第十一章荧光分析法
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第十一章 分子发光―荧光、 磷光和化学发光光谱法Molecular .
已逐步形成一支在这个研究领域中的工作队伍，研究内
容2已020从/6/15经典的荧光分析方扩展到新近发展起来的新技术。
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§11－1 分子荧光和磷光光谱法
1．产生机理
在一般温度下，大多数分子处在基态的最低振动 能级。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化 学能或光能等到)后天激发为激发态。激发态是很 不稳定的，它得很快地释放出能量又重新跃迁回 基态。若分子返回基态时以发射的电磁辐射(即光) 的形式释放能量，就称为“发光”；如果物质的 分子吸收了光能而被激发，跃迁回基态所发射的 电磁辐射，称为荧光和磷光。现从分子结构理论 来讨论荧光和磷光的产生机理。
进入二十世纪以后，荧光现象被研究得更多了，在理论 或实验技术上都得到极大的发展。特别是随着激光、计 算机和电子学的新成就及技术的引入，大大推动了荧光 分析法在理论上及实验技术的发展，出现了许多新的理 论和新的方法。
在我国，二十世纪五十年代初期仅有极少数的分析工作
者从事荧光分析方面的研究工作。到了 下一张幻灯片
磷光也是某些物质受紫外光照射后产生的光。1944年 Lewis和Kasha提出了磷光与荧光的不同概念，指出磷光 是分子从亚稳的激发三重态跃迁回基态所发射出的光， 它有别于从激发单态跃迁回基态所发射的荧光。磷光分 析法由于其有某些特点，几十年来的理论研究及应用也 不断得到发展。
2020/6/15
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处于分子基态单重态的分子轨道上的电子，激发 时不能直接跃迁至第一激发三重态轨道上（不符 合光谱选择定则），但处于单重激发态的轨道上 的电子，可以通过体系跨越（系间窜跃），转移 到三重态轨道上；在这个过程中，处于激发态的 电子自旋发生变化，这个过程需要时间较长，故 处于三重激发态的寿命为10－4~1s；当其由三重激 发态的最低振动能级跃迁回基态时产生磷光。
第十一章 荧光分析方法
5
在某些情况下，电子在跃迁过程中还伴随着自 旋方向的改变，这时分子的两个电子的自旋方向 相同，自旋量子数都为1／2，总自旋量子数s等 于1，这时分子处于激发三重态(2s+1＝3)。 S0+hν→T1
6
激发单重态与激发三重态的区别：
激发单重态分子是抗磁性分子，激发三重 态分子是顺磁性分子；
激发单重态的平均寿命大约10-8s，激发三 重态的平均寿命大约10-4~1s； 电子由S0→S1，S2等的跃迁较容易，属于允 许跃迁。电子由S0→T1，T2等的跃迁较难发 生，属于禁阻跃迁。
23
（二）有机化合物分子结构与荧光的关系
能够发射荧光的物质同时具备两个条件：即有 强的紫外—可见吸收和一定的荧光效率。 1．长共扼结构 绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂 环、因为芳香环和杂环分子具有长共轭的π—π* 跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度(荧光效率) 越大，而荧光波长也长移。
24
31
5．散射光
当一束平行单色光照射在液体样
品上时，大部分光线透过溶液，小部分由于光
子与物质分子相碰撞，使光子的运功方向发生
改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。
光子和物质分子发生弹性碰撞时，发生能量
的交换，仅仅是光子运动方向发生改变，这种
散射光称为瑞利光。其波长与入射光波长相同。
32
光子和物质分子发生非弹性碰撞时．在光子 运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发 生能量的交换，光子把部分能量转移给物质分 子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入 射光稍长或稍短的光，这种散射光称为拉曼光。 散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入 射光波长更长的拉曼光。
12
② 磷光(phosphorescence)发射：经过体系间跨越 的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动 能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活 一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出 光辐射，这种光辐射称为磷光。 T1→S0+hνp 磷光发射时间较长，约10-4-10s。 激发光停止后，磷光可持续一段时间。 电子由S0→T1为禁阻跃迁，需由S1经过体系间跨越 转化为T1。 同一分子的S1→S0 比T1→S0 的能级差大，磷光 的波长比荧光波长长
在某些情况下，电子在跃迁过程中还伴随着自 旋方向的改变，这时分子的两个电子的自旋方向 相同，自旋量子数都为1／2，总自旋量子数s等 于1，这时分子处于激发三重态(2s+1＝3)。 S0+hν→T1
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激发单重态与激发三重态的区别：
