分子荧光光度法
一般物质 f
0~1之间
荧光效率的大小与荧光发生过的快慢有关； 荧光过程的快慢取决于分子的结构； 而其他的去激化过程不仅取决于结构，更多的取决于化学环境。
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
能发射荧光的物质具备条件：
①有强的紫外-可见吸收
②有一定的荧光效率。
1.跃迁类型: 荧光物质n➙π*或π ➙π *跃迁。
第二节 基本原理
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
一、分子的激化
基态时，一 个给定轨道 中的两个电 子，具有相 反方向的自 旋。 当吸收 光辐射被激 发而跃迁至 激发态时：
单 重 基 态
不发生自 旋方向的 改变
激 发 单 重 态
激 发 三 重 态
发生自旋 方向的改 变
S0
S1
T1
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
荧光发射：电子通过内转换及振动弛豫，可返回到第一激发
单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返
回至基态的任一振动能级上时发射的光量子。 由于振动弛豫和内转换损失了部分能量，故荧光的波长 总比激发光波长要长。 磷光发射：经过体系间跨越的分子再通过振动弛豫降至激发 三重态的最低振动能级并存活一段时间，然后返回至基态的 各个振动能级而发出的光辐射。
摩尔吸光系数 激发效率
小 大（10-2-10-3倍）
跃迁类型
n➙π* π ➙π *
跃迁寿命
10-7-10-9s 10-5-10-7s
能级差
小 大
π ➙π *主要跃迁类型； 含π ➙π *共轭体系是荧光分析的主要研究对象。
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
2. 共轭结构：共轭程度越大，荧光强度越大，而波长也长移。 苯 0.11 萘 0.29 蒽 0.36
温度 溶剂 pH值
温度升高，荧光效率和荧光强度降低。
溶剂极性增强，荧光强度增强，波长长移。 溶剂粘度降低，荧光强度降低。
弱酸或弱碱的时，有较大影响。
荧光熄灭
荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作
用引起荧光强度降低。卤素离子，重金属离子，氧 分子，硝基化合物，重氮化合物等。
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
散射光
瑞利散射：光子和物质分子发生弹性碰撞时，不发生能 量转换，仅仅光子运动方向发生改变。与激发光波 长相同 拉曼散射：发生非弹性碰撞时，方向发生改变的同时发生能 量交换，发射光波长会改变。比激发光长，与荧光波长接近
荧光波长 荧光波长
拉曼散射
拉曼散射
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
Hale Waihona Puke 2、荧光光谱的形状与激发波长无关
3、荧光光谱与激发光谱有镜像关系
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
三、荧光与分子结构
荧光发生过程比其他激发过程快，才能观察到荧光发射现象。
荧光效率 (f) ：激发态分子发射荧光的光子数与 基态分子吸收激发光的光子数之比。
f=
发射荧光的光子数 吸收激发光的光子数
cs cx
cx
I f ,s I f ,0 I f , x I f ,0
cs
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
散射光的干扰主要是拉曼散射对荧光波长的干扰，消除方法：
1.选择合适的激发光波长
2.选择合适的试剂 分子荧光法对有机化合物的分析应用：
1. 脂肪族化合物基本没有荧光吸收，加入荧光剂，才能测定
2. 芳香族化合物具有共轭不饱和体系，大部分由荧光
3. 胺类，甾族化合物，蛋白质，酶和辅酶等也可用荧光测定
第十一章
荧光分析法
仪器分析
习题： 1、外部能量转换将（ ）荧光强度。 ）。
2、荧光光谱中，发射波长总是比激发波长（
3、能够发射荧光的物质应具备的条件是（
）、（
）。
）。
4、荧光法与紫外吸收法相比，荧光法测定的优点是（ 5、什么是荧光发射？ 6、荧光光谱的特征？ 7、简述荧光和磷光的区别。
单色器：干涉滤光片或光栅 半宽度窄，透光率窄，耐用等特点。 样品池：石英吸收池 检测器：光电倍增管
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
显示器 荧光波长纽
样品室
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
