第十一章荧光分析法
第十一章荧光分析法复习过程
第十一章 荧光分析法、选择题1．荧光分析法是通过测定 ( ) 而达到对物质的定性或定量分析。
A 、激发光 D 、散射光2．下面 ( )分析方法不属于分子发射光谱法。
3．荧光发射光谱含有 ()个发射带。
A 、 1B 、 2C 、 3 4．下列关于荧光光谱的叙述错误的是()A 、 荧光光谱的形状与激发光的波长无关B 、 荧光光谱与激发光谱一般是对称镜像C 、 荧光光谱属于分子的受激发射光谱D 、 荧光激发射光谱与紫外吸收光谱重合 5．下列叙述错误的是()A 、 荧光光谱的最长波长和激发光谱的最长波长相对应B 、 荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长相对应C 、 荧光光谱的形状与激发光波长无关D 、 荧光波长大于激发光波长6．激发态分子经过振动弛豫回到第一电子激发态的最低振动能级后，经系间窜越转移至激 发三重态， 再经振动弛豫降至三重态的最低振动能级， 然后发出光辐射跃迁至基态的各个振 动能级，这种光辐射称为 ()。
A 、分子荧光B 、分子磷光C 、瑞利散射光D 、拉曼散射光 7．关于振动弛豫，下列叙述中错误的是( )。
A 、振动弛豫只能在同一电子能级内进行B 、振动弛豫属于无辐射跃迁C 、通过振动弛豫可使处于不同电子激发态的分子均返回到第一电子激发态的最低振动 能级D 、振动弛豫是产生 Stokes 位移的原因之一 8．荧光寿命指的是 ( )。
A 、 从激发光开始照射到发射荧光的时间B 、 受激分子从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态所需的时间C 、 从除去激发光光源至分子的荧光熄灭所需的时间D 、 除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的 1/e 所需的时间9．关于荧光效率，下面叙述不正确的是()A 、 具有长共轭的 n~ ；跃迁的物质具有较大的荧光效率B 、 分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大C 、 顺式异构体的荧光效率大于反式异构体 学习资料D 、共轭体系上的取代基不同，对荧光效率的影响不同 10．采用下列 ()措施可使物质的荧光效率提高。
荧光分析法专题知识
续前
注：
➢ 处于激发态旳电子，经过振动弛豫和内部能量 转换，均回到第一激发态旳最低振动能级
过程：振动弛豫→内部能量互换→振动弛豫
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续前 3、体系间跨越（intersystem crossing)
过程：处于激发态旳电子自旋方向发生变化，而使电子能级旳 多重性发生变化旳过程
特点：激发单重态与激发三重态振动能级重叠时，产生体系间
1.分子产生荧光必须具有旳条件
（1）具有合适旳构造：构造中有共轭π→ π*产生旳K带，
能吸收紫外-可见光
（2）具有一定旳荧光效率（）： 荧光效率（）：
发射的光量子数
吸收的光量子数
➢荧光效率只能为0～1 ➢荧光效率低旳物质可能有强旳紫外吸收，但所吸收旳能量
以无辐射跃迁旳方式释放，不出现荧光发射；
2.分子构造对荧光旳关系 （1）跃迁类型：
三重态：两电子自旋方向相同，自旋量子数分别为 1 和 1
22
triplet state 总自旋量子数 S 1 1 1
22 多重性 M 3
续前 基态单重态S0
π*
激发单重态S*
π* π*
激发三重态T
能量
π
π
π
A
B
C
单重态和三重态电子分布
A：基态单重态 B：激发单重态 C：激发三重态
续前
跃迁类型旳比较
②吸电子基团引入，φ↓（-COOH，-NO2，-Cl 等）， 减弱共轭 程度
③影响不大：-SO3H，-NH3+，-R，对共轭体系作用较小
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续前
苯
λex=205nm λem=278nm Φf=0.11
萘
2m86n 3m21n 0.29
第十一章 分子发光―荧光、 磷光和化学发光光谱法Molecular .