激发单重态分子是抗磁性分子，激发三重 态分子是顺磁性分子；
激发单重态的平均寿命大约10-8s，激发三 重态的平均寿命大约10-4~1s； 电子由S0→S1，S2等的跃迁较容易，属于允 许跃迁。电子由S0→T1，T2等的跃迁较难发 生，属于禁阻跃迁。
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（二）有机化合物分子结构与荧光的关系
能够发射荧光的物质同时具备两个条件：即有 强的紫外—可见吸收和一定的荧光效率。 1．长共扼结构 绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂 环、因为芳香环和杂环分子具有长共轭的π—π* 跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度(荧光效率) 越大，而荧光波长也长移。
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31
5．散射光
当一束平行单色光照射在液体样
品上时，大部分光线透过溶液，小部分由于光
子与物质分子相碰撞，使光子的运功方向发生
改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。
光子和物质分子发生弹性碰撞时，发生能量
的交换，仅仅是光子运动方向发生改变，这种
散射光称为瑞利光。其波长与入射光波长相同。
32
光子和物质分子发生非弹性碰撞时．在光子 运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发 生能量的交换，光子把部分能量转移给物质分 子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入 射光稍长或稍短的光，这种散射光称为拉曼光。 散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入 射光波长更长的拉曼光。
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② 磷光(phosphorescence)发射：经过体系间跨越 的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动 能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活 一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出 光辐射，这种光辐射称为磷光。 T1→S0+hνp 磷光发射时间较长，约10-4-10s。 激发光停止后，磷光可持续一段时间。 电子由S0→T1为禁阻跃迁，需由S1经过体系间跨越 转化为T1。 同一分子的S1→S0 比T1→S0 的能级差大，磷光 的波长比荧光波长长
仪器分析课件12荧光分析法
f = 0.29
ex = 356nm em = 404nm
f = 0.36
16
2. 分子的刚性
• 同样具有*跃迁的长共轭分子中，刚性分子 增加了共平面性， 越大， 长移。
f = 0.2
-O
O
COO-
C H2
f = 1.0
-O
O
O
COO- 荧光素钠
17
原来不发生荧光的，如：8-羟基喹啉
消除干扰，提高选择性、灵敏度
脉冲激光
样品
干扰 组分
44
3. 同步荧光分析
固定，同时扫描激光光谱和发射光谱 若： = em - ex
Fsp = KcFem Fex 提高灵敏度和选择性
混合物的同步荧光光谱（ =3nm）
45
4. 胶束增敏荧光
CH3(CH2)11OSO3-Na+ 非极性疏水基团 极性亲水基团 增加溶解度 增加荧光效率 增加荧光的稳定性
• 荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法
荧光法
F=Kc
紫外法 A lg T lg I
I0
36
二、定量分析方法
1. 工作曲线法
用空白溶液调零 用标准溶液调满刻度
F cx
c1
c2 c3 c4 c5
20 40 60 80 100%
16 32 48 64 80%
37
2. 比例法（对比法）
光
强
荧光光谱 横坐标em， 度
纵坐标 发射光强度
400
500
(nm)
8
溶液荧光光谱通常具有如下特征
斯托克斯位移 荧光光谱的形状与激发波长无关 荧光光谱与激发光谱的镜像关系
ex = 356nm em = 404nm
f = 0.36
16
2. 分子的刚性
• 同样具有*跃迁的长共轭分子中，刚性分子 增加了共平面性， 越大， 长移。
f = 0.2
-O
O
COO-
C H2
f = 1.0
-O
O
O
COO- 荧光素钠
17
原来不发生荧光的，如：8-羟基喹啉
消除干扰，提高选择性、灵敏度
脉冲激光
样品
干扰 组分
44
3. 同步荧光分析
固定，同时扫描激光光谱和发射光谱 若： = em - ex
Fsp = KcFem Fex 提高灵敏度和选择性
混合物的同步荧光光谱（ =3nm）
45
4. 胶束增敏荧光
CH3(CH2)11OSO3-Na+ 非极性疏水基团 极性亲水基团 增加溶解度 增加荧光效率 增加荧光的稳定性
• 荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法
荧光法
F=Kc
紫外法 A lg T lg I
I0
36
二、定量分析方法
1. 工作曲线法
用空白溶液调零 用标准溶液调满刻度
F cx
c1
c2 c3 c4 c5
20 40 60 80 100%
16 32 48 64 80%
