荧光光度法
荧光分光光度法的名词解释
荧光分光光度法的名词解释荧光分光光度法是一种常用于分析化学领域的光谱分析技术。
它主要利用物质在受到紫外光激发后吸收能量并发射出可见光的特性进行定量和定性分析。
一、荧光现象解析1. 光激发与光发射在荧光分光光度法中，样品通常处于低能量状态，并能吸收特定波长的紫外光。
当样品受到紫外光激发后，部分激发态的分子会跃迁至高能量的激发态。
而在分子返回低能量态的过程中，会发射出比激发态能级较低的可见光，形成荧光现象。
这可用于分析样品的组成、浓度、结构及化学性质等。
2. 荧光寿命荧光寿命是指物质从受到激发到光发射结束所经过的时间。
荧光分光光度法可通过测量样品中发射的荧光光强随时间的变化，计算出荧光寿命。
荧光寿命与物质的环境、浓度、分子结构等因素有关，因此可以用来定量分析。
二、荧光分光光度法的原理1. 荧光光谱分析荧光分光光度法通过测量样品的荧光光谱来分析物质的成分和性质。
利用荧光光谱可以确定荧光发射的波长范围，并对不同波长处的发射强度进行测量。
这些荧光光谱图可以用来确定物质的定性和定量分析。
2. 荧光光度法荧光光度法利用荧光光度计测量样品的荧光强度和荧光寿命。
荧光光度计通常包含紫外-可见光源、光栅或单色仪、荧光探测器等。
样品受到激发后发射的荧光光通过光栅或单色仪进行分光，然后荧光探测器测量各个波长处的荧光强度。
这种光度计可提供高灵敏度和准确的荧光测量结果。
三、荧光分光光度法的应用1. 化学分析荧光分光光度法广泛应用于化学分析领域。
它可以通过测量荧光光谱和荧光强度，实现对物质浓度的定量测定，如荧光显微分析、荧光光谱分析、化学发光等。
此外，荧光分光光度法还可用于监测环境中的有毒物质和污染物。
2. 生物医学研究荧光分光光度法在生物医学研究中也具有重要应用。
例如，可以利用荧光探针与特定的生物分子结合，实现对DNA、RNA、蛋白质等生物分子的定性和定量分析。
此外，荧光分光光度法在药物研究、生物标记物探测、细胞成像等方面也发挥重要作用。
荧光分光光度法的原理
荧光分光光度法的原理荧光分光光度法是一种常用的分析技术，主要用于测定物质中的荧光发射强度。
它基于荧光物质吸收能量后发生激发态转变的原理，通过测量样品在不同波长下发射的荧光强度来分析物质的成分和浓度。
荧光分光光度法的原理基于荧光现象，即物质在吸收辐射能量后，会从基态跃迁到激发态，然后再发射出荧光。
这种荧光发射的波长和强度与物质的结构和环境有关，因此可以通过测量荧光的特性来获得样品的信息。
荧光分光光度法的基本装置包括激发源、选择性的滤光片或光栅、样品池和荧光检测器。
激发源通常使用紫外光或可见光，其波长可以根据待测样品的特性进行选择。
滤光片或光栅用于选择特定的波长范围，以便测量样品在该波长下的荧光强度。
样品池用于容纳待测样品，并通过光路使激发光和荧光光进入检测器进行测量。
在进行荧光分光光度测量时，首先需要选择适当的激发光源和荧光检测器，以及调节合适的滤光片或光栅。
然后将待测样品放入样品池中，使其与激发光发生作用。
样品吸收激发光后，发生激发态转变，并发射出荧光。
荧光光通过滤光片或光栅进行选择性筛选，然后进入荧光检测器进行测量。
荧光分光光度法的应用十分广泛。
在生物医学领域，它常用于荧光染料的检测和荧光标记的分析。
在环境监测中，荧光分光光度法可以用来检测水中的有机物污染物。
此外，荧光分光光度法还可以用于食品检测、药物分析、环境污染监测等领域。
荧光分光光度法相比于其他分析技术具有许多优点。
首先，它具有极高的灵敏度，可以检测到很低浓度的物质。