已逐步形成一支在这个研究领域中的工作队伍，研究内
容2已020从/6/15经典的荧光分析方扩展到新近发展起来的新技术。
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§11－1 分子荧光和磷光光谱法
1．产生机理
在一般温度下，大多数分子处在基态的最低振动 能级。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化 学能或光能等到)后天激发为激发态。激发态是很 不稳定的，它得很快地释放出能量又重新跃迁回 基态。若分子返回基态时以发射的电磁辐射(即光) 的形式释放能量，就称为“发光”；如果物质的 分子吸收了光能而被激发，跃迁回基态所发射的 电磁辐射，称为荧光和磷光。现从分子结构理论 来讨论荧光和磷光的产生机理。
进入二十世纪以后，荧光现象被研究得更多了，在理论 或实验技术上都得到极大的发展。特别是随着激光、计 算机和电子学的新成就及技术的引入，大大推动了荧光 分析法在理论上及实验技术的发展，出现了许多新的理 论和新的方法。
在我国，二十世纪五十年代初期仅有极少数的分析工作
者从事荧光分析方面的研究工作。到了 下一张幻灯片
磷光也是某些物质受紫外光照射后产生的光。1944年 Lewis和Kasha提出了磷光与荧光的不同概念，指出磷光 是分子从亚稳的激发三重态跃迁回基态所发射出的光， 它有别于从激发单态跃迁回基态所发射的荧光。磷光分 析法由于其有某些特点，几十年来的理论研究及应用也 不断得到发展。
2020/6/15
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处于分子基态单重态的分子轨道上的电子，激发 时不能直接跃迁至第一激发三重态轨道上（不符 合光谱选择定则），但处于单重激发态的轨道上 的电子，可以通过体系跨越（系间窜跃），转移 到三重态轨道上；在这个过程中，处于激发态的 电子自旋发生变化，这个过程需要时间较长，故 处于三重激发态的寿命为10－4~1s；当其由三重激 发态的最低振动能级跃迁回基态时产生磷光。
第十一章 荧光分析方法
在某些情况下，电子在跃迁过程中还伴随着自 旋方向的改变，这时分子的两个电子的自旋方向 相同，自旋量子数都为1／2，总自旋量子数s等 于1，这时分子处于激发三重态(2s+1＝3)。 S0+hν→T1
6
激发单重态与激发三重态的区别：
激发单重态分子是抗磁性分子，激发三重 态分子是顺磁性分子；
激发单重态的平均寿命大约10-8s，激发三 重态的平均寿命大约10-4~1s； 电子由S0→S1，S2等的跃迁较容易，属于允 许跃迁。电子由S0→T1，T2等的跃迁较难发 生，属于禁阻跃迁。
23
（二）有机化合物分子结构与荧光的关系
能够发射荧光的物质同时具备两个条件：即有 强的紫外—可见吸收和一定的荧光效率。 1．长共扼结构 绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂 环、因为芳香环和杂环分子具有长共轭的π—π* 跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度(荧光效率) 越大，而荧光波长也长移。
24
31
5．散射光
当一束平行单色光照射在液体样
品上时，大部分光线透过溶液，小部分由于光
子与物质分子相碰撞，使光子的运功方向发生
改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。
光子和物质分子发生弹性碰撞时，发生能量
的交换，仅仅是光子运动方向发生改变，这种
散射光称为瑞利光。其波长与入射光波长相同。
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光子和物质分子发生非弹性碰撞时．在光子 运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发 生能量的交换，光子把部分能量转移给物质分 子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入 射光稍长或稍短的光，这种散射光称为拉曼光。 散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入 射光波长更长的拉曼光。
12
② 磷光(phosphorescence)发射：经过体系间跨越 的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动 能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活 一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出 光辐射，这种光辐射称为磷光。 T1→S0+hνp 磷光发射时间较长，约10-4-10s。 激发光停止后，磷光可持续一段时间。 电子由S0→T1为禁阻跃迁，需由S1经过体系间跨越 转化为T1。 同一分子的S1→S0 比T1→S0 的能级差大，磷光 的波长比荧光波长长
仪器分析课件12荧光分析法
ex = 356nm em = 404nm
f = 0.36
16
2. 分子的刚性
• 同样具有*跃迁的长共轭分子中，刚性分子 增加了共平面性， 越大， 长移。