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2. 比例法（对比法）
光
强
荧光光谱 横坐标em， 度
纵坐标 发射光强度
400
500
(nm)
8
溶液荧光光谱通常具有如下特征
斯托克斯位移 荧光光谱的形状与激发波长无关 荧光光谱与激发光谱的镜像关系
第十一章荧光分析法.ppt
散射光干扰及消除
散射光：当一束平行光投射在液体试样上，大部分 被吸收或透过，小部分由于光子和物质分子相碰撞， 使光子的运动方向改变，而向不同方向散射形成的 光。
散射光包括瑞利散射光和拉曼光
瑞利散射光：无能量的交换，λ散射≈λ激发
拉曼光： 有能量转移， λ散射> <λ激发
干扰的消除
1）改变激发光的波长；
单色器1
样品池
单色器2
垂直方向
放大 与
记录
检测器
荧光仪特点
与分光光度计的主要差别
① 垂直测量方式, 消除透射光影响 ② 两个单色器，激发和发射，常用光栅
1 光源 A、白炽灯：钨灯、卤钨灯 B、气体放电灯：氢、氙、汞，
常用氙灯（波长： 250-700nm） C、激光光源 2 单色器
闪耀光栅
3 检测器 光电倍增管
5.弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成 强荧光衍生物以提高测量灵敏度。
故药物中的胺类、抗菌素、维生素、甾体类均可 用荧光法测定。该法在体内药物定量分析中应用甚 广。
思考题
• 1.荧光和磷光在产生机制上有什么不同？
• 2.何谓荧光量子效率？哪些结构物质有较高荧光效率？
• 3.以下物质中可能有最强荧光的物质是（ ）。
6.（）荧光光谱形状与激发光的波长无关。
7. 荧光光谱的特征？
1. 所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射 出比入射光( )。
A. 波长长的光线
B. 波长短的光线
C. 能量大的光线
D. 频率高的光线
2. 下列说法正确的是(
)
A 荧光发射波长永远大于激发波长
B 荧光发射波长永远小于激发波长
荧光分析法ppt课件
特点：发生在激发态的最低振动能级和基态之间；所需时间约 为10-7～10-9秒。
结果：导致荧光或磷光减弱，甚至熄灭
或
19
续前
返回2 返2回0
11.2.2 激发光谱与发射（荧光）光谱
——荧光物质分子的两个特征光谱
发射波长
激发波长
激发光谱(excitation spectrum)： F~ ex 荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ em
3
续前 荧光分析法分类：根据光源不同进行分类
激发光源
紫外－可见光
X射线
原子特征谱线
荧光分析法
分子荧光法（Molecular Fluorometry) X射线荧光法（X-ray Fluorometry) 原子荧光法（Atomic Fluorometry)
荧光分析法与可见紫外吸收光谱比较
相同点
本质
不同点
过程：当两个电子的能级非常靠近，以致其振动能级有重叠 时，电子常常由高电子能级以非辐射跃迁方式转移至低 电子能级，这种过程称为内部能量转换
特点：发生在非常靠近的两个电子能级间，他们的振动能级有 重叠；时间约10-1～10-13秒。
或
11
续前
注：
➢ 处于激发态的电子，通过振动弛豫和内部能量 转换，均回到第一激发态的最低振动能级
➢激发光谱与荧光光谱上的λmax是定性定量的依据
荧光
磷光
9
续前 1、振动弛豫（vibrational relexation）
过程：从电子激发态的某一振动能级以非辐射跃迁的方式， 回到同一电子激发态的最低振动能级的过程为振动驰豫
特点：发生在同一个电子能级内不同振动能级间的跃迁；时 间约10-12秒。
结果：导致荧光或磷光减弱，甚至熄灭
或
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续前
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11.2.2 激发光谱与发射（荧光）光谱
——荧光物质分子的两个特征光谱
发射波长
激发波长
激发光谱(excitation spectrum)： F~ ex 荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ em
3
续前 荧光分析法分类：根据光源不同进行分类
激发光源
紫外－可见光
X射线
原子特征谱线
荧光分析法
分子荧光法（Molecular Fluorometry) X射线荧光法（X-ray Fluorometry) 原子荧光法（Atomic Fluorometry)
荧光分析法与可见紫外吸收光谱比较
相同点
本质
不同点
过程：当两个电子的能级非常靠近，以致其振动能级有重叠 时，电子常常由高电子能级以非辐射跃迁方式转移至低 电子能级，这种过程称为内部能量转换
特点：发生在非常靠近的两个电子能级间，他们的振动能级有 重叠；时间约10-1～10-13秒。
或
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续前
注：
➢ 处于激发态的电子，通过振动弛豫和内部能量 转换，均回到第一激发态的最低振动能级
➢激发光谱与荧光光谱上的λmax是定性定量的依据
荧光
磷光
9
续前 1、振动弛豫（vibrational relexation）
过程：从电子激发态的某一振动能级以非辐射跃迁的方式， 回到同一电子激发态的最低振动能级的过程为振动驰豫
特点：发生在同一个电子能级内不同振动能级间的跃迁；时 间约10-12秒。
第十一章荧光分析法解析
1. 长共轭结构
能产生荧光的物质大都含有芳香环或杂环，或是长 共轭双键的脂肪烃
