荧光显微镜原理
荧光显微镜的基本原理及应用PPT课件
未来荧光显微镜的发展将更加注重个性化定制，根据不同 领域和不同需求，定制特定的光学系统和成像方案，以满 足不同用户的需求。
06 参考文献
参考文献
参考文献1
介绍荧光显微镜的基本原 理，包括激发光、发射光 和滤色片的原理和作用。
参考文献2
介绍荧光显微镜的应用， 包括生物学、医学、化学 等领域的应用案例和效果。
荧光显微镜的基本原 理及应用ppt课件
目录
CONTENTS
• 荧光显微镜简介 • 荧光显微镜的基本原理 • 荧光显微镜的应用 • 荧光显微镜的优缺点 • 荧光显微镜的发展趋势与未来展望 • 参考文献
01 荧光显微镜简介
荧光显微镜的发展历程
01
02
03
荧光显微镜的起源
19世纪末，科学家开始研 究荧光现象，并尝试将其 应用于显微镜中。
多色观察
荧光显微镜可以同时观察多个 荧光标记物的表达，通过不同 的荧光颜色来区分不同的标记 物。
非破坏性
荧光显微镜观察样本时不会对 样本造成破坏，因此可以观察
同一样本的不同层面。
缺点
01
02
03
04
光毒性
荧光显微镜需要使用高强度光 源来激发荧光，长时间观察会
对样本造成光毒性损伤。
光漂白
荧光标记物在受到高强度激发 光照射时容易发生光漂白，导
环境化学
荧光显微镜用于检测环境中的有害物 质和污染物。例如，利用荧光标记的 探针检测水体中的重金属离子或有机 污染物。
04 荧光显微镜的优缺点
优点
高灵敏度
荧光显微镜能够检测到非常微 弱的荧光信号，因此可以用于
观察低浓度的荧光标记物。
高对比度
荧光显微镜能够通过选择合适 的激发和发射波长，获得高对 比度的荧光图像。
荧光显微镜的基本原理及应用
六、荧光组化实验中应注意的几个问题
1、每种荧光染料，均有自己的最适pH值，此时荧光最强。 当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因 此荧光检测时要在一定的pH值的缓冲液中进行。 2、一放荧光染色在20。C以下时荧光比较稳定，温度升高常 出现温度猝灭。 3、在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰 竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进 行观察，需照相时再适当增强激发光。 4、一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一， 也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的 浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由 于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。
2.药物筛选
荧光探针分布是利用信号传 导中信号分子的迁移功能，将 一荧光蛋白与信号分子相偶联， 根据荧光蛋白的分布情况即可 推断信号分子的迁移状况，并 推断该分子在迁移中的功能。 由于GFP分子量小，在活细胞 内可溶且对细胞毒性较小，因 而常用作荧光探针
八、使用注意事项
1 暗室内进行，打开汞灯5-10min稳定后再观察。
A filter set consists of two barrier filters (1 and 3) and a dichroic mirror (beam-splitting 2)
三、荧光显微镜的操作
(1)安装紫外防护罩。
(2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。
(3)插入挡光板，中断光路。
七、荧光显微镜应用技术
1. 对细胞结构或组分的定性位、半定量研究
免疫荧光技术 用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离 的物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的 技术对其进行分析的方法。将抗原或抗体与荧光染料连 接，用于检测相应特异性的抗体或抗原的方法称“直接 免疫荧光技术(direct immunofluorescent technique)”。 用荧光染料标记的第二、第三抗体等检测相应抗原抗体 复合体的方法则称“间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescent technique)”。
