酶工程第6章酶的结构与功能

差示标记法
胰蛋白酶的差示标记
胰蛋白酶催化碱性氨基酸的羧基形成的肽键水 解。人们认为在胰蛋白酶的活性中心必有酸性基团 存在。ψ胰蛋白酶（Lys6-Ile7之间断裂成为β胰蛋 白 酶 ； Lys6-Ile7 和 Lys131-Ser132 两 处 断 裂 成 为 α 胰 蛋 白 酶 ； Lys6-Ile7 、 Lys131-Ser132 和 Lys176Asp177三处断裂成为ψ胰蛋白酶）失去了水解碱 性氨基酸的羧基形成的肽键的能力，而保留了一般 的酯酶活性，估计Asp177的β－COOH可能与结 合底物有关（与底物中的碱性氨基酸结合）。
羧肽酶A活性中心的结构
羧肽酶A催化多肽链上羧基端氨基酸的水解。 当末端氨基酸是含有较大疏水基团的氨基酸时 （苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸），反 应速度很快。但是当有这些较大疏水基团的氨基 酸残基进入亚位点3～6时，就会减低酶对这些底 物的亲和力。说明羧肽酶A对底物的识别和结合 有多个位点。同时，苯丙氨酸是羧肽酶A的竞争 性抑制剂。
各种类型残基举例
接触残基： R1、R2、R6、 R8 、 R9 、 R163 、 R164 、
R165
非贡献残基： R3、R5、R7
辅助残基： R4
结构残基 ： R10、R162、 R169
2．酶活性中心的拓扑学
酶的活性中心可以设想为一个口袋或是一条 沟槽，形状与底物相近。不同的酶的口袋适合不 同的底物。口袋中有相应的结合残基与底物上的 某些基团结合，发生反应的底物上的键与催化基 团靠近。亲水基团与亲水残基亲合，疏水基团与 疏水残基亲合，带电荷的基团与带相反电荷的残 基亲合。
酶活性中心基团的确定
同位素标记活性中心基团后，用蛋白酶部分 水解，得到同位素标记的肽段，分析其氨基酸顺 序，可以了解活性中心附近的氨基酸顺序。
实验表明，同类酶不仅有相同的活性中心基 团，而且附近的氨基酸顺序也很相似。
一些丝氨酸蛋白酶活性中心 丝氨酸附近的肽链组成
* 表示有催化活性的丝氨酸残基
一些半胱氨酸蛋白酶活性 中心的半胱氨酸残基附近
第六章 酶的结构和功能
一、酶的活性中心 二、酶活性中心化学基团的鉴定 三、组成酶活性中心的重要化学基团 四、酶促化学修饰和酶活性调节 五、酶的空间结构与功能的关系 六、酶催化作用的机制 七、羧肽酶A催化作用的机制
一、酶的活性中心
1．酶的活性中心和必需基团的概念 在酶蛋白中，只有少数特异的氨基酸残基与催 化活性直接相关。这些特异的氨基酸残基可以在肽 链的一级结构上相距较远，但通过肽链的折叠、盘 旋，使它们在空间上接近，形成活性中心（或称活 性部位）。组成活性中心的氨基酸残基有些执行结 合底物的任务，有些执行催化反应的任务。我们把 组成活性中心的氨基酸残基的侧链基团及一些维持 整个酶分子构象所必需的侧链基团称为必需基团。
的氨基酸顺序
* 表示有催化活性的半胱氨酸残基
四、酶促化学修饰和 酶活性调节
前述化学修饰是人工所为，本节介绍的 是天然过程。
1．酶原的激活
(1)酶原 生物体内大多数酶当它们自发地（有些在分
子伴侣的指导协助下）折叠成特定的三维结构时， 即获得了全部酶活力。也有一些酶刚合成出来是 没有活性的前体，称为酶原。当酶原在特定的 （体内）位置被水解断裂一个和一些肽键，就成 为了有活性的酶。
某些常用的修饰剂
鉴别化学修饰剂是否已经 引入酶活性中心的标准