共轭效应增大了荧光物质的摩尔吸收系数，有利于 产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的产生
苯
lex 205nm lem 278nm
0.11
萘
lex 286nm lem 321nm
0.29
蒽
lex 356nm lem 404nm
内部能量转换 当两电子激发态能量相差较小以致其振动能级有重 叠时，受激分子由高电子能级转移致低电子能级的 过程。 （振动失活在同样多重态间进行，如S2* S1*）
术语
外部能量转换 激发态分子与溶剂或其它溶质碰撞，以热能的形 式释放能量的过程。
体系间跨越 处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的 多重性发生变化的过程，如S1* T1*
（2）溶液温度降低通常会使荧光效率 。 （3）在高浓度时荧光物质的浓度增加，荧光强度 。 （4）下列化合物中，哪种物质的荧光效率最大（ ）
A. 苯 B. 联苯 C. 萘 D. 芴 E.蒽 （5）下列说法中正确的是（ ）
A. 长共轭结构使得分子的荧光波长向短波方向移动。 B. 分子的刚性越强，荧光强度越小。 C. 给电子取代基可导致荧光增强。 D. 吸电子取代基可导致荧光增强。
3. 酸度
每一种荧光物质都有其最适宜的pH范围
S
O
3
- H+
S
O
3
p H = 6 .4 ~ 7 .4 OH
O-
无荧光
蓝色荧光
+ H+ p H = 4.8 ~3.4 NH2
蓝色荧光
N H 3+ 无荧光
苯胺在（ C）条件下荧光强度最强 A. pH=1 B. pH=3 C. pH=10 D. pH=13
第十一章 荧光分析法
第十一章荧光分析法一、选择题1．荧光分析法是通过测定( )而达到对物质的定性或定量分析。
A、激发光B、磷光C、发射光D、散射光2．下面( )分析方法不属于分子发射光谱法。
A、紫外一可见分光光度法B、荧光分析法C、磷光分析法D、化学发光分析法3．荧光发射光谱含有( )个发射带。
A、1B、2C、3D、不一定4．下列关于荧光光谱的叙述错误的是（）A、荧光光谱的形状与激发光的波长无关B、荧光光谱与激发光谱一般是对称镜像C、荧光光谱属于分子的受激发射光谱D、荧光激发射光谱与紫外吸收光谱重合5．下列叙述错误的是（）A、荧光光谱的最长波长和激发光谱的最长波长相对应B、荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长相对应C、荧光光谱的形状与激发光波长无关D、荧光波长大于激发光波长6．激发态分子经过振动弛豫回到第一电子激发态的最低振动能级后，经系间窜越转移至激发三重态，再经振动弛豫降至三重态的最低振动能级，然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能级，这种光辐射称为( )。
A、分子荧光B、分子磷光C、瑞利散射光D、拉曼散射光7．关于振动弛豫，下列叙述中错误的是( )。
A、振动弛豫只能在同一电子能级内进行B、振动弛豫属于无辐射跃迁C、通过振动弛豫可使处于不同电子激发态的分子均返回到第一电子激发态的最低振动能级D、振动弛豫是产生Stokes位移的原因之一8．荧光寿命指的是( )。
A、从激发光开始照射到发射荧光的时间B、受激分子从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态所需的时间C、从除去激发光光源至分子的荧光熄灭所需的时间D、除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1／e所需的时间9．关于荧光效率，下面叙述不正确的是（）A、具有长共轭的π→π﹡跃迁的物质具有较大的荧光效率B、分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大C、顺式异构体的荧光效率大于反式异构体D、共轭体系上的取代基不同，对荧光效率的影响不同10．采用下列( )措施可使物质的荧光效率提高。
分析化学 第十一章 荧光分析法
h
29
㈡环境因素
荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的 影响。适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的 灵敏度和选择性。 ⑴溶剂效应 ①溶剂的极性：
溶剂的极性增大，π→π＊跃迁的能量减小，红 移。 ②溶剂的粘度
溶剂的粘度降低，分子间碰撞机会增加，无辐 射跃迁几率增加，荧光减弱。
h
30
⑵温度的影响
激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相 互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。
外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因该
过程发光强度减弱或消失，该现象称为“猝灭” 或
“熄灭”。
h
10
⑸体系间跨越 系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁
该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多 重性发生变化的结果。
当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几 率增大。
的吸收(或激发)光谱的波长长。荧光发射这种波长 位移的现象称为Stokes位移。