其次，荧光分光光度法对样品的破坏较小，可以进行非破坏性分析。
此外，荧光分光光度法还具有选择性和快速性的特点，可以同时测定多个物质。
然而，荧光分光光度法也存在一些局限性。
首先，荧光分光光度法对样品的环境要求较高，如温度、pH值等因素都会影响荧光强度。
其次，荧光分光光度法在样品有强荧光背景的情况下，可能会受到干扰。
此外，荧光分光光度法对荧光物质的选择性较差，容易受到其他物质的影响。
荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因
荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因荧光光度法是一种广泛应用于分析化学及生物检测的技术，它能够高灵敏度地测定微量物质的含量。
它的灵敏度高于吸收光度法的原因是：
一、荧光现象本质上是一种原子、分子或物质系统对外界入射
光的能量增强的过程，即激发状态的能量高于低激发状态，而吸收光度法需要物质吸收入射光加以衰减以达到检测目的，这种能量衰变会使检测的灵敏度有所降低。
二、荧光光度法的检出上限更低，可以检测超出极微量的组分，而吸收光度法的检测灵敏度较低，往往只能检测到微量组分；
三、荧光光度法使用的激发光源通常为高压氙灯，其光谱线宽
度比吸收光度法使用的镍钴灯窄，能更有效、更精确地激发待测物质的低激发状态，而吸收光度法使用的镍钴灯的光谱线宽度较宽，激发效果较弱。
四、荧光光度法检测时，可以选择合适的激发光波长，只激发
待测物质的特征荧光，而吸收光度法由于只能使用单一波长的入射光，所产生的检出噪声也更大，从而使检出灵敏度降低。
- 1 -。
荧光光度分析法
26
浓度测定 1、如何进行校准和浓度测定 如何进行校准和浓度测定 按以下步骤，调整仪器，以便获取数据 第1步： 点击视图中的开始 开始(Stare)按扭，指向程序 开始 程序 (Program)→Cary Eclipse ， 然后选择扫描 扫描(Scan)即显示扫描功能框。 扫描 第2步： 点击设置 设置(Set up)，进入设置 设置(Set up)对话框， 设置 设置 指定检测方法的参数
荧光光度分析法
1
一、基本原理
1.荧光的定义 1.荧光的定义 在紫外光或波长较短的可见光照射 后，一些物质会发射出比入射光波长更 --------荧光 荧光。 长的光 --------荧光。以测量荧光的强度 和波长为基础的分析方法叫做荧光光度 和波长为基础的分析方法叫做荧光光度 分析法。 分析法。
2
4
分子内的光物理过程
VR 2 1 v=0 S2 2 1 v=0 S1 ic VR isc
A1、A2. 吸收 、 F. 荧光 P. 磷光 ic. 内转化 isc. 体系间窜跃 VR. 振动松弛 VR 2 1 v=0 T1
ic A2 A1 F P
isc
3 2 1 v=0 S0
5
6
3. 荧光强度与浓度的关系
11
二、Varian Cary Eclipse 荧光 分光光度计的特点
1. 硬件及硬件的主要特点 ⑴ 高能闪烁光源-----氙灯 高能闪烁光源-----氙灯 由于荧光物质的荧光强度与 激发光源的强度成正比，Eclipse采用了无须预 激发光源的强度成正比，Eclipse采用了无须预 耗能12 但脉冲输出能量却高达75 热、耗能12 W 但脉冲输出能量却高达75 KW 的闪烁氙 Xe） 并利用电子技术控制, 的闪烁氙（Xe）灯，并利用电子技术控制,使其 仅在发出测量指令后才闪烁。 仅在发出测量指令后才闪烁。这一设计给荧光 分析者带来极大的方便. 分析者带来极大的方便.
