透射电镜制样
透射电镜的样品制备技术
平整的废包埋块压在其上,于60 ℃聚合硬化.将 粘有包埋块的玻片置于90 ℃热板上加温10s,取
下包埋块修块,超薄切片及电子染色.
构不清
超薄切片质量好坏指标
• 样品结构保存良好,结构细腻,无丢失. • 切片厚薄均匀,厚度在60-90nm之间.表面无
皱折、刀痕、震颤等缺陷. • 样品反差良好,无染色沉淀. • 支持膜厚度适中,观察时不产生漂移和破裂.
六.电子染色
• 利用重金属盐类选择性地与生物样品中不同 结构成分相结合,来提高结构成分散射电子的 能力,从而增加图像反差的染色,又称为正染
Fig. 4. Colloidal gold nanoparticles 20 nm. 1: anti-TTX Mab labelled colloidal gold nanoparticles showing the protein halo around the labelled nanoparticles, 2: unlabelled colloidal gold nanoparticles.
• 多用于解剖关系比较复杂、质地柔软或对 缺氧比较敏感的组织.以保证器官的血液供 给,避免缺血造成的组织损伤或自溶.
• 操作步骤 在动物麻醉后保持血液供应的条件下,
边解剖边在取材的部位局部滴加固定液,直 至组织达到适当的硬度为宜.
灌流固定法
• 指通过血液循环途径,将固定液灌注 到组织器官内,进行固定后再取材的方法. 常用于对缺氧敏感,死后变化快的组织器 官,如中枢神经系统、心脏、胃肠道、视 网膜和肾脏等.也可用于所取组织的种类 较多以及解剖关系比较复杂、难以渗透 的组织器官.
透射电镜制样流程
透射电镜制样流程透射电镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）制样是指通过一系列的化学和物理方法来制取透射电镜所需的样品。
透射电镜是一种高分辨率的显微镜，可以在纳米尺度下观察材料的原子结构和微观形态。
为了获取高质量的TEM图像，制样过程非常关键。
下面将详细介绍透射电镜制样的流程。
1.样品制备：样品可以是纳米颗粒、薄膜、纤维或生物样品等。
首先，准备适宜的基底材料，如碳膜覆盖的铜网格或碳膜覆盖的铜刀片。
样品通常需要制成非常薄的切片，通常在50到100纳米的厚度范围内。
制备方法包括机械切割、电解石蠟切片、离子切割或电离蚀刻等。
2.固定和固化：对于生物样品，需要先进行固定处理，以保持样品的形态和结构。
常用的固定剂包括戊二醛、酸性醛或重金属盐。
然后，固定的样品需要进一步处理以固化，如用过氧化物、树脂或聚合物进行浸渍，以增加样品的稳定性。
3.切割和悬浮：将固化的样品切割成适当的尺寸和形状。
使用超微切割机、离子切割仪或其他切割工具进行切割。
切割后，样品通常会悬浮在水或有机溶液中，以便进一步处理。
4.脱水和对比染色：脱水是将样品从水中逐渐转移到有机溶剂中的过程。
这种处理可以控制样品的体积，以减少对比染色和观察中的伪影。
脱水通常通过渗透固定液逐渐转移，然后通过有机溶剂（如醋酸乙酯、丙酮或丙二醇）进行交换。
5.嵌入：将样品嵌入到透明的聚合物或树脂中。
嵌入过程中，通常采用逐渐增加浓度的树脂混合物，以确保样品得到完全浸透。
然后，将样品与树脂进行硬化，通常在高温下进行。
6.超薄切片：将固化的样品切割成非常薄的切片。
使用超薄切片机和钻磨刀片进行切割。
切割后的切片应尽快收集并转移到透明的铜网格或铜刀片上。
7.超薄切片处理：超薄切片通常需要进行后继处理以增强对比度和解决其他问题。