原因：处于激发态的分子一方面由于振动弛豫 等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用 使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的 位移。
Stokes位移表明在荧光激发和发射之间所产生 的能量损失。（见P220图11-3）
①对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言， 溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的 影响。 如：在pH7～12的溶液中，苯胺以分子形式存 在，产生蓝色荧光；
当pH＜3、 pH＞13时，苯胺以阳离子、 阴离子形式存在，均无荧光。 ②溶液的pH也影响金属配合物的荧光性质。
h
32
⑷荧光猝灭
荧光猝灭：荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互 作用，使荧光强度减弱的作用。
F0/eF0eKf
则K= 1/τf，将其带入 Ft F0eKt
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或
13
内转换 S2
S1 能 量
吸 收
S0
l1
l2
振动弛豫 内转换 振动弛豫
注：
处于激发态的电子，通过振动弛豫和内部能量 转换，均回到第一激发态的最低振动能级
过程：振动弛豫→内部能量交换→振动弛豫
15
（3）荧光（fluorescence）
过程：电子由单重态的第一激发态最低振动能级跃迁 到基态的任一振动能级而发射的光量子为荧光
荧光寿命：除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最 大荧光强度的1/e所需要的时间
荧光量子产率（）：
发射的光子数
吸收的光子数
如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为 100%。 物质的荧光量子产率范围一般是多少?
二、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
所需能量
大
自旋方向 跃迁几率
不变 接近于1
基态→激发三重态T* 小 改变
10－6（光学禁阻）
8
2、荧光的产生
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
量
发
吸
射
收
荧
光
S0
l1
l2 l3
外转换
l4
T1 T2 发 射 磷 振动弛豫 光
9
激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
第十一章 荧光分析法
药物分析教研室
主要内容
第一节 第二节 第三节
荧光分析法的基本原理 荧光定量分析方法 荧光分光光度计和其他荧光分析技术
2
概述
某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，
发射出比原来所吸收光的波长更长的光——光致发光
（二级光）。
荧光 luorescence
光致发光
磷光phosphorescence
singlet state
总自旋量子数 S 1 ( 1) 0 22
(S)
多重性 M 1
三重态：两电子自旋方向相同， 自旋量子数分别为 1 和 1 22
triplet state 总自旋量子数 S 1 1 1 22 (T) 多重性 M 3 6
跃迁类型的比较
跃迁类型 基态→激发单重态S*
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
量
发
吸
射
收
荧
光
S0
l1
l2 l3
外转换
l4
T1 T2 振动弛豫
影响体系间跨越几率增大的因素：
含重原子的分子（如碘、溴等），体系间跨越最为常见。 原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运 动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反 转的发生。
在溶液中存在氧分子等，这些顺磁性物质也能增加体 系间跨越的发生几率。
F = K’(I0 – It)
K ’：取决于荧光效率f
荧光光谱 散射光谱
40
能用荧光分析法测定的有机物包括多环胺类、萘酚类、嘌啉类、 吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质 等；药物中的生物碱类如麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类 及异喹啉类生物碱等；甾体类如皮质激素及雌醇等；抗生素类如青 霉素、四环素等；维生素类如维生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗 坏血酸、叶酸及烟酰胺等。此外，中草药中的许多有效成分，不少 是属于芳香性结构的大分子杂环类，都能产生荧光，可用荧光分析 法作初步鉴别及含量测定。荧光分析法的灵敏度高，选择性较好， 取样量少，方法快速，已成为医药学、生物学、农业和工业等领域 进行科学研究工作的重要手段之一。以下是几个重要的荧光试剂：
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转移 外转移 振动弛豫
荧光：10-7～10-9s，第一激发单重态的最低振动能级→基态
磷光：10-4～10s； 第一激发三重态的最低振动能级→基态
10
（1）振动弛豫（vibrational relexation）