荧光光度法原理
荧光光度法原理
荧光光度法是一种基于物质的发光性质进行分析的方法。
荧光光度法原理主要涉及荧光物质的激发和发射过程。
荧光物质具有特定的能级结构，其中包含基态和激发态。
当荧光物质受到外部能量（如光的激发，化学反应等）的作用时，某些电子会从基态跃迁至激发态。
这种激发态并不稳定，因此电子会很快回到基态。
在返回基态的过程中，电子释放出一部分能量，并以光的形式发射出来。
这个发射的光就是荧光光谱。
荧光光谱的发射波长和强度是荧光物质的特征，可以用来进行分析测定。
荧光光度法基于以上原理进行测定。
待分析物（荧光物质）首先被激发，可以通过外部光源的照射或其他激发方法实现。
激发后，荧光物质会发出特定波长的荧光光谱。
通过选取合适的波长进行测量，可以得到荧光信号的强度。
待测物的浓度与荧光强度有一定的关系，因此可以通过测量荧光信号的强度来间接测定待测物的浓度。
荧光光度法具有灵敏度高、选择性好、分析速度快等优点，被广泛应用于生物分析、环境监测、药物分析等领域。
荧光分光光度法原理
荧光分光光度法原理荧光分光光度法是一种基于物质吸收与发射荧光的分析技术。
它利用物质在吸收紫外光能量后，发生电子从基态跃迁到激发态，再经过热辐射和无辐射跃迁的复合过程，从激发态退回基态，释放出的能量以荧光形式发射出来。
通过测量荧光的强度和波长分布，可以对样品中的化合物进行定量和定性分析。
1.激发：激发光源照射样品溶液，激发光源通常为紫外光和可见光，其波长需要与所研究的物质的激发波长匹配。
激发光源经过滤波器选择特定波长的光线，然后通过光导纤维引导到样品室中。
2.激发态产生：样品中的物质吸收光能量，使得物质的电子由基态跃迁到激发态。
激发态的产生取决于样品中的化合物种类，以及激发光源的能量和波长等因素。
3.荧光发射：激发态的物质经过热辐射和无辐射跃迁的复合过程，返回基态。
在这个过程中，部分能量以荧光的形式发射出来。
发射的荧光波长与激发光的波长不同，可以通过光栅或者单色仪分离出来。
4.荧光光谱测量：通过荧光光谱仪对荧光进行测量，荧光光谱仪通常由光栅、检测器（如光电倍增管）和数据采集系统组成。
荧光光谱仪能够选择特定波长范围的荧光进行测量，并将荧光信号转化为电信号。
5.信号处理：荧光信号经过光电器件转换为电信号后，通过放大、调理和滤波等处理，最终通过数据采集系统记录和分析。
荧光分光光度法的优势在于其高灵敏度、高选择性和广泛的应用范围。
它可以应用于环境、食品、制药、生物化学等领域的定量分析和荧光标记分析。
此外，荧光分光光度法还可以结合其他技术，如高效液相色谱、毛细管电泳等，提高其分析的准确性和灵敏度。
荧光分光光度法的一些应用包括：药物分析、痕量元素测定、蛋白质分析、环境污染物检测、核酸分析、生物标记等。
在荧光分析中，还有一些常用的技术方法，如荧光共振能量转移（FRET）、荧光探针和荧光染料等，这些方法进一步扩展了荧光分光光度法的应用范围和分析手段。
总之，荧光分光光度法基于物质的吸收与发射荧光原理，通过测量荧光的强度和波长分布，实现对物质的定量和定性分析。
分子荧光光度法
分子荧光光度法
分子荧光光度法是一种常用于检测物质浓度和反应动力学的分析方法。
它基于分子在受到光激发后发射荧光的原理，通过测量荧光的强度来确定物质的浓度。
在分子荧光光度法中，首先需要选择一个适合的激发波长，以激发待测物质中的荧光染料或标记物。
当激发波长的光照射到样品中时，样品中的分子吸收光能并跃迁到激发态。
在激发态停留的时间足够长时，分子会发生非辐射跃迁，即释放出荧光。
荧光的强度与待测物质的浓度成正比，因此可以通过测量荧光的强度来确定物质的浓度。
分子荧光光度法具有许多优点。
首先，它具有高灵敏度和高选择性，可以检测到极低浓度的物质。
其次，它具有快速和简便的特点，可以在短时间内完成测定。
此外，分子荧光光度法还具有广泛的应用领域，包括环境监测、生物学研究、医学诊断等。