荧光显微镜的原理
荧光显微镜的原理
首先，荧光显微镜的激发光源通常采用紫外线或蓝光激发，这些波长的光能够激发荧光标记的样品发出荧光。
荧光显微镜的激发光源会发出高能量的光子，当这些光子照射到样品上时，荧光标记的分子会吸收能量，处于激发态。
接着，这些分子在短暂的时间内会返回到基态，并且释放出辐射能量，即发出荧光。
这时，荧光显微镜的镜头会收集并放大发出的荧光信号，最终通过目镜和摄像机来观察和记录样品的荧光图像。
其次，荧光显微镜的成像原理是通过滤光片来选择感兴趣的荧光信号。
在荧光显微镜中，通常会使用荧光滤光片来选择特定波长的荧光信号，这样可以减少背景噪音的干扰，提高成像的清晰度和对比度。
另外，荧光显微镜还可以利用激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope）的原理，通过聚焦光束在三维样品上进行扫描，获得高分辨率的三维荧光图像。
最后，荧光显微镜的原理还包括荧光标记技术。
荧光标记技术是将感兴趣的生物分子或细胞结构与荧光染料结合，使其具有荧光性质，从而能够在荧光显微镜下观察到。
荧光标记技术的发展使得科研人员能够在细胞水平上观察到特定蛋白质、核酸或细胞器的位
置、分布和动态变化，为生命科学研究提供了重要的工具和手段。
总之，荧光显微镜的原理是基于荧光现象，通过激发光源、成像原理和荧光标记技术来观察样品的荧光信号，从而实现对微观世界的观察和研究。
荧光显微镜在生物学、医学和化学领域的应用前景广阔，对于揭示生命科学中许多未知的细胞和分子机制具有重要意义。
希望通过本文的介绍，能够使读者对荧光显微镜的原理有更深入的了解。
荧光显微镜的原理与应用
荧光显微镜的原理与应用前言荧光显微镜是一种利用荧光现象进行观察和显示样品细胞或分子结构的显微镜。
它的原理和应用使得生物学、医学、材料科学等领域的研究变得更加准确和深入。
本文将介绍荧光显微镜的原理、构成和其在不同领域的应用。
一、荧光显微镜的原理荧光显微镜的成像原理基于光的荧光现象和酵素固有荧光物质本身的特性。
1.光的荧光现象当物质受到一定波长的光照射后，能量被吸收并再次散发出去。
荧光显微镜利用激发光的波长激发标记在样品中的荧光物质，使其发出荧光信号。
这种荧光信号可以被荧光显微镜所捕获和放大，进而产生图像。
2.酵素固有荧光某些分子具有自身固有的荧光性质。
这些分子可以从基态跃迁到激发态，并在激发态上持续存在一段时间后再跃迁回基态。
通过观察这些分子的荧光信号，可以获得关于样品的信息。
二、荧光显微镜的构成荧光显微镜通常由以下几个主要部件组成：1.光源：用来提供激发样品的激发光，常用的光源有氘灯、汞灯、激光器等。
2.激发光滤镜：用于选择性地过滤或选择激发光的特定波长。
3.物镜：用来放大样品并收集由荧光物质发出的荧光信号。
4.荧光筛选器：用来选择特定的荧光波长，并阻挡其他波长的光线。
5.观察系统：包括目镜、眼镜或摄像机等设备，用于观察和记录荧光信号。
三、荧光显微镜在不同领域的应用荧光显微镜在生物学、医学、材料科学等领域有广泛的应用。
1.生物学研究荧光显微镜可以帮助研究者观察和分析生物学样本中的细胞结构和功能。
通过将特定荧光染料标记到细胞中，可以实时监测细胞的代谢状态、基因表达和蛋白质定位。
2.医学诊断荧光显微镜在医学诊断中发挥着重要作用。
例如，通过使用荧光标记剂可以检测肿瘤细胞，帮助医生进行早期诊断和治疗。
3.材料科学荧光显微镜在材料科学中的应用主要集中在材料的结构和性能测试上。
通过标记某些特定的分子或颗粒物，并观察它们在材料中的分布和运动，可以更好地了解材料的组成和特性。
4.环境监测荧光显微镜也可以应用于环境监测领域。
荧光显微镜的工作原理
荧光显微镜的工作原理首先，荧光显微镜的工作原理基于荧光标记。
在样本中加入荧光染料或荧光蛋白后，当样本受到特定波长的激发光照射时，荧光染料或荧光蛋白会吸收能量并转换成较长波长的荧光发射。
这种现象被称为荧光激发和荧光发射。
荧光显微镜利用这一原理，能够观察样本中的荧光信号，从而获取样本的相关信息。
其次，荧光显微镜的核心部件包括激发光源、滤光片、物镜、目镜和荧光探测器。
激发光源通常采用紫外光或蓝光LED，能够产生足够的激发光照射样本。
滤光片用于选择特定波长的激发光进入样本，阻挡其他波长的光线。
物镜和目镜则用于放大样本中的荧光信号，并通过目镜观察。
荧光探测器能够捕获样本中的荧光信号，并将其转换成电信号。
在实际观察中，样本首先被加入荧光标记物，然后放置在荧光显微镜的载物台上。
激发光源发出特定波长的激发光，经过滤光片选择后照射到样本上。