过程：激发态分子通过与溶剂分子碰撞而将部分能量传 递给溶剂分子，其电子由同一电子能级激发态的较高振 动能级回到最低振动能级的过程。 特点：发生在同一个电子能级内不同振动能级间的跃迁； 时间约10-12秒。
过程：如果分子在溶液中被激发，激发分子之间、分 子与溶剂之间会发生碰撞而失去能量，这种非辐射跃 迁的过程称为外部能量转换 特点：发生在激发态的最低振动能级和基态之间；所 需时间约为10-7～10-9秒。 结果：导致荧光或磷光减弱，甚至熄灭
18
内转换
振动弛豫 内转换
S2
S1
能
量
发
吸
射
收
荧
光
S0
l1
l2 l3
瑞利光:光子和物质发生弹性磁撞时，不发生能量交换，仅光子方 向改变，这种散射光称为瑞利光。其波长与入射光相同。
拉曼光:光子和物质发生非弹性磁撞，光子改变方向同时，与物质 有能量交换，散射光波长有所改变，增大或减小，这种散 射光为拉曼光。 波长增大的拉曼光对荧光测定有干扰
39
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与散射光谱(b)
λ激发＜ λ荧光＜ λ磷光
10-9~10-7秒
10-4~10秒
25
（二） 激发光谱与发射（荧光）光谱
——荧光物质分子的两个特征光谱
发射波长
激发波长
激发光谱(excitation spectrum)： F~ lex 荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ lem
26
激发（光谱二：）（激与吸发收光光谱谱类与似荧）光表示光不谱同激发波长的辐射引起
即磷光波长 > 荧光波长 > 激
发波长
23
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
量
发
吸
射
收
荧
光
S0
l1
l2 l3
外转换
l4
T1 T2 发 射 磷 振动弛豫 光
24
荧光与磷光的比较
跃迁
荧光
激发单重态 最低振动能级→基态
磷光
激发三重态 最低振动能级→基态
光电子能量
E激发＞ E荧光＞E磷光
波长 发射时间
常见的熄灭剂有：卤素离子、重金属离子、氧分子
37
熄灭机理： a碰撞失去能量 b生成不发光的配合物 c溶解氧的存在使荧光物质氧化或氧分子的顺磁性 使激发单重态分子转变为三重态 d浓度较大，自熄灭现象
38
5、散射光的干扰 散射光:当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液，
小部分光线由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方 向发生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。
molecular fluorescence （一）分子荧光的产生
1、分子的电子能级与被激发过程 分子的能级包括：电子能级（10ev）、振动能级 (0.1ev)及转动能级(0.001ev)
5
1、分子的电子能级与被激发过程
电子能级的多重性M:M=2S+1；S为总自旋 量子数
单重态： 两电子自旋方向相反， 自旋量子数分别为 1 和 1 22
bb4b3b2 1b0
cc0 1c2c3c4
ν=4
ν=3 ν=2 ν=1 ν=0
ΔΔEΔE4EΔ32E
蒽的能级跃1 迁图
S0
29
二、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
荧光寿命(f)和荧光效率 (f)
射跃迁↑ 2、溶剂：
①溶剂介电常数↑，极性↑， π →π * Δ E↓,φ f↑， λ↑
②溶剂粘度σ ↑ ，φf ↑
36
3、pH影响
给电子基团
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；
4、荧光熄灭剂的影响 荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧 光强度降低或熄灭的现象。引起荧光熄灭的物质为荧 光熄灭剂
（3）荧光光谱与激发光谱的镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一 样）成镜像对称关系。
28
镜像关系的原因
由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常荧光
光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。
ν=4
ν=3 ν=2
ν=1 ν=0
ΔΔEΔE4ΔE3E2 1
S* 1
蒽的激发光谱和荧光光谱
丹酰肼—可的松的羰基 λex=365nm ,λem=500nm 4）无机离子—具有π电子结构的有机化合物
35
三、影响荧光强度的外部因素
relation between fluorescence and molecular structure
1、温度：低温，φ f↑。 原因：温度T↑，分子运动加快， 磁撞几率↑无辐
22
（6）磷光（phosporescence）
过程：电子由三重态的第一激发态最低振动能级跃迁 到基态的任一振动能级而发射的光量子为磷光
特点：发生在激发三重态最低振动能级与基态之间。 分子在三重态的最低振动能级上可以存活一段时间， 发射时间约为10-4～10 s。
注：
发射磷光的能量比荧光的能量 小，l2>l1 > l0
41
第二节 荧光定量分析方法
一、荧光强度与物质浓度的关系
当一束强度为I0的紫外/可见光照射一浓度为c
、液层厚度为l的液槽时，可在溶液的各个方向观
察到荧光，其
13
内转换 S2
S1 能 量
吸 收
S0
l1