第四节
荧光定量分析方法
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
一、荧光强度与物质浓度的关系
第三节
仪器与其他荧光分析技术
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
一、荧光分光光度计
主要部件：激发光源、激发单色器、发射单色器、样品池、 检测系统等。
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
激发光源：高压汞灯，氙灯，卤钨灯，激光 所发射的谱线强度大、而且是连续光谱，并在300～
400nm波长之间的谱线强度几乎相等。
与荧光比较辐射能量更小，波长更长。
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
振动驰豫
内转换 体系间跨越
磷光
吸收
荧光
外转换
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
去激化过程 振动弛豫 内转换 外转换 体系间跨越 荧光 磷光
是否发 射电磁 辐射 否 否 否 否 是 是
涉及的能级 同一激发态的振动能级间 不同激发态的振动能级间 第一激发态单重态或三重态 最低能级 从激发态单重态-----三重 态（电子自旋发生改变） 第一激发单重态最低振动能 级---基态 激发三重态最低振动能级--基态
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
外部能量转换：溶液中激发态分子以热能的形式释放能量的 过程。常发生在第一激发单重态或激发三重态的最低振动能
级向基态转换的过程。
会降低荧光强度
体系间跨越：处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分 子的多重性发生变化的过程。常见于含重原子（碘，溴等） 有机化合物分子中。
仪器分析
激发态类型
磁性
寿命 10-8S 10-4-1S
跃迁 允许跃迁
能量 高
单重态（S） 抗磁性分子
三重态（T） 顺磁性分子
禁阻跃迁
低
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
二、几种去激化过程 振动弛豫：处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子
碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到 同一电子激发态的最低振动能级的过程。 特点：属于无辐射跃迁、只能在同一电子能级内进行 内部能量转换：当两个电子激发态之间的能量相差较小以 致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐 射方式转移至低电子能级的过程。
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
光致发光：有些物质受到光照射时，除吸收某种波长的光之外，还会
发射出比原来所吸收光的波长更长的光。
荧光：
磷光：
荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量 测定的方法。 优点：灵敏度高，选择性好。
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
寿命 10-12—10-14s 10-11—10-13s 激发三重态 分子易发生
10-6—10-9s 10-4—10s
振动弛豫和 内转换 体系间跨越 和振动弛豫
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
二、激发光谱与发射光谱
激发光谱：固定发射波长，以不同波长的入射光激发荧光物质。 以荧光强度对激发波长作图。λex,最大激发波长，定量分析用。 荧光光谱（发射光谱）：使激发光的波长和强度保持不变，以荧 光强度对发射波长作图。λem,最大荧光波长，定量分析用。 荧光光谱特征： 1、斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发光波长
仪器分析
二、定量分析方法
1.标准曲线法 参照紫外法，选择浓度最大的标准溶液做基准，调节荧光强 度为100或某个最大值，测定其他溶液的相对荧光强度。 2.比例法（对比法）
I f , s I f , 0 Kc s I f , x I f , 0 Kc x
I f ,s I f ,0 I f , x I f ,0
低浓度（小于10-6g）时，荧光的强度与荧光分子浓度 呈正比关系------定量的依据
If=2.303φfI0ECl=KC
ECl≤0.05 If C ECl >0.05 If 与C不成正比