这可能包括染色、胶层增强或薄膜剥离等方法。
8.观察：将制备好的样品放入透射电镜中进行观察。
在观察前，样品需要在真空中或过氮气中去除气泡和其他杂质。
细菌透射电镜样品制备方法
细菌透射电镜样品制备方法
细菌透射电镜样品制备可参考以下步骤：
1. 将适量无菌水加入生长良好的细菌斜面内，用吸管轻轻拨动菌体制成菌悬液。
2. 用无菌滤纸过滤菌悬液，并调整滤液中的细胞浓度为10^8-10^9个/毫升。
3. 取等量的上述菌悬液与等量的2％的磷钨酸钠水溶液混合，制成混合菌悬液。
4. 用无菌毛细吸管吸取混合菌悬液滴在铜网膜上。
5. 经3-5分钟后，用滤纸吸去余水，待样品干燥后，置低倍光学显微镜下检查，挑选膜完整、菌体分布均匀的铜网。
细菌透射电镜样品制备的方法还有很多，具体步骤可能因细菌的种类和实验需求而有所不同。
透射点镜的生物样本的制样过程
透射电镜生物样品制作过程透射电镜生物样品制作过程大致经过取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤。
一. 取材取材时要注意的要点是：快、小、冷、净、准、避免机械损伤。
取材方法：将固定液滴在冰台上的卡片上，在麻醉后的动物身上快速用剪刀剪取一块组织，用预冷的过的缓冲液将剪下的组织洗净，迅速放到卡片上的固定液中，用刀片切去被镊子夹到和剪刀剪过的组织，后按实验的目的将组织切成0.5~1mm2的立方或横截面为1mm2的长方体。
用牙签将切好的组织块转移到装有固定液的小瓶中，贴好标签并置于4℃的冰箱中。
二．固定以下操作尽可能在4℃的环境下，使用的溶液也要保存在4℃的冰箱中。
1、戊二醛固定：用镊子轻轻的将组织块从固定液中取出，放在卡片上的固定液中，利用双面刀片把组织块切成小块状，放进盛有1~1.5ml的0.1%的戊二醛的固定液的细管中，将吸管放进真空箱中，将大气压抽到760托后取出，使组织块在戊二醛溶液中固定1小时。
2、漂洗：经戊二醛固定的组织块要用1~1.5ml的0.1%PBS缓冲溶液漂洗，漂洗的次数为5次，在漂洗到第四次时可以将组织留在PBS漂洗液中过夜，放入4℃的冰箱中。
第二天早晨再进行第五次漂洗。
3、四氧化锇固定：向漂洗过的组织中加入0.5ml的0.1%四氧化锇固定液，固定时间为2个小时。
由于四氧化锇具有毒性，因此操作在通风橱里进行。
4、漂洗四氧化锇：用0.1%PBS缓冲溶液漂洗剩余的四氧化锇，然后再漂洗两次，其时间间隔为10min。
三．脱水为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用的脱水剂是乙醇和丙酮。
1、酒精脱水:用浓度梯度依次为30%、50%、70%、90%的酒精，依次浸泡组织，其浸泡的时间一般为10min。
当在70%梯度的酒精时，样品可以放置过夜。
2、丙酮脱水：用浓度梯度为90%、100%的丙酮浸泡组织，在纯丙酮中浸泡三次。
透射电镜制样步骤以及注意事项
透射电镜制样步骤以及注意事项透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM）是目前最常用的高分辨率电子显微镜，可以用于观察物质的微观结构。
制备TEM样品的过程非常重要，下面将详细介绍TEM制样的步骤以及需要注意的事项。
制备TEM样品的步骤一般包括样品的选择、固定与固化、切片、薄化、网格制备和贴膜等。
第一步是样品的选择，样品应具有研究价值且适合观察。
例如，生物样品可以是细胞、组织或器官的薄片，金属样品可以是扁平的块状、粉末或薄膜等。