l2
振动弛豫 内转换 振动弛豫
注：
处于激发态的电子，通过振动弛豫和内部能量 转换，均回到第一激发态的最低振动能级
过程：振动弛豫→内部能量交换→振动弛豫
15
（3）荧光（fluorescence）
过程：电子由单重态的第一激发态最低振动能级跃迁 到基态的任一振动能级而发射的光量子为荧光
荧光寿命：除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最 大荧光强度的1/e所需要的时间
荧光量子产率（）：
发射的光子数
吸收的光子数
如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为 100%。 物质的荧光量子产率范围一般是多少?
二、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
所需能量
大
自旋方向 跃迁几率
不变 接近于1
基态→激发三重态T* 小 改变
10－6（光学禁阻）
8
2、荧光的产生
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
量
发
吸
射
收
荧
光
S0
l1
l2 l3
外转换
l4
T1 T2 发 射 磷 振动弛豫 光
9
激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
第十一章 荧光分析法
药物分析教研室
主要内容
第一节 第二节 第三节
荧光分析法的基本原理 荧光定量分析方法 荧光分光光度计和其他荧光分析技术
2
概述
某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，
发射出比原来所吸收光的波长更长的光——光致发光
（二级光）。
荧光 luorescence
光致发光
磷光phosphorescence
singlet state
总自旋量子数 S 1 ( 1) 0 22
(S)
多重性 M 1
三重态：两电子自旋方向相同， 自旋量子数分别为 1 和 1 22
triplet state 总自旋量子数 S 1 1 1 22 (T) 多重性 M 3 6
跃迁类型的比较
跃迁类型 基态→激发单重态S*
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
量
发
吸
射
收
荧
光
S0
l1
l2 l3
外转换
l4
T1 T2 振动弛豫
影响体系间跨越几率增大的因素：
含重原子的分子（如碘、溴等），体系间跨越最为常见。 原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运 动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反 转的发生。
在溶液中存在氧分子等，这些顺磁性物质也能增加体 系间跨越的发生几率。
F = K’(I0 – It)
K ’：取决于荧光效率f
荧光光谱 散射光谱
40
能用荧光分析法测定的有机物包括多环胺类、萘酚类、嘌啉类、 吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质 等；药物中的生物碱类如麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类 及异喹啉类生物碱等；甾体类如皮质激素及雌醇等；抗生素类如青 霉素、四环素等；维生素类如维生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗 坏血酸、叶酸及烟酰胺等。此外，中草药中的许多有效成分，不少 是属于芳香性结构的大分子杂环类，都能产生荧光，可用荧光分析 法作初步鉴别及含量测定。荧光分析法的灵敏度高，选择性较好， 取样量少，方法快速，已成为医药学、生物学、农业和工业等领域 进行科学研究工作的重要手段之一。以下是几个重要的荧光试剂：
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转移 外转移 振动弛豫
荧光：10-7～10-9s，第一激发单重态的最低振动能级→基态
磷光：10-4～10s； 第一激发三重态的最低振动能级→基态
10
（1）振动弛豫（vibrational relexation）
过程：激发态分子通过与溶剂分子碰撞而将部分能量传 递给溶剂分子，其电子由同一电子能级激发态的较高振 动能级回到最低振动能级的过程。 特点：发生在同一个电子能级内不同振动能级间的跃迁； 时间约10-12秒。
过程：如果分子在溶液中被激发，激发分子之间、分 子与溶剂之间会发生碰撞而失去能量，这种非辐射跃 迁的过程称为外部能量转换 特点：发生在激发态的最低振动能级和基态之间；所 需时间约为10-7～10-9秒。 结果：导致荧光或磷光减弱，甚至熄灭
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内转换
振动弛豫 内转换
S2
S1
能
量
发
吸
射
收
荧
光
S0
l1
l2 l3
瑞利光:光子和物质发生弹性磁撞时，不发生能量交换，仅光子方 向改变，这种散射光称为瑞利光。其波长与入射光相同。
拉曼光:光子和物质发生非弹性磁撞，光子改变方向同时，与物质 有能量交换，散射光波长有所改变，增大或减小，这种散 射光为拉曼光。 波长增大的拉曼光对荧光测定有干扰
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硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与散射光谱(b)
