9基因组编辑
•实验原理：CRISPR-Cas9是一项革命性的基因组编辑技术，本实验旨在进行CRISPR-Cas9介导的基因敲除实验。
•实验步骤：
•核酸序列设计与构建；
•整合载体注射或转染；
•细胞培养与筛选；
•效果验证。
四、实验评估
每个实验的评估将基于学生的实际操作能力、理解程度和结果展示情况，并根据提交的报告和数据进行评分。
五、总结
通过本研究生生物学教案中所提到的细胞分子生物学技术实验，研究生将能够加深对DNA分离与纯化、PCR技术、基因克隆、蛋白质表达与纯化以及CRISPR-Cas9等技术的理解，并为他们在细胞分子生物学领域的研究打下坚实的基础。
通过这些实验，他们也将培养出科研素质和实验技能，为未来从事相关科研工作奠定良好的基础。