样本中的荧光标记物吸收激发光并发出荧光信号，荧光信号经过物镜放大后，通过目镜观察。
荧光探测器捕获荧光信号并转换成电信号，最终形成荧光图像。
荧光显微镜的工作原理使其能够观察细胞器官、蛋白质分布、细胞活动等细胞和分子水平的信息。
在细胞生物学研究中，荧光显微镜被广泛应用于观察细胞器官的形态和分布、跟踪蛋白质在细胞内的运动、研究细胞凋亡等方面。
在生物医学领域，荧光显微镜能够帮助医生观察病理标本，诊断疾病，指导治疗。
总的来说，荧光显微镜通过荧光标记和荧光激发发射原理，能够观察样本中的荧光信号，为生物学、医学等领域的研究和临床诊断提供了重要的工具。
随着技术的不断进步，荧光显微镜在分辨率、灵敏度等方面也不断得到提升，将为科研人员提供更多更精确的信息。
荧光显微镜的原理和使用方法
• 2.1 荧光显微镜旳基本装置及其光路
•
荧光显微镜因制造厂家、型号旳不同，构造
各异，但主要构件，基本相同。
• 2.1.1光源:采用高压汞灯。汞灯能以最小旳表面 发出最大数量旳紫外光和蓝光，且光亮度大，光
度稳定。汞灯旳构件，中间为一球形石英玻璃管， 有两个钨电极，内充汞滴和少许氩氖混合气体。 汞灯装在牢固旳灯室中，有调中、聚焦和集光装 置。使用中禁止频繁启闭，点亮后欲暂停使用时，
不可切断电源，可用光阀阻断光路。当汞灯熄灭 后，不能立即点亮，经5～10min，汞灯冷却后再 通电点亮。
•
HBO200Ｗ汞灯旳发射光谱为200～600nm，
• 视场光阑旳调整使用：视场光阑位于孔径光阑 之后，亦由外露手杆操纵。视场光阑用于限定样 品表面旳照明区域，其开度一般应与孔径光阑旳 开孔相当。
• 辅助激发滤色镜滑动阀旳使用:滑动阀位于镜臂 专用槽中，可拉出或推入。有三个挡位供不同使 用。全拉出位：供常规使用；中间位：用于Ｂ激 发法，辅助滤色镜进入光路；全推入位：用作光 阀，阻断全光线．
• 某些物质经波长较短旳光线照射后，分子被激活， 吸收能量后呈激发态。其能量部分转化为热量或 用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长旳 光能形式辐射出来，这种波长长于激发光旳可见 光称作荧光。生物体内有些物质受激发光照射后 可直接发出旳荧光，称为自发荧光（如叶绿体中 旳叶绿素分子受激发所发出旳火红色旳荧光）； 本身不发荧光，在吸收荧光染料之后所发出旳荧 光称为次生荧光。常用旳荧光染料涉及丫啶橙、 荧光素、罗丹明、GFP、PI、PE、DAPI等。
荧光显微镜原理
荧光显微镜原理
荧光显微镜是一种能够通过激发样品中的荧光物质发出荧光，并通过观察和记录荧光信号来进行显微分析的仪器。
其工作原理基于荧光现象和光学成像原理。
首先，荧光显微镜需要一种能够激发荧光的光源。
常用的光源包括汞灯、钠灯和激光器等。
这些光源产生的紫外光或特定波长的光可以激发样品中的荧光物质。
其次，在荧光显微镜中，这些激发光会通过物镜进入样品。
物镜具有高放大倍数和高分辨率，可以将激发光聚焦到样品的特定区域上。
然后，样品中的荧光物质会被激发光激活，并发出荧光信号。
荧光物质吸收激发光的能量后，其激发态会发生非辐射跃迁，返回基态时释放出相应波长的荧光光子。
这些荧光光子可被荧光显微镜的物镜收集，并通过镜头系统进行光学放大和聚焦。
最后，荧光显微镜通过将荧光信号与光学检测系统结合，可以对样品中的荧光信号进行增强、捕获和记录。
典型的光学检测系统包括滤光器、物镜、接收镜和探测器等。
滤光器可以选择性地阻挡激发光而只传递荧光信号，物镜和接收镜将荧光信号聚焦到探测器上，探测器则将荧光信号转化为电信号进行记录和分析。
总之，荧光显微镜通过激发和观察样品中的荧光信号，可以实现对细胞、分子等微观结构的非损伤性显微分析。
这种原理使
得荧光显微镜在生物学、医学和材料科学等领域有着广泛的应用。
荧光显微镜的工作原理
荧光显微镜的工作原理荧光显微镜是利用特定波长的光照射被检物体产生荧光进行镜检的显微光学观测技术，主要用于研究有机物和无机物等样品，一般使用荧光和磷光来检查样品的结构组织和空间分布，较适用于研究复杂且无法在传统透射光显微镜下检查的样品。
荧光显微镜与传统显微镜的区别主要有两个方面，一种是光源类型不同，另一种是使用的滤光片元件不同。
荧光的原理是某些物质会在高强度的短波长光线照射下，会发出波长稍长的发射光（荧光）。
而我们一般都是观察被激发荧光基团所发射出来的波长稍长的发射光（荧光），但是激发的光会很强，所以我们就需要把激发的光全部滤去，这样才可以看到荧光基团的发射光（荧光）。
荧光显微镜一般都用高强度的汞灯做激发光源，使用滤色片把不需要的光滤去，只留下激发荧光集团的高强度很纯的光线。