a．酶活性的丧失程度与修饰的程度成正比。 b．底物或可逆抑制剂可保护共价修饰剂的抑制作用。
分析化学修饰结果时 应注意的问题
对化学修饰实验得出的结论应非常慎重，因为 可能被修饰的基团位于活性中心以外的附近，由于 空间位阻使得底物无法进入活性中心，从而表现出 酶失去活性。活性中心往往有多个与底物结合的基 团，修饰其中的一个往往不能使酶失去活性，可能 导致结合力减弱，也可能改变被结合底物的专一性。
酶原的激活
人的胃肠道中有许多蛋白酶，包括胃蛋白酶、 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和弹性蛋白酶 等，它们在细胞内刚合成时，是酶原形式，当分 泌到胃肠道中后，受到胃肠道中蛋白酶的作用， 肽键断裂，转变成活性酶。这样可以避免这些酶 对分泌器官的破坏。
（2）酶原激活的机制
胰凝乳蛋白酶原的活化
2．共价修饰调节
胰蛋白酶的差示标记
Eyl 和 Inagami 的 实 验 证 明 了 上 述 推 测 。 他 们 用 苯甲脒（benzamidine，C6H5C(=NH)NH2）作为β胰 蛋白酶的竞争性抑制剂，以1-乙基-3-二甲氨丙基碳 二 亚 胺 为 缩 合 剂 （ 1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide ， C2H5-N=C=N-(CH2)3-N(CH3)2 ） ， 以 甘氨酰胺（glycine amide）为修饰剂，以差示标记法 证明了Asp177是结合底物的一个基团。酶的羧基与 甘氨酰胺以酰胺键结合后几乎完全抑制了酶水解Nα- 苯 甲 酰 基 -L- 精 氨 酸 乙 酯 （ N-α-benzoyl-Larginine ethyl ester）的能力。
一个在无光时稳定的化合物可逆地结合到酶 的活性中心，照光后受光解激活，产生高反应性 基团，与酶的活性中心共价结合。常见的试剂是 光解时给出高度易反应的碳烯的重氮化合物或硝 烯的叠氮化合物。
在植物生理学研究中，用氚偶氮—IAA作光 亲和标记试剂，经紫外光照射后，从番茄茎细胞 质膜上分离出了IAA受体蛋白。
羧肽酶A活性中心 的结构示意图
return
二、酶活性中心化学基团 的鉴定
常用的方法有:
化学修饰法 反应动力学法 x-光晶体衍射法
1.化学修饰法
酶分子中有许多氨基酸残基的侧链基团可 以被化学修饰，如羟基、巯基、咪唑基、氨基、 羧基等。如果一个基团是必需的，则被修饰后 酶活性会大大下降，甚至完全失活。
共价修饰调节中最重要的也是最主要的是 磷酸化/脱磷酸化。
一些可被磷酸化/脱磷酸 调节的酶
（2）蛋白激酶
使 蛋 白 质 磷 酸 化 的 酶 称 为 蛋 白 激 酶 （ protein kinase，PK），PK已发现了很多种，一般分为三 大类：
①底物专一的蛋白激酶，如磷酸化酶激酶、丙酮酸 脱氢酶激酶等；
三、组成酶活性中心 的重要化学基团
酶活性中心有7种氨基酸残基参加的频率最高， 它们是Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。
同一类酶往往含有相同的活性中心基团。如 胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶活性活性中 心含有半胱氨酸残基，称为半胱氨酸蛋白酶。在脱 氢酶活性中心往往含有酪氨酸残基。这些知识可以 为未知活性中心基团的酶的研究提供线索。