f = 0.2
-O
O
COO-
C H2
f = 1.0
-O
O
O
COO- 荧光素钠
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原来不发生荧光的，如：8-羟基喹啉
消除干扰，提高选择性、灵敏度
脉冲激光
样品
干扰 组分
44
3. 同步荧光分析
固定，同时扫描激光光谱和发射光谱 若： = em - ex
Fsp = KcFem Fex 提高灵敏度和选择性
混合物的同步荧光光谱（ =3nm）
45
4. 胶束增敏荧光
CH3(CH2)11OSO3-Na+ 非极性疏水基团 极性亲水基团 增加溶解度 增加荧光效率 增加荧光的稳定性
• 荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法
荧光法
F=Kc
紫外法 A lg T lg I
I0
36
二、定量分析方法
1. 工作曲线法
用空白溶液调零 用标准溶液调满刻度
F cx
c1
c2 c3 c4 c5
20 40 60 80 100%
16 32 48 64 80%
37
2. 比例法（对比法）
光
强
荧光光谱 横坐标em， 度
纵坐标 发射光强度
400
500
(nm)
8
溶液荧光光谱通常具有如下特征
斯托克斯位移 荧光光谱的形状与激发波长无关 荧光光谱与激发光谱的镜像关系
第十一章荧光分析法.ppt
散射光干扰及消除
散射光：当一束平行光投射在液体试样上，大部分 被吸收或透过，小部分由于光子和物质分子相碰撞， 使光子的运动方向改变，而向不同方向散射形成的 光。
散射光包括瑞利散射光和拉曼光
瑞利散射光：无能量的交换，λ散射≈λ激发
拉曼光： 有能量转移， λ散射> <λ激发
干扰的消除
1）改变激发光的波长；
单色器1
样品池
单色器2
垂直方向
放大 与
记录
检测器
荧光仪特点
与分光光度计的主要差别
① 垂直测量方式, 消除透射光影响 ② 两个单色器，激发和发射，常用光栅
1 光源 A、白炽灯：钨灯、卤钨灯 B、气体放电灯：氢、氙、汞，
常用氙灯（波长： 250-700nm） C、激光光源 2 单色器
闪耀光栅
3 检测器 光电倍增管
5.弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成 强荧光衍生物以提高测量灵敏度。
故药物中的胺类、抗菌素、维生素、甾体类均可 用荧光法测定。该法在体内药物定量分析中应用甚 广。
思考题
• 1.荧光和磷光在产生机制上有什么不同？
• 2.何谓荧光量子效率？哪些结构物质有较高荧光效率？
• 3.以下物质中可能有最强荧光的物质是（ ）。
6.（）荧光光谱形状与激发光的波长无关。
7. 荧光光谱的特征？
1. 所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射 出比入射光( )。
A. 波长长的光线
B. 波长短的光线
C. 能量大的光线
D. 频率高的光线
2. 下列说法正确的是(
)
A 荧光发射波长永远大于激发波长
B 荧光发射波长永远小于激发波长
第十一章荧光分析法解析
1. 长共轭结构
能产生荧光的物质大都含有芳香环或杂环，或是长 共轭双键的脂肪烃
共轭效应增大了荧光物质的摩尔吸收系数，有利于 产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的产生
苯
lex 205nm lem 278nm
0.11
萘
lex 286nm lem 321nm
0.29
蒽
lex 356nm lem 404nm
内部能量转换 当两电子激发态能量相差较小以致其振动能级有重 叠时，受激分子由高电子能级转移致低电子能级的 过程。 （振动失活在同样多重态间进行，如S2* S1*）
术语
外部能量转换 激发态分子与溶剂或其它溶质碰撞，以热能的形 式释放能量的过程。
体系间跨越 处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的 多重性发生变化的过程，如S1* T1*
（2）溶液温度降低通常会使荧光效率 。 （3）在高浓度时荧光物质的浓度增加，荧光强度 。 （4）下列化合物中，哪种物质的荧光效率最大（ ）
A. 苯 B. 联苯 C. 萘 D. 芴 E.蒽 （5）下列说法中正确的是（ ）
A. 长共轭结构使得分子的荧光波长向短波方向移动。 B. 分子的刚性越强，荧光强度越小。 C. 给电子取代基可导致荧光增强。 D. 吸电子取代基可导致荧光增强。
3. 酸度
每一种荧光物质都有其最适宜的pH范围
S
O
3
- H+
S
O
3
p H = 6 .4 ~ 7 .4 OH
O-
无荧光
蓝色荧光
+ H+ p H = 4.8 ~3.4 NH2
蓝色荧光
N H 3+ 无荧光
苯胺在（ C）条件下荧光强度最强 A. pH=1 B. pH=3 C. pH=10 D. pH=13
第十一章 荧光分析法
第十一章荧光分析法一、选择题1．荧光分析法是通过测定( )而达到对物质的定性或定量分析。
A、激发光B、磷光C、发射光D、散射光2．下面( )分析方法不属于分子发射光谱法。
A、紫外一可见分光光度法B、荧光分析法C、磷光分析法D、化学发光分析法3．荧光发射光谱含有( )个发射带。