这个单色的光线通过物镜照射到样本上之后，样本会被激发出发射光（荧光），荧光和激发光都会沿着物镜光路返回，这样就需要用一个二相色镜把激发光滤去，只让我们需要看到的荧光透过。
这个荧光沿着显微镜的光路最后到达目镜下，然后进入我们的眼睛，我们就可以看到荧光基团所发出来的荧光了。
荧光显微镜可用于生物学、生物医学和材料科学，荧光显微镜有助于准确和详细地识别细胞和亚微观细胞成分。
荧光显微镜也被广泛用于组织化学领域，以检测常规显微镜无法看到的颗粒，例如神经递质胺。
它在食品化学中用于评估产品中特定食品成分的存在、结构组织和空间分布。
还有一种荧光散斑显微镜，它是一种使用荧光标记的大分子组装体（例如细胞骨架蛋白）来研究运动和周转率的技术。
荧光显微镜染色也会在矿物学领域使用，它通常用于研究煤炭、氧化石墨烯等矿物。
它还广泛用于纺织工业来分析纤维尺寸，落射荧光显微镜有助于研究基于纤维的材料（包括纸张和纺织品），不仅如此荧光显微镜的使用还可以用于荧光染料研究陶瓷孔隙率以及半导体研究领域。
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荧光显微镜原理一、荧光显微镜荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。
它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。
是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。
（一）光源现在多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。
超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。
它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。
超高压汞灯也散发大量热能。
因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。
新型超高压汞灯在使用初期不需高电压即可引燃，使用一些时间后，则需要高压启动（约为15000V），启动后，维持工作电压一般为50～60V，工作电流约4A左右。
200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。
因此，使用时尽量减少启动次数。
灯泡在使用过程中，其光效是逐渐降低的。
灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。
点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min。
由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因此灯泡必须置灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作者受伤。
超高压汞灯（100W或200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。
在灯室上有调节灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有集光透镜。
国产超高压汞灯GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的进口灯泡，平均寿命在200h以上，价格也比较低。
我国研制的一种简易轻便型高色温溴钨荧光光源装置，体积小，重量轻，功率小，交、直流两用（自带直流电源），易于携带，使用方便，已推广应用。
（二）滤色系统滤色系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。
滤板型号，各厂家名称常不统一。
滤板一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。
如德国产品（Schott）BG12，就是种蓝色玻璃，B是蓝色的第一个字母，G是玻璃的第一个字母；我国产品的名称已统一用拼音字母表示，如相当于BG12的蓝色滤板名为QB24，Q是青色（蓝色）拼音的第一个字母，B是玻璃拼音的第一个字母。
不过有的滤板也可以透光分界滤长命名，如K530，就是表示压制滤长530nm以下的光而透过530nm以上的光。