浓度高时，荧光减弱，称为自熄灭。
自熄灭使荧光强度与荧光分子浓度偏离线性关系，产生误差
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
3. 分子刚性：分子刚性（不能自由旋转）越强，π电子共轭程度 增大，荧光强度也越强，而波长也长移。 给电子取代基：p-π共轭，增强荧光效率，波长长移。 4. 取代基 吸电子取代基：减弱荧光，甚至熄灭。 卤素原子：增加激发分析的体系间跨越，荧光减弱。
第十一章 荧光分析法 分子荧光光度法
仪器分析
三、影响荧光强度的外部因素
分子荧光光度法测定荧光素
分子荧光光度法测定荧光素分子荧光光度法测定荧光素，听起来就像是个神秘的科学实验，其实呢，它其实没那么复杂，反而充满了趣味。
想象一下，在实验室里，灯光微微暗下来，空气中弥漫着一股神秘的气息，心里暗自期待着将要发生的事情。
你手里握着的不是一把利器，而是一台看似普通的仪器，但它却能把荧光素的秘密一一揭开。
这种荧光素，它可不是个平凡的家伙，想当年可是在实验室里风光无限。
它的光芒就像是夜空中的星星，闪烁着耀眼的光辉，吸引着每一个好奇的目光。
嘿，别以为这只是个简单的过程哦。
要搞清楚荧光素是什么。
它是某些生物体内的产物，比如小青蛙的皮肤，或者某些海洋生物的体内，想想就觉得有点神奇。
我们用分子荧光光度法，简单来说，就是通过一种仪器，看看荧光素在光照下的表现。
那种色彩斑斓的光芒，简直是让人目不暇接，仿佛置身于一个色彩缤纷的梦境。
你可以想象，它在光照下跳动的样子，就像小孩在草地上追逐蝴蝶，活泼又可爱。
在这过程中，首先要准备好荧光素的样品，可能是提取自生物体的，也可能是实验室合成的，反正你得确保它的纯度。
要是杂质多，那可就麻烦了，可能会影响测量的结果。
就像做菜一样，食材的新鲜度很重要嘛，调味料也要放对了。
我们需要选择合适的波长，调好仪器。
这时候，你就像是一个调酒师，认真调整每一个细节，确保最终的“饮品”味道独特。
波长选择得当，荧光素的光芒就会如期而至，照亮整个实验室。
荧光光度法的关键在于灵敏度。
就像是你去酒吧喝酒，调酒师的手艺越好，喝到的酒就越美味。
荧光素在合适的光照下，表现得淋漓尽致，发出的光越亮，代表浓度越高。
想想看，那一瞬间，仿佛时间都静止了，你心里感到一阵小小的自豪。
看到数据一目了然，结果清晰可见，简直就像发现了新大陆，内心的小宇宙瞬间爆发。
但注意啦，处理数据也不能马虎。
这就像是填报高考志愿一样，得认真对待，不能掉以轻心。
根据测得的荧光强度，计算出浓度，公式在手，心里有谱。
将实验结果与标准曲线对比，这一步可别大意，做错了可就前功尽弃，像是拼图时缺了几块，怎么也拼不完整。
2016-2017年分子荧光法测定奎宁的含量-学生实验记录（总结）
实验十一分子荧光法测定奎宁的含量一、实验目的1. 了解荧光分光光度计的性能与结构，掌握仪器的基本操作；2．学会绘制荧光激发光谱和发射光谱图(即确定最大的λex和λem)；3．定量测定奎宁的含量（标准曲线法）二、实验原理奎宁在稀酸溶液中是强荧光物质，它有两个激发波长250nm和350nm，荧光发射峰在450nm。
在低浓度时，荧光强度与荧光物质量浓度呈正比：I f = k c，通过标准曲线法可以测定未知样品中的奎宁含量。
三、仪器与试剂1．仪器：岛津RF-5301型荧光分光光度计2．试剂：10.0 μg·mL-1奎宁储备液；0.05 mol·L-1 H2SO4溶液四、实验步骤1．系列标准溶液的配制取6支25mL的容量瓶，分别加入0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 的10.0 μg·mL-1奎宁标准溶液，用0.05 mol·L-1 H2SO4溶液稀释至刻度，摇匀。
2. 绘制荧光发射光谱和激发光谱(以1.2μg·mL-1的标准溶液找最大λem和λex)将λex固定在250 nm, 选择合适的实验条件, 在350～600 nm范围内扫描即得荧光发射光谱，从谱图中找出最大λem值；将λem固定在450 nm, 选择合适的实验条件，在220～400 nm范围内扫描即得荧光激发光谱，从谱图中找出最大λex 值。
3．绘制标准曲线将激发波长λex固定在250 nm处，荧光发射波长λem固定在450 nm左右处，在选定条件下，测量系列标准溶液的荧光强度，以荧光强度为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标作图，得到标准溶液的荧光强度标准曲线。
4．未知样品的测定取约4 mL待测样品，按照标准溶液相同的测定条件测定其荧光强度，扫描三次，从标准曲线上计算出对应的浓度。
五、实验结果1．发射光谱和激发光谱的绘制以1.2μg·mL-1的标准溶液测定奎宁的发射光谱，固定激发波长为250nm，激发和发射狭缝分别设定为nm和nm，激发光谱扫描范围为350 ~ 600nm，得到奎宁的发射光谱，从图中可知其最大发射波长在nm左右。