A、1B、2C、3D、不一定4．下列关于荧光光谱的叙述错误的是（）A、荧光光谱的形状与激发光的波长无关B、荧光光谱与激发光谱一般是对称镜像C、荧光光谱属于分子的受激发射光谱D、荧光激发射光谱与紫外吸收光谱重合5．下列叙述错误的是（）A、荧光光谱的最长波长和激发光谱的最长波长相对应B、荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长相对应C、荧光光谱的形状与激发光波长无关D、荧光波长大于激发光波长6．激发态分子经过振动弛豫回到第一电子激发态的最低振动能级后，经系间窜越转移至激发三重态，再经振动弛豫降至三重态的最低振动能级，然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能级，这种光辐射称为( )。
A、分子荧光B、分子磷光C、瑞利散射光D、拉曼散射光7．关于振动弛豫，下列叙述中错误的是( )。
A、振动弛豫只能在同一电子能级内进行B、振动弛豫属于无辐射跃迁C、通过振动弛豫可使处于不同电子激发态的分子均返回到第一电子激发态的最低振动能级D、振动弛豫是产生Stokes位移的原因之一8．荧光寿命指的是( )。
A、从激发光开始照射到发射荧光的时间B、受激分子从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态所需的时间C、从除去激发光光源至分子的荧光熄灭所需的时间D、除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1／e所需的时间9．关于荧光效率，下面叙述不正确的是（）A、具有长共轭的π→π﹡跃迁的物质具有较大的荧光效率B、分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大C、顺式异构体的荧光效率大于反式异构体D、共轭体系上的取代基不同，对荧光效率的影响不同10．采用下列( )措施可使物质的荧光效率提高。
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仪器分析
ECl≤0.05 F C
ECl >0.05 F 与C不成正比
荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法
荧光法
F
紫外法
A= - lgT = - lgI /I0
第十一章 荧光分析法
二、定量分析方法
仪器分析
1.标准曲线法 2.比例法（对比法）
用空白溶液调零 用标准溶液调满刻度
荧光熄灭剂 荧光自熄灭 瑞利散射 拉曼上式
仪器分析
第十一章 荧光分析法
选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰
仪器分析
溶剂
水 乙醇 环己烷 CCl4 CHCl3
激 发 光（nm） 248 313 365 405 436 271 350 416 469 511 267 344 409 459 500 267 344 408 458 499 —— 320 375 418 450 —— 346 410 461 502
第十一章 荧光分析法
仪器分析
第一节 基本原理
第十一章 荧光分析法
仪器分析
第十一章 荧光分析法
仪器分析
第十一章 荧光分析法
仪器分析
（二）激发光谱与发射光谱
excitation spectrum
横坐标ex，纵坐标 发射光强度
fluorescence spectrum
横坐标em，纵坐标 发射光强度
3.多组分分析—多组分分析
第十一章 荧光分析法
仪器分析
第三节 仪器与其他荧光分析技术
第十一章 荧光分析法
一、荧光分光光度计
滤光片荧光计 滤光片—单色器 荧光分光光度计
仪器分析
第十一章 荧光分析法
仪器的校正
仪器分析
灵敏度
以能被检出的最低信号来表示 在选定条件下用稳定荧光物质校正
波长
用汞灯标准谱线校正
第十一章 荧光分析法
仪器分析
第二节 荧光定量分析方法
第十一章 荧光分析法
一、荧光强度与物质浓度的关系
仪器分析
F=K’(I0-I) I=I010-ECL
F= K’I0(1-10-ECL) = K’I0(1-e-2.3ECL) 若c很小，Ecl ≤0.05 则
F=2.3K’I0Ecl=Kc
第十一章 荧光分析法
激发光谱和荧光光谱
双光束仪器时，误差可抵消
第十一章 荧光分析法
二、其他荧光分析技术简介
1.激光荧光分析 2.时间分辨荧光 3.同步荧光分析 4.胶束增敏荧光
仪器分析
溶液荧光ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 谱的特征
Stokes shift 荧光光谱的形状与激发波长无关 荧光光谱与激发光谱的镜像关系
第十一章 荧光分析法
二、荧光与分子结构
荧光寿命(f)和荧光效率 (f)
Ft = F0 e -t /f
ln F0
Ft
发射荧光的光子数
f=
吸收激发光的光子数
一般物质 f 0~1之间
仪器分析
第十一章 荧光分析法
有机化合物分子结构与荧光的关系 长共轭结构 刚性和共平面性 取代基
仪器分析
第十一章 荧光分析法
荧光试剂
荧光胺 Dansyl-Cl 邻苯二甲醛(OPA) 测定无机离子的荧光试剂
仪器分析
第十一章 荧光分析法
三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 pH值 荧光熄灭 散射光
极性溶剂 溶剂粘度