然而，分子荧光光度法也存在一些限制。
首先，荧光信号受到许多因素的影响，如环境条件、荧光染料的性质等。
因此，在进行分子荧光光度法测定时，需要对这些因素进行严格的控制。
其次，某些样品可能会产生背景荧光干扰，这会降低测定的准确性。
因此，需要采取适当的方法来消除背景荧光的影响。
分子荧光光度法是一种重要的分析方法，它在物质浓度测定和反应
动力学研究等方面具有广泛的应用。
通过合理选择激发波长和采取适当的控制措施，可以获得准确和可靠的分析结果。
这种方法的发展将进一步推动科学研究和实际应用的进步。
原子荧光光度法基本原理
原子荧光光度法基本原理原子荧光光度法是一种基于原子荧光现象的分析方法。
该方法利用原子在高温火焰、等离子体或电火花等条件下，吸收光能使得电子跃迁到高能级，然后由高能级返回基态时发射荧光，通过测量荧光的强度来确定待分析物质的浓度。
以下将对该方法的基本原理进行详细介绍。
原子荧光光度法的原理基于原子的能级结构。
原子由原子核和电子组成，电子绕核心旋转形成一系列不同的能级。
当原子吸收能量时，其电子会从低能级跃迁至高能级，此时处于激发态。
当电子从高能级返回基态时，会发出荧光。
不同元素的原子具有不同的能级结构，因此其荧光发射的波长也是独特的，可以用来作为该元素的特征。
在原子荧光光度法中，首先需要将待分析物质转化为气相，这可以通过高温火焰、等离子体或电火花等方式实现。
燃烧火焰或等离子体产生高温，使得待分析物质原子化、激发和荧光发射。
电火花法则是通过电击将待分析物质转化为高温等离子体。
一旦转化为气相，待分析物质的原子与空气中的气体原子碰撞，被激发到高能级。
随着激发态原子返回基态，会发生荧光发射。
待分析物质的浓度与荧光发射的强度成正比，因此可以通过测量荧光强度来确定物质的浓度。
在实际分析中，荧光信号的测量需要借助光谱仪或荧光光度计。
荧光光度计由荧光激发源、样品池、光学系统和荧光探测器组成。
荧光激发源产生适当波长的激发光，经过光学系统聚焦到样品池中。
样品池中的待分析物质被激发形成荧光，荧光通过光学系统聚焦到荧光探测器上。
荧光探测器将荧光信号转化为电信号并放大，然后通过计算机处理和分析，得到待分析物质的浓度。
原子荧光光度法具有许多优点。
首先，它能够提供高灵敏度的分析结果，因为原子荧光具有较高的荧光发射效率。
其次，该方法具有较宽的线性测量范围，可以分析浓度从ppm到ppt级别的物质。
此外，由于荧光信号只受到背景干扰的影响很小，因此具有较低的检测限。
最后，该方法具有较好的选择性，因为原子的能级结构使得每个元素的发射谱线都是独特的，可以用来进行元素的定性和定量分析。
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CH2 OH
例：维生素B2的测定
称核黄素，是一种生长促进剂，
常存在于动物肝脏、肉类、蛋黄、豆 类、花生、蘑菇和海藻中， VB2易溶 于强酸或强碱性溶液。
HC
3
HO CH HO CH HO CH CH2 N N O N O NH
H3 C
在低浓度情况下，F= KC，F与C呈线性关系，
在pH6～7荧光最强。
S = ±1/2（自旋量子数） M = 2S+1（电子能态多重性）
分子的激发态
单重态： 当基态分子的电子都配对时，S = 0，多重性
M = 1，这样的电子能态称为单重态。
单重电子激发态： 当基态分子的成对电子吸收光能之后，被激
发到某一激发态上。如果它的自旋方向不
变，S = 0，M = 1，这时的激发态叫单重电
去活过程及荧光的产生
物质分子处于基态最低振动能级
紫外光照射，吸收两个 能级之差的能量
跃迁至单重电子激发态的多个能级
由于分子之间的振动与撞击， 能 量降至第一激发态最低振动能级。
去活过程及荧光的产生
激发态较高能级
激发态较高能级 激发态最低能级
பைடு நூலகம்
能量以热的 形式释放
（无辐射迁）