分子荧光法测定维生素B12含量实验报告
分子荧光法测定维生素B12含量实验报告【实验项目】分子荧光法定量测定维生素B2的含量【实验目的】1.掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理。
2.了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作。
【实验原理】荧光是光致发光。
任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱，发射波长总是大于激发波长。
荧光激发光谱是通过测定荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱，反映不同波长激发光引起荧光的相对效率。
荧光发射光谱是当荧光物质在固定的激发光源照射后所产生的分子荧光，是荧光强度对发射波长的关系曲线，表示在所发射的荧光中各种波长相对强度。
由于各种不同的荧光物质有它们各自特定的荧光发射波长，可用它来鉴定荧光物质。
有些发荧光的物质其荧光强度与物质的浓度成正比，故可用荧光分光光度法测定其含量。
维生素B2溶液在430~440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm 附近。
维生素B2在pH=6~7的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素B2溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素B2的含量。
维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质一光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比维生素B2的荧光强得多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。
在稀溶液中，荧光强度F与物质的浓度C有以下关系：F=2.303ΦT0Ebc当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系：F=Kc【仪器与试剂】1.仪器：荧光分光光度计（型号：F2500HITA[H));1cm石英比色皿l:50mL容量瓶2.试剂：维生素B2标准溶液(10.0μg/mL)(已加乙酸)》【实验内容与步骤】1.系列标准溶液和待测溶液的配制取维生素B2(10.0μg/mL)标准溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL 分别置于50mL的容量瓶中，标定，摇匀。
取2.00mL待测溶液于50mL的容量瓶中，标定，摇匀。
荧光光度分析法
26
浓度测定 1、如何进行校准和浓度测定 如何进行校准和浓度测定 按以下步骤，调整仪器，以便获取数据 第1步： 点击视图中的开始 开始(Stare)按扭，指向程序 开始 程序 (Program)→Cary Eclipse ， 然后选择扫描 扫描(Scan)即显示扫描功能框。 扫描 第2步： 点击设置 设置(Set up)，进入设置 设置(Set up)对话框， 设置 设置 指定检测方法的参数
荧光光度分析法
1
一、基本原理
1.荧光的定义 1.荧光的定义 在紫外光或波长较短的可见光照射 后，一些物质会发射出比入射光波长更 --------荧光 荧光。 长的光 --------荧光。以测量荧光的强度 和波长为基础的分析方法叫做荧光光度 和波长为基础的分析方法叫做荧光光度 分析法。 分析法。
2
4
分子内的光物理过程
VR 2 1 v=0 S2 2 1 v=0 S1 ic VR isc
A1、A2. 吸收 、 F. 荧光 P. 磷光 ic. 内转化 isc. 体系间窜跃 VR. 振动松弛 VR 2 1 v=0 T1
ic A2 A1 F P
isc
3 2 1 v=0 S0
5
6
3. 荧光强度与浓度的关系
11
二、Varian Cary Eclipse 荧光 分光光度计的特点
1. 硬件及硬件的主要特点 ⑴ 高能闪烁光源-----氙灯 高能闪烁光源-----氙灯 由于荧光物质的荧光强度与 激发光源的强度成正比，Eclipse采用了无须预 激发光源的强度成正比，Eclipse采用了无须预 耗能12 但脉冲输出能量却高达75 热、耗能12 W 但脉冲输出能量却高达75 KW 的闪烁氙 Xe） 并利用电子技术控制, 的闪烁氙（Xe）灯，并利用电子技术控制,使其 仅在发出测量指令后才闪烁。 仅在发出测量指令后才闪烁。这一设计给荧光 分析者带来极大的方便. 分析者带来极大的方便.
紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较
紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较
紫外可见分光光度法和分子荧光光度法，是两种现代分析化学中常用的光度测定技术，它们之间有许多不同之处。
首先，紫外可见分光光度法可以用来测量悬浮液和溶液中某种物质含量，通过检测它
们吸收波长不同的光，并使用紫外可见分光仪可以很好地用来定量分析一种物质的含量，
主要原因是它可以采用强度谱的方式测定光谱分析，这是数据量最大的分光光度法。
而分子荧光光度法则与紫外可见分光光度法存在很大的不同。
分子荧光光度法是一种
用于测定物质的定量分析的光度测量技术，其原理是通过激发某种物质的激发状态，并采
用光谱分析的方式测定淬发状态下某种物质吸收的光谱，采用发射率谱测量它发射出来的
光谱，这种方法有利于识别样品中含量很小的物质。
此外，两种光度测量技术在检测样品中的某种物质的含量时也有很大的差异。
紫外-
可见分光光度法通常可以测到复杂样品中有结构特性的物质，因此适用于分析各种复杂混
合样品，分子荧光光度法则是通过向某种物质添加少量共振激发剂来标记样品中某种物质，然后进行定量分析，它可以清楚地测量某种独特结构物质，因此被广泛应用于纯化和同位
素比值等细胞研究中，并可以更明确地测量和筛选出某种物质。
综上所述，紫外可见分光光度法和分子荧光光度法是两种现代分析化学中常用的光度
测定技术，它们在原理，应用，检测样品中含量的某种物质等方面都存在差异，根据实际
情况和需要，可以依据自身需要选择不同的光度测量技术，以获得更准确的定量分析结果。
分子荧光光度法基本原理
400
450
500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
三、物质分子结构与荧光的关系
（一）荧光效率（φf） 激发态分子中以发射荧光的光量子数目和 分子吸收激发光的光量子总数之比：
φf =
发射荧光的光量子数目 吸收激发光的光量子总数
[ φf∈（0，1）]
激发态的分子有几种途径可以回到基态, 荧光去 激发比其它去激发快 ,才可以观 察到荧光发射。
（二） 荧光和磷光的产生 激发态分子在极短的时间内回到 去活化过程： 基态的过程 。
无辐射跃迁
途径 体系跨越 -----最常见 辐射跃迁
1. 无辐射跃迁
振动驰豫 内转换 体系跨越 外转换
① 振动驰豫 较高能级分子与其它分子（样品或溶剂） 碰撞，能量变为热能。 ② 内转换和体系跨越 当两个相邻电子能级相距较近以致其振 动能级重叠，电子由较高电子能级以无辐射 跃迁方式至低一级电子能级，称为内转换。
（3）镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与 激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 镜像规则的解释：
基态上的各 振动能级分布 与第一激发态 上的各振动能 级分布类似。
基态上的零振动能级与第一激发态的二 振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也 然。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
620
3.激发光谱与发射光谱的关系 （1）Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。 发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫 消耗了能量。 （2）发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同 波长的能量（如能级图 2 , 1），产生不同 吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振 动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧 光（如’2 ）。
荧光分光光度法
荧光分光光度法荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。
其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。
通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。
荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm，发射波长扫描范围是200-800nm。
可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
荧光分光光度计的工作原理：物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
荧光分光光度计基本结构：①光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故②激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