要充分利用高反应性的情况。
（2）差示标记法
这种方法是非特异性试剂标记法的一个发 展。它利用竞争性抑制剂或底物预先占据活性 中心，使非特异性试剂只修饰活性中心以外的 基团，然后透析除去保护剂（即竞争性抑制剂 或底物），再用同位素标记的非特异性试剂修 饰活性中心的基团。经氨基酸分析可知哪些基 团位于活性中心。
2．动力学分析法
动力学分析法是利用改变酶反应介质的pH， 观察其对酶催化能力的影响。酶蛋白分子中含有 许多可解离的基团，pH改变必然会影响这些基 团的解离状态。当活性中心的必需基团的解离状 态发生变化时，会直接影响到酶的催化能力。因 此，通过pH～酶催化活性关系的研究，可能得 到与催化直接相关的某些基团的pK值，进而推 断这些基团的种类。
动力学分析法
各基团的pK值有一理论值，但由于微环境 的影响，实测的pK值往往与理论值有偏差，导 致分析基团种类的困难，这时需要用其他方法辅 助分析，如测该基团的解离热函△H，或加有机 溶剂，改变溶液的电导率，作pH依存关系实验， 从pK的变化来协助推断基团种类。
各种氨基酸残基的pK值 与解离热函△H
木瓜蛋白酶的非特异性试剂修饰
通过动力学实验证实，还有一个组氨酸残基的 咪唑基位于木瓜蛋白酶活性中心的催化部位（木瓜 蛋 白 酶 共 有 212 个 氨 基 酸 ， 有 His81 和 His159 两 个 His）。Husain和Lowe用1,3-二溴丙酮修饰木瓜蛋白 酶，在pH5.6，1克当量的试剂完全抑制了木瓜蛋白 酶的活性。对修饰后的酶进行氨基酸分析，发现少 一个组氨酸。在用1,3-二溴丙酮（2-14C）的修饰实验 中，发现修饰剂连接了Cys-25和His-159两个残基， 因此知道了这两个基团之间的距离在 5 以内。这个 结论通过x-光衍射分析法又进一步得到了肯定。
3．X-光衍射分析法
用X射线衍射研究蛋白质的构象时，蛋白质 必须结晶。用波长很短的X射线（λ=0.154nm）照 射蛋白质晶体，发生散射，底片曝光后，得到衍 射图，再经计算机处理，绘出电子密度图，从中 构建出三维分子图像。
通过多种方法相互印证，可得出正确的结论。
肌红蛋白的X射线衍射图
部 分肽链的电子密度肌红蛋白分子中 图
（1） 使用非特异性试剂 对特殊基团的标记
非特异性试剂可以修饰特定的某种基团， 但不能区分活性中心内部和外部的基团。如果 某种基团只存在于活性中心，而其他部位没有， 就可以用非特异性试剂修饰。
木瓜蛋白酶的非特异性试剂修饰
木瓜蛋白酶（papain）分子中有7个半胱氨酸残 基，其中的6个形成3对二硫键，只有一个以自由巯基 的 形 式 存 在 于 活 性 中 心 （ Cys22-63 ， Cys56-95 ， Cys153-200 ， 自 由 Cys25 ； 编 号 从 N 端 开 始 往 C 端 进 行）。在这种情况下就可以用任何一种硫氢基试剂来 修饰，如用碘乙酸修饰。碘乙酸对木瓜蛋白酶的活性 中心无任何特殊亲和力，但由于这种特殊情况，仍然 得到了巯基的修饰与酶活性的丧失相平行的结果。
酶活性部位微环境的影响
由于酶活性部位微环境的影响，活性中心的基 团对某一非特异性试剂的反应性可能会比活性中心 以外的基团的反应性高或低。如3-磷酸甘油醛脱氢 酶的活性中心的Ser能优先地被14C-碘乙酸标记； 牛胰核糖核酸酶活性中心的His能优先地被碘乙酸 标记，其Lys-41的ε－NH2可优先地被氟二硝基苯标 记。也有些酶活性中心的基团对某种非特异性试剂 的反应性很低。