能量以光量 子形式释放
基态各能级
荧光光度计主要部件
检测器： 光电管或光电倍增管。 样品池 石英样品池
荧光分光光度法用途： 定性分析：因物质结构不同，吸收紫 外光波长也不同。
定量测定：同一种物质的稀溶液，
浓度大的发射的荧光较强。
无机化合物的分析
• 无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定 的为数不多，但与有机化合物反应生成具荧光
能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致
癌活性的多环芳烃——荧光分析法是最主要的 测定方法。
例：3，4 – 苯并芘的测定
3，4 – 苯并芘为强致癌物质
煤炭、石油、天然气等燃料不完全燃烧以及吸 烟、焚烧垃圾都会产生3，4 – 苯并芘，汽车 尾气也是主要来源。 食品加工过程也会产生3，4 – 苯并芘，尤其 是烟熏、油炸、烘烤食品。 分析测定：用环己烷将3，4 – 苯并芘从试样 中提取出来，用碱将提取液的脂肪类物质皂化， 然后用色谱法分离纯化，用95%乙醇稀释，用 荧光分光光度计测定相对荧光强度进行定量。
当φf、I0、ε、b 固定不变时，F 与 C 成正比。
∴ F = K ∙c （εb c≤0.05 ）（2）
定量分析方法 标准曲线法： F = K ∙ c 以荧光强度为纵坐标，标准溶液 浓度为横坐标绘制标准曲线。
定量分析方法
标准对照法 ：
若标准曲线通过零点，就可以选择其线性
范围，用标准对照法进行测定。
产生荧光
去活过程
处于激发态各不同振动能级的电子
无辐射跃迁
去活过程 产生荧光 基态
磷光的产生
激发态分子
无辐射跃迁
单重电子激发态最低振动能级
无辐射跃迁（体系跨越）
第一电子三重激发态
光辐射，产生磷光
降至基态各能级
磷光和荧光的区别
荧光
产生 S1* 最低振动能
磷光
三重态 较长 10-4 ～几秒 少见 基态
的有机配合物后，进行荧光分析的元素达70多
种，其中较常采用荧光法测定的元素有：Be、
Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素。
有机化合物的分析
• 脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身 能发射荧光的很少，一般需要与某些试剂反应
后才能进行荧光分析。
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数
荧光的定量分析 Ia = I0（1 - e - 2.303εbc ）
e - 2.303εbc = 1 - 2.303εbc，（εb c≤0.05）
Ia = I0 · 2.303εbc F =φf ∙ Ia
荧光的定量分析
荧光强度与溶液浓度的关系:
∴ F =φf ∙Ia = 2.303∙φf∙ I0∙εb c
荧光法与UV-Vis法的比较： 相同点：
都需要吸收紫外-可见光，产生电
子能级跃迁。
荧光法与UV-Vis法的比较：
不同点：
UV-Vis法测定的是物质溶液对紫外-可 见光的吸收程度 (A) 。
荧光法测定的是物质经紫外-可见光照 射后发射出的荧光的强度(F)。
荧光和磷光光谱法
激发态 第一激发态最低振动能级 基 态
概 述：
分子结构：分子中含有共轭双键体系，具
有吸收辐射能，产生电子跃迁
的能力。
环境条件：适当的辐射能照射，温度、溶 剂、酸碱度等。
概
述：
荧光光谱的范围较广，可以从X光到红
外光谱区。 某些物质受紫外光照射后能发射比吸 收的紫外光波长更长的紫外光荧光或 可见荧光。
基本概念：
光致发光：当物质吸收电磁辐射并被激
质分子的相互作用引起荧光强
度降低的现象。
荧光熄灭剂：
荧光的定量分析
I0 F
Ia
I
F = Φ f Ia （1）
荧光的定量分析 F =φf ∙ Ia ，Ia = I0 - I