③发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
④样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
分子荧光分光光度法实验技术
标准样品设置
2019/12/31
待测样品设置
2019/12/31
空白校零
2019/12/31
开始测定
2019/12/31
2019/12/31
2019/12/31
重新计算
2019/12/31
2019/12/31
九、荧光光度计使用注意事项：
1、比色皿使用之前应清洗干净。若比色皿很脏， 清洗方法为：先将比色皿置于铬酸洗液中浸泡半 小时左右，再用蒸馏水洗净，凉干留用。
2019/12/31
一、荧光分析法
物质的基态分子受一激发光源的照 射，被激发至激发态后，在返回基态时， 发射出与吸收光波长相等或较长的荧光。 若物质分子用X射线或红外光激发，则分 别产生X射线荧光或外光荧光。
2019/12/31
一、荧光分析法
通常所指的分子荧光是指紫外-可见光 荧光，即利用某些物质受到紫外光照射后， 发射出比吸收的紫外光波长相等或更长的 紫外荧光或可见荧光，通过测定物质分子 产生的荧光强度进行分析的方法称为荧光 分析。
2019/12/31
七、荧光分光度计的性能
可检测荧光、磷光及生物发光 扫描速度快，可达24000 nm/分，数据采
集速率达80次/秒 波长范围：190-1100 nm 光谱带宽：1.5、2.5、5、10和20 nm五档
切换 具有液体池和固体池，并具有自动控温设备。
2019/12/31
5、罩上仪器罩，打扫室内卫生，并在仪器使用登 记本上填写使用记录。
2019/12/31
操作软件包
2019/12/31
定性分析操作
2019/12/31
预扫描
2019/12/31
2019/12/31
第三章 荧光分光光度法
螯合物中金属离子的发光机理，通常是 螯合物首先通过配位体的*跃迁而被激 发，接着配位体把能量转移给金属离子，导 致d d*跃迁或f f*跃迁，最终发射的是 d*d跃迁或f*f跃迁光谱。
3.3 荧光分析的方法及影响因素 1. 荧光参数 （1）激发光谱和发射光谱 荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光 法进行物质的定性、定量分析的基本参数 和依据。
b. 工作曲线法 先配制一系列不同浓度的标准溶液，分 别测定其荧光值，然后将减去试剂空白荧光 值的标准溶液荧光值与其相应浓度作图，即 得其工作曲线。 根据试液及试液空白荧光值，在此曲线 上即可找到试液的浓度。同时根据工作曲线 的线性情况，可以确定试液测定的最高浓度。
b. 分子的几何排布 物质的分子为平面型，且具有一定的刚 性结构，这样的分子荧光强烈。
对于顺反异构体，顺式分子的两个基团 在同一侧，由于位阻原因不能共平面，而没 有荧光。
c. 芳环上取代基的类型和位置 类型 • 有些取代基可增强荧光。如：-OH、-OR、 -NH2、-NHR、-NR2等；
•
有些取代基可减弱荧光。如：-COOH、 -C=O、-NO2、-Cl、-Br、-I等； 有些取代基影响不明显。如：-F、-SH、 -SO3H等。
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但 由于不是刚性结构，分子处于非同一平面， 因而不发生荧光。
若这些有机化合物和金属离子形成螯合 物后，伴随着分子的刚性增强，平面结构增 大，常会发出荧光。
例如：8-羟基喹啉本身有很弱的荧光， 但其金属螯合物具有很强的荧光。这是由于 刚性和其平面性增加所致。
一般来说，能产生这类荧光的金属离子 具有硬酸型结构，如：Be2+、Mg2+、Al3+等。
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位置 • 邻、对位取代，荧光增强；
分子荧光光度法
分子荧光光度法
分子荧光光度法是一种常用于检测物质浓度和反应动力学的分析方法。
它基于分子在受到光激发后发射荧光的原理，通过测量荧光的强度来确定物质的浓度。
在分子荧光光度法中，首先需要选择一个适合的激发波长，以激发待测物质中的荧光染料或标记物。
当激发波长的光照射到样品中时，样品中的分子吸收光能并跃迁到激发态。
在激发态停留的时间足够长时，分子会发生非辐射跃迁，即释放出荧光。
荧光的强度与待测物质的浓度成正比，因此可以通过测量荧光的强度来确定物质的浓度。
分子荧光光度法具有许多优点。
首先，它具有高灵敏度和高选择性，可以检测到极低浓度的物质。
其次，它具有快速和简便的特点，可以在短时间内完成测定。
此外，分子荧光光度法还具有广泛的应用领域，包括环境监测、生物学研究、医学诊断等。
然而，分子荧光光度法也存在一些限制。
首先，荧光信号受到许多因素的影响，如环境条件、荧光染料的性质等。
因此，在进行分子荧光光度法测定时，需要对这些因素进行严格的控制。
其次，某些样品可能会产生背景荧光干扰，这会降低测定的准确性。
因此，需要采取适当的方法来消除背景荧光的影响。
分子荧光光度法是一种重要的分析方法，它在物质浓度测定和反应
动力学研究等方面具有广泛的应用。
通过合理选择激发波长和采取适当的控制措施，可以获得准确和可靠的分析结果。
这种方法的发展将进一步推动科学研究和实际应用的进步。