λ激发＜ λ荧光＜ λ磷光
10-9~10-7秒
10-4~10秒
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（二） 激发光谱与发射（荧光）光谱
——荧光物质分子的两个特征光谱
发射波长
激发波长
激发光谱(excitation spectrum)： F~ lex 荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ lem
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激发（光谱二：）（激与吸发收光光谱谱类与似荧）光表示光不谱同激发波长的辐射引起
即磷光波长 > 荧光波长 > 激
发波长
23
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
量
发
吸
射
收
荧
光
S0
l1
l2 l3
外转换
l4
T1 T2 发 射 磷 振动弛豫 光
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荧光与磷光的比较
跃迁
荧光
激发单重态 最低振动能级→基态
磷光
激发三重态 最低振动能级→基态
光电子能量
E激发＞ E荧光＞E磷光
波长 发射时间
常见的熄灭剂有：卤素离子、重金属离子、氧分子
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熄灭机理： a碰撞失去能量 b生成不发光的配合物 c溶解氧的存在使荧光物质氧化或氧分子的顺磁性 使激发单重态分子转变为三重态 d浓度较大，自熄灭现象
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5、散射光的干扰 散射光:当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液，
小部分光线由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方 向发生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。
molecular fluorescence （一）分子荧光的产生
1、分子的电子能级与被激发过程 分子的能级包括：电子能级（10ev）、振动能级 (0.1ev)及转动能级(0.001ev)
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1、分子的电子能级与被激发过程
电子能级的多重性M:M=2S+1；S为总自旋 量子数
单重态： 两电子自旋方向相反， 自旋量子数分别为 1 和 1 22
bb4b3b2 1b0
cc0 1c2c3c4
ν=4
ν=3 ν=2 ν=1 ν=0
ΔΔEΔE4EΔ32E
蒽的能级跃1 迁图
S0
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二、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
荧光寿命(f)和荧光效率 (f)
射跃迁↑ 2、溶剂：
①溶剂介电常数↑，极性↑， π →π * Δ E↓,φ f↑， λ↑
②溶剂粘度σ ↑ ，φf ↑
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3、pH影响
给电子基团
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；
4、荧光熄灭剂的影响 荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧 光强度降低或熄灭的现象。引起荧光熄灭的物质为荧 光熄灭剂
（3）荧光光谱与激发光谱的镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一 样）成镜像对称关系。
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镜像关系的原因
由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常荧光
光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。
ν=4
ν=3 ν=2
ν=1 ν=0
ΔΔEΔE4ΔE3E2 1
S* 1
蒽的激发光谱和荧光光谱
丹酰肼—可的松的羰基 λex=365nm ,λem=500nm 4）无机离子—具有π电子结构的有机化合物
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三、影响荧光强度的外部因素
relation between fluorescence and molecular structure
1、温度：低温，φ f↑。 原因：温度T↑，分子运动加快， 磁撞几率↑无辐
22
（6）磷光（phosporescence）
过程：电子由三重态的第一激发态最低振动能级跃迁 到基态的任一振动能级而发射的光量子为磷光
特点：发生在激发三重态最低振动能级与基态之间。 分子在三重态的最低振动能级上可以存活一段时间， 发射时间约为10-4～10 s。
注：
发射磷光的能量比荧光的能量 小，l2>l1 > l0
41
第二节 荧光定量分析方法
一、荧光强度与物质浓度的关系
当一束强度为I0的紫外/可见光照射一浓度为c
、液层厚度为l的液槽时，可在溶液的各个方向观
察到荧光，其