第二步是固定与固化。
对于生物样品，常用的固定方法包括浸泡法、灌注法和切片冷冻法；对于无机样品，可以使用固定剂将样品固定在固定剂中。
第三步是切片。
将固定好的样品切割成薄片，一般要求薄片的厚度在100 nm以下，通常使用超薄切片机来进行切割。
第四步是薄化。
将切割好的样品进行薄化处理，使其达到TEM观察所需的薄度。
常见的薄化方法有机械薄化、电化学薄化和离子薄化等。
第五步是网格制备。
将薄化好的样品放置在铜网格上，网格的选取应该根据所研究样品的性质和需要进行选择。
最后一步是贴膜。
将组织切片或带有样品的网格进行贴膜，以保护样品并提高图像的对比度。
在以上步骤中，需要注意的事项有：1.样品在制备过程中要避免受到污染或氧化，尽量在纯净无尘的环境中进行操作。
2.固定剂的选择要合理，不同的样品可能需要使用不同的固定剂，应根据需要进行选择。
3.切片时要注意刀片的尖锐度和切割角度，以免对样品造成损伤或变形。
4.薄化过程中要控制好加工参数，以保证样品的均匀薄化。
5.制作网格时应选择合适的网格尺寸和类型，以适应观察需求。
6.贴膜时要使薄膜均匀平整，并避免出现气泡或杂质。
总之，TEM制样是一项复杂而关键的过程，要保证样品的质量和可观察性，需要仔细选择方法、控制操作参数、注意样品的保护与处理。
合理的样品制备能够获得高质量的TEM图像，并提供准确的实验数据和结论。
透射电镜样品制备
透射电镜试样制备一、实验内容及目的了解透射电镜对试样的要求，熟悉透射电镜试样的制备过程，制备一个合格的透射电镜试样。
二、薄膜样品的制备用于透射电镜下观察的试样厚度要求在50-200nm之间，试样的制备过程大致可以分为以下三个步骤：第一步从实物或大块样品上切割厚度为0.3-0.5mm厚的薄片。
电火花线切割法是目前用得最广泛的方法，它是用一根往返运动的金属丝作切割工具，以被切割的样品作阳极、金属丝作阴极，两极间保持一个微小的距离，利用其间的火花放电进行切割。
电火花切割可切下厚度小于0.5mm的薄片，切割时损伤层比较浅，可以通过后续的磨制或减薄过程去除。
电火花切割只能切割导电样品，对于陶瓷等不导电样品可用金刚石刃内圆切割机切片。
第二步样品薄片的预减薄。
预减薄的方法有两种，即机械法和化学法。
机械法是通过手工研磨来完成的，把切割好的薄片一面用粘接剂粘在样品座表面，然后在水砂纸磨盘上进行研磨减薄。
应注意把样品平放，不要用力太大，并使它充分冷却。
减薄到一定程度时，用溶剂把粘接剂溶化，使样品从样品座上脱落下来，然后用同样方法研磨另一个面直至样品被减薄至规定的厚度。
（如果材料较硬，可减薄至70μm左右；若材料较软，则厚度不能小于100μm。
另一种预先减薄的方法是化学薄化法。
这种方法是把切割好的金属薄片放入配制好的化学试剂中，使它表面受腐蚀而急需减薄。
因为合金中各组成相的腐蚀倾向是不同的，所以在进行化学减薄时，应注意减薄液的选择。
化学减薄的速度很快，因此操作时必须动作迅速。
化学减薄的最大优点是表面没有机械硬化层，减薄后样品的厚度可以控制在20-50μm 。
经化学减薄的样品最终抛光穿孔后，可供观察的薄区面积较大。
但是化学减薄时必须事先把薄片表面充分清洗，否则将得不到满意的结果。
第三步最终减薄目前效率最高和操作最简便的方法是双喷电解抛光法，图为一台双喷式电解抛光装置的示意图。
将预先减薄的样品剪成直径为3mm的圆片,装入样品夹持器中。
透射电镜制样要求与制样方法
透射电镜制样要求与制样方法1. 样品一般应为厚度小于100nm的固体。
2. 样品在电镜电磁场作用下不会被吸出，附于极靴上。