I / I0 = 10-εbc
I = I0· -εbc 10
Ia = I0 - I0· -εbc = I0（1- 10-εbc ） 10
第九章 分子荧光光度法
Molecular Fluorescence Spectrophotometry
内
容
分子荧光光度法概述
去活过程及荧光和磷光的产生
物质分子结构与荧光的关系
环境对荧光的影响
荧光定量分析方法 荧光分光光度计
概
述：
一种物质能否发射荧光，取决于它 的分子结构和它所处的环境条件。
发后产生的一种发光形式。
分子荧光光度法：利用物质分子发出荧 光的强度（F）进行分析的方法。
用 途
定性分析：
由于不同物质结构不同，吸收的激发光波 长也不同，利用这一性质可以鉴别物质。 定量测定：
同一物质的稀溶液，浓度大的荧光较强，反
之则较弱，利用这一性质可进行定量测定。
荧光光度法的特点：
优点：灵敏度高，可达 ng/ml ；选择性强， 重现性好；取样少；可提供较多物理 参数。 缺点：许多物质本身不能发射荧光，因此， 应用不够广泛。
Fs –F0 = 2.303 ∙φf ∙ I0 ∙εbcs （1）
Fx –F0= 2.303 ∙φf ∙ I0 ∙εb cx （2）
cx = cs ∙（ Fx – F0 ）/ （Fs – F0）
影响荧光测定的因素
激发光源
散射光：当一束平行光投射在液体样品上，
部分光线透过溶液，小部分由于光
子和物质分子碰撞，使光子运动方向
发生改变而向不同角度散射，这种光
称散射光。
散射光的影响
瑞利散射光（Rayleigh Scattering light）：
光子和物质分子碰撞时，未发生能量的 交换，仅光子运动方向发生改变。 拉曼散射光（Raman Scattering light）： 在光子运动方向发生改变的同时，物质
分子的能量会发生改变。
物质分子必须具有能够吸收紫外或可见光的
结构，并且能产生π π* 或 n π* 跃迁。
荧光物质必须有较高的荧光量子产率。
发射荧光量子数
吸收激发光量子数
荧光量子产率 =
有机化合物分子结构与荧光的关系： 共轭结构： 凡是能提高π电子共轭度的结构， 都会增大荧光强度，并使荧光光 谱长移。
苯
萘
蒽
有机化合物分子结构与荧光的关系：
在430
～ 440nm蓝光照射下，发出绿色荧光，
em = 535nm下测 F ，用标准曲线法测定。
内容小结：
环境对荧光的影响
溶液荧光强度和该溶液的吸光程度以及
溶液中荧光物质的荧光量子产率有关。
F = Φf Ia
F = K ∙c
荧光定量分析法
照法。
标准曲线法和标准对
内容小结： 影响荧光测定的因素主要是激发光源
子激发态。
分子的激发态
图示：
单重电子 激发态
基态
分子的激发态
三重电子激发态： 若通过分子内部的一些能量转移，或能阶间 的跨越，成对电子中的一个电子自旋方向倒 转，使两个电子自旋方向相同而不配对，这
时S=1，M=3，这种电子激发态称三重电子激
发态（三重态）。
分子的激发态
激发态
三重电子激发态
S=1，M=3
刚性平面：分子的刚性及共平面性越大, 荧光量子产率就越大。
OH O OH
OH OH
C
O
C
O
C
O
C
O
荧 光 素
酚 酞
取代基：在芳香化合物的芳香环上，进 行不同基团的取代，对该化合
物的荧光强度和荧光光谱都会
产生影响。
环境对荧光的影响 温度
温度升高 分子间碰撞次数增加
分子内能转化加速 荧光强度降低
对荧光强度的影响和散射光的干扰。
荧光光度计的基本结构和工作原理。
级
波长 寿命 几率
基态
较短 10-8 S′ 较大
激发光谱和荧光光谱
激发光谱：将激发光的光源用单色器分光，测
定不同波长照射下所发射的荧光强
度（F），以 F做纵坐标，激发光波
长λ做横坐标作图。
激发光谱反映了激发光波长与荧光强度之间
的关系。
激发光谱和荧光光谱
荧光光谱：固定激发光波长，让物质发射的荧
光通过单色器，测定不同波长的荧