第四章 荧光分析法

二、分子发光的类型
1、按激发的模式分类：分子发光
光致发光 化学发光 热致发光 场致发光 荧光 磷光
2、按分子激发态的类型分类：分子发光
三、荧光分析法的特点
1、灵敏度高 2、选择性强 3、工作曲线线性范围宽
第一节 荧光分析法的基本原理
一、分子荧光的产生
二、激发光谱与荧光光谱
三、荧光与分子结构的关系 四、影响荧光强度的外部因素
四、影响荧光强度的外部因素
（一）溶剂的影响 （二）温度的影响 （三）pH值的影响 （四）散射光的影响 （五）荧光熄灭剂的影响
（一）溶剂的影响
1、溶剂的极性： 对许多共轭芳族化合物，激发时发生了 → * 跃迁，其激 发态比基态具有更大的极性，随着溶剂极性的增大，激发态 比基态能量下降的更多，荧光光谱向长波移动。 2、氢键
（四）色散光的影响
散射光对荧光测定有干扰，选择适当的激发波长可消除 。
（五）荧光熄灭剂的影响
1、荧 光 熄 灭（荧光淬灭） 指荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强 度降低或消失的现象。 2、荧光熄灭剂 指能与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物 质。 如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合 物、羰基化合物等。 3、荧光熄灭类型 (1)碰撞淬灭；(2)生成化合物的淬灭(静态淬灭)；(3)能量转 移淬灭；(4)氧的淬灭；(5)转入三重态的淬灭；(6)浓度过大 引起的自淬灭。
内转换
S2 * 能 量
振动弛豫 内转换 系间跨越 T1* T2*
S1 * 吸 收 发 射 荧 光
外转换
发 射 振动弛豫 磷 光
S0
l1
l2
l 2
l3
（二）荧光的产生
5、外转换：激发分子与溶剂或其他溶质分子之间产生相互 作用而转移能量的非辐射跃迁。 外转换使荧光或磷光减弱或“淬灭”。 6 、系间跨越：不同多重态 , 有重叠的转动能级间的非辐射 跃迁。
苯 萘 蒽
化合物
F
λex(max)(nm)
0.11 205
0.29 286
0.46 65
λem(max) (nm) 278
321
404
（三）分子结构与荧光的关系
2、刚性平面结构 荧光物质的刚性和平面性增加，荧光效率越大，荧光波长发 生长移。 芴
联二苯
F=1.0
萘
Mg2+
F=0.2
维生素A
8-羟基喹啉 弱荧光
一、荧光分光光度计
（四）检测器 光电倍增管，电感耦合器件（CCD）。 放大倍数：2n~5n（n=10），103~107， 最大108~109
（五）信号显示记录器 计算机光谱工作站，对数字信号进行采集、处理、显示，并对 各系统进行自动控制。
二、荧光分析新技术
（一）同步荧光分析法 （二）三维荧光分析法 （三）时间分辨荧光分析法
电子激发态的多重态 M=2S+1
（一）分子中电子能级的多重性
基态分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中不发生自旋方向的 变化，仍然是M=1，分子处于激发的多重态，用S*表示。 若电子在跃迁过程中伴随自旋方向的变化，分子中便具有两个 自旋不配对的电子，s=1，M=3，分子处于激发的三重态，用T1* 表示。 S*与T1*的区别在于电子自旋方向不同， T1*能级较S*稍低一些。
（二）荧光光谱特征
1、Stokes位移 指相同电子跃迁在吸收光谱和发射光谱中最强波长间的差值。 发射光谱的波长比激发光谱的长，由于振动弛豫等原因消耗了 能量。
（二）荧光光谱特征
2、荧光光谱的形状与激发波长无关 一般情况下，用不同波长的激发光来激发荧光分子，得到的荧 光发射光谱的形状基本相同。 原因：荧光均由第一激发态 的最低振动能级返回基态产 生的。
荧光
磷光
系间跨越 内转换 外转换 振动弛豫
（二）荧光的产生
1、荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态 （多为S1→S0跃迁），发射波长λ′2 的荧光。 2、磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态 （T1→S0跃迁） 。
内转换 S2 * 能 量 S1 * 吸 收 发 射 荧 光 外转换 振动弛豫 内转换 系间跨越
内转换 振动弛豫 内转换 系间跨越 T1* T2*
S2 * 能 量
S1 * 吸 收 发 射 荧 光
外转换
发 射 振动弛豫 磷 光
S0
l1
l2
l 2
l3
二、激发光谱与荧光光谱
（一）激发光谱与荧光光谱 （二）荧光光谱特征
（一）激发光谱与荧光光谱
荧光强度：指发射荧光的光的强度。 荧光强度F与荧光物质浓度c，激发光强度I0的关系为 F=φfI0(1-10-εbc) 其中φf为荧光量子产率，ε为摩尔吸光系数，b为液池厚度。 该式表明荧光强度与量子产率成正比，但与荧光物质浓度没有直 线关系。 稀溶液时，上式简化为 F=2.3φfI0εbc= Kc 此时，荧光强度与荧光物质浓度成正比。
第二节 荧光分光光度计
一、荧光分光光度计 （一）光源 （二）单色器 （三）样品池 （四）检测器 （五）信号显示记录器 二、荧光分析新技术简介 （一）同步荧光分析法 （二）三维荧光分析法 （三）时间分辨荧光分析法
一、荧光分光光度计
光源
激发单色器
氙 灯