还有的厂家的滤板完全以数字命名，如美国Corning厂的NO：5-58，即相当于BG12。
用于荧光显微镜的主要滤板如表3-1。
表3-1 荧光显微镜常用滤板型号和透光特点相应名称2mm厚透光范围基本色调上海电器元件（峰值）nm 德国（Schott）苏联日本厂黑紫 ZWB-1 UG-1 yΦC-2 DV-1 300～400（365）黑紫 ZWB-2 UG-5 yΦC-1 280～240（360）靛蓝 ZB-2 BG-1 ΦC-1 BG-1 300～500（380）靛蓝 ZB-3 BG-3 CC-4 BG-3 260～520（400）靛蓝 QB-24 BG-12 CC-8 BG-12 310～570（420）淡蓝 QB-10 BG-38 C3C-5 310～720（460）QB-12 -8-11 橙黄 CB-3 OG-1（K530） OC-11 OG-1 530以上橙黄 JB-8 OG-4（K510）ЖC-18 FY-5 510以上绿橙 JB-7 GG-11（K490）ЖC-17 FY-3 480以上FY-4 淡绿 JB-4 GG-3（K430）жC-11 US-10 420以上引自：五九一节五部队编：荧光显微术，见参考资料）1．激发滤板根据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激发滤板，提供一定波长范围的激发光。
紫外光激发滤板：此滤板可使400nm以下的紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。
常用型号为UG-1或UG-5，外加一块BG-38，以除去红色尾波。
紫外蓝光激发滤板：此滤板可使300～450nm范围内的光通过。
常用型号为ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
紫蓝光激发滤板：它可使350～490nm的光通过。
常用型号为QB24（BG12）。
最大吸收峰在500nm以上者的荧光素（如罗达明色素）可用蓝绿滤板（如B-7）激发。
近年开始采用金属膜干涉滤板，由于针对性强，波长适当，因而激发效果比较玻璃滤更好。
如西德Leitz厂的FITC专用KP490滤板和罗达明的S546绿色滤板，均远比玻璃滤板效果好。
激发滤板分薄厚两种，一般暗视野选用薄滤板，亮视野荧光显微镜可选用厚一些。
基本要求是以获得最明亮的荧光和最好的背景为准。
2．压制滤板压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过，提供相应滤长范围的荧光。
与激发滤板相对应，常用以下3种压制滤板：紫外光压制滤板：可通过可见光、阻挡紫外光通过。
能与UG-1或UG-5组合。
常用GG-3K430或GG-6K460。
紫蓝光压制滤板：能通过510nm以上滤长的荧光（绿到红），能与BG-12组合。
通常用OG-4K510或OG-1K530。
紫外紫光压制滤板：能通过460nm以上波长的荧光（蓝到红），可与BG-3组合，常用OG-11K470AK 490，K510。
（三）反光镜反光镜的反光层一般是镀铝的，因为铝对紫外光和可见光的蓝紫区吸收少，反射达90%以上，而银的反射只有70%；一般使用平面反光镜。
（四）聚光镜专为荧光显微镜设计制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。
分明视野聚光器的暗视野聚光器两种。
还有相差荧光聚光器。
1．明视野聚光器在一般荧光显微镜上多用明视野聚光器，它具有聚光力强，使用方便，特别适于低、中倍放大的标本观察。
2．暗视野聚光器暗视野聚光器在荧光显微镜中的应用日益广泛。
因为激发光不直接进入物镜，因而除散射光外，激发光也不进入目镜，可以使用薄的激发滤板，增强激发光的强度，压制滤板也可以很薄，因紫外光激发时，可用无色滤板（不透过紫外）而仍然产生黑暗的背景。
从而增强了荧光图像的亮度和反衬度，提高了图像的质量，观察舒适，可能发现亮视野难以分辨的细微荧光颗粒。
3．相差荧光聚光器相差聚光器与相差物镜配合使用，可同时进行相差和荧光联合观察，既能看到荧光图像，又能看到相差图像，有助于荧光的定位准确。
一般荧光观察很少需要这种聚光器。
（五）物镜各种物镜均可应用，但最好用消色差的物镜，因其自体荧光极微且透光性能（波长范围）适合于荧光。
由于图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜镜口率的平方成正比，而与其放大倍数成反比，所以为了提高荧光图像的亮度，应使用镜口率大的物镜。
尤其在高倍放大时其影响非常明显。