光电倍增管
样品池
光源
数据处理 仪器控制
激发 单色器
不同激发波长下维生素B2荧光光谱图
（二）荧光光谱特征
3、荧光光谱与激发光谱成镜像关系 激发光谱与荧光光谱形状相似，存在“镜像对称”关系。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350 400 450
500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
（二）荧光光谱特征
荧光发射光谱 荧光激发光谱 磷光光谱
200
260 320 380 440 500 560 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
化合物
f
0.11
0.29
0.46
0.60
0.52
（二）荧光寿命
指除去激发光源后，荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需 的时间，用τf表示。
F0 为激发时的荧光强度， Ft 为激发后时间 t 的荧光强度，以 ln(F0/Ft)对t作直线，直线的斜率即为1/ τf 。
F0 t ln ＝ Ft f
（一）激发光谱与荧光光谱
1、激发光谱曲线（F−λex曲线） 固定荧光的发射波长(即测定波长), 改变入射光波长,得 到荧光(磷光)强度与入射光波长的关系曲线。 2、荧光光谱（F−λem曲线） 固定激发光波长(入射光波长), 改变荧光的测定波长(发 射波长),得到荧光强度与发射光波长关系曲线。
硫酸奎宁的激发光谱（a）及荧光光谱（b）
T1*
T2*
发 射 振动弛豫 磷 光
S0
l1
l2
l 2
l3
（二）荧光的产生
3、振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能 级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。 4、内转换：同多重态电子能级中，等能级间的无辐射能级交 换的过程。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单 重态的最低振动能级。
（三）分子结构与荧光的关系
分子产生荧光必须具备的条件： （1）强的紫外-可见吸收； （2）具有一定的荧光量子产率。 分子结构对荧光起决定作用。 1、共轭结构 2、分子的刚性平面结构 3、取代基效应
（三）分子结构与荧光的关系
1、共轭效应 产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大， 离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。
一、荧光分光光度计
（三）样品池 通常用低荧光的石英材料制成，四面均为磨光透 明面，厚度1cm。 问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光 光度计的样品池有什么异同？ （1）样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸 收池一样。 （ 2 ）吸收池的形状：紫外 - 可见分光光度计吸收 池两面透光， 荧光分光光度计样品池四面透光。 （3） 使用注意事项：波长范围、容易破碎、沾污 问题。
电子激发态的多重态 M=2S+1
（二）荧光的产生
内转换
S 2*
振动弛豫 系间跨越
内转换
S1*
能 量 吸 收 T1* 发 射 荧 光 外转换
T2* 发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l1
l2
l 2
l3
（二）荧光的产生
处于激发态的分子是不稳定的，它可通过辐射跃迁和非辐射 跃迁的形式释放多余能量而返回基态。 辐射跃迁主要涉及荧光、延迟荧光、磷光发射。 无辐射跃迁指以热的形式释放多余的能量，包括振动弛豫、 内部能量转换、体系间跨越、外部能量转换。 传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁
一、分子荧光的产生
（一）分子中电子能级的多重性 （二）荧光的产生 1、振动弛豫 2、内部能量转换 3、荧光发射 4、外部能量转换 5、体系间跨越 6、磷光发射
（一）分子中电子能级的多重性
电子的多重态是一种电子的运动状态，用M=2s+1表示，s为 各电子自旋量子数的代数和其值为0或1。 若分子中所有电子都是自旋配对的，则 s=0， M=1 ，该分子 处于单重态，用S表示。 大多数有机化合物分子的基态都处于单重态。
荧光素钠的乙醇溶液，在0℃以下，每降低10℃，φf增加3%，
在-80℃时，φf为1。
（三）pH值的影响
对酸碱型荧光物质，在不同的溶液pH下，荧光物质的存在
形式不同，因而具有不同的荧光。
（四）色散光的影响
散射光分为瑞利光和拉曼光。 瑞利光：指光子和物质分子相碰撞时，不发生能量的交换，光 子的频率并未改变，只是光子运动方向发生改变的散射光。 拉曼光：指光子和物质分子相碰撞时，有部分光子和物质分子 发生非弹性碰撞，在光子运动方向发生改变同时，光子把部分 能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量的交换，光子 频率发生改变的散射光。