因此对荧光不够强的标本，应使用镜口率大的物镜，配合以尽可能低的目镜（4×,5×，6.3×等）。
（六）目镜在荧光显微镜中多用低倍目镜，如5×和6.3×。
过去多用单筒目镜，因为其亮度比双筒目镜高一倍以上，但目前研究型荧光显微镜多用双筒目镜，观察很方便。
（七）落射光装置新型的落射光装置是从光源来的光射到干涉分光滤镜后，波长短的部分（紫外和紫蓝）由于滤镜上镀膜的性质而反射，当滤镜对向光源呈45。
倾斜时，则垂直射向物镜，经物镜射向标本，使标本受到激发，这时物镜直接起聚光器的作用。
同时，滤长长的部分（绿、黄、红等），对滤镜是可透的，因此，不向物镜方向反射，滤镜起了激发滤板作用，由于标本的荧光处在可见光长波区，可透过滤镜而到达目镜观察，荧光图像的亮度随着放大倍数增大而提高，在高放大时比透射光源强。
它除具有透射式光源的功能外，更适用于不透明及半透明标本，如厚片、滤膜、菌落、组织培养标本等的直接观察。
近年研制的新型荧光显微镜多采用落射光装置，称之为落射荧光显微镜。
二、荧光显微镜标本制作要求（一）载玻片载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。
载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。
有时需用石英玻璃载玻片。
（二）盖玻片盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。
为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光方可激发标本。
（三）标本组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。
另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。
（四）封裱剂封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。
所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。
（五）镜油一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。
三、使用荧光显微镜的注意事项（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。
（2）应在暗室中进行检查。
进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。
（3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。
（4）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。
（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。
天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。
灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。
一天中应避免数次点燃光源。
（6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。
若将标本放在聚乙烯塑料袋中4?保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。
（7）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”—无或可见微弱荧光。
“+”—仅能见明确可见的荧光。
“++”—可见有明亮的荧光。
“+++”—可见耀眼的荧光。
四、荧光图像的记录方法荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。
结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观察。
作为一般定性观察，基本上可靠的。
随着技术科学的发展，在不同程度上采用客观指标记录判断结果，如用细胞分光光度计，图像分析仪等仪器。
但这些仪器记录的结果，也必须结合主观的判断。
荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。