3. 样品在高真空中能保持稳定。
4. 不含有水分或其它易挥发物，含有水分或其他易挥发物的试样应先烘干。
TEM样品常放置在直径为3mm的200目载网上纳米粉末样品的制备方法1、研磨法将（研磨后的）粉末放在去离子水或无水乙醇溶液里，用超声波分散器将需要观察的粉末分散成悬浮液。
用滴管滴几滴在覆盖有支持膜的电镜载网上，待其干燥(或用滤纸吸干)后, 即成为电镜观察用的粉末样品。
载网种类：方华支持膜：方华支持膜的化学成分是聚乙烯醇缩甲醛，由于是纯的有机膜，所以膜的弹性好，厚度通常为 10nm 左右，透射电镜观察时背底影响小。
但方华膜因导电性不好，在电子束照射下，易因高温或电荷积累，产生样品漂移甚至膜破损，通常在 100kV 电镜和生物样品中使用较多。
碳支持膜：是一种最常用的支持膜，有两层膜结构。
从下至上依次为裸网、方华膜和碳膜，由于碳层具有较强的导电性和导热性，弥补了无碳方华膜的荷电效应以及热效应，增强了膜整体的稳定性，适合大多数纳米材料和生物样品的一般形貌观察用于常规样品制样。
微栅：在膜上制作出微孔，以便使样品搭载在微孔边缘，使样品“无膜”观察，提高图象衬度。
观察管状、棒状、纳米团聚物效果好，特别是观察这些样品的高分辨像及mapping时更是最佳选择。
超薄碳膜：在微栅的基础上叠加了一层很薄的碳膜，一般为3-5纳米。
这层超薄碳膜的目的是用超薄碳膜把微孔堵住。
主要针对粒度较小的纳米材料。
如10纳米以下分散性很好的纳米材料，如果用微栅可能从微孔中漏出，如果在微栅孔边缘，由于膜厚可能会影响观察。
所以用超薄碳膜就会得到很好的效果。
纯碳膜：当样品所用的有机溶剂（氯仿、甲苯等）能够溶解方华膜时，载网膜中就要去除方华膜，只剩碳膜，称为纯碳膜，碳膜的厚度通常为 20nm 左右，在高分辨观察时背底的影响也比较明显。
透射电镜生物制样
透射电镜生物制样透射电镜（Transmission Electron Microscope, TEM）是一种强大的工具，用于研究和观察生物制样，特别是在纳米级别下的细胞和组织结构。
利用透射电镜，科学家可以深入研究生物体内部的微观结构和化学组成，为我们深化理解生命的基本单位提供了巨大帮助。
在生物制样的过程中，首先需要对样品进行固定，以保持其原始的形态和结构。
常用的固定剂包括冷冻与化学固定剂。
冷冻固定将样品迅速冷冻至极低温，以保留细胞的天然形态和水合状态。
化学固定则通过化学反应交联细胞中的分子结构，稳定样品并防止其后续的变化。
固定后，样品需要进行剖面制备。
通常采用超薄切片技术，将样品切割成约70至100纳米厚的薄片。
这一步骤需要高超净实验室环境和专业的技术操作，以确保样品的质量和薄片的均匀性。
之后，透射电镜的操作步骤就开始了。
样品薄片被放置在透明的铜网上，并通过仔细的步骤逐渐加膜、压制，最终制备成为透射电镜样品。
为了提高样品的对比度，在样品制备过程中，常常需要对其进行染色。
例如，使用重金属盐（如铇酸）对样品进行染色，使得不同细胞组分在电镜下有更明显的特征。
在样品制备完毕后，样品会被放置在透射电镜的样品室中。
电子束经过样品，透射到另一端的检测器上。
通过检测电子束的强度和散射情况，透射电镜可以产生高分辨率和详细的图像。
这些图像经过处理和分析，可以揭示出生物样品中微观结构的细节。
利用透射电镜生物制样，可以提供许多重要的信息。
例如，可以观察到细胞的亚细胞结构，如线粒体、内质网和高尔基体等细胞器的详细形态。
还可以研究细胞和组织中的超微结构、蛋白质聚集和聚体、核糖体和核纤维等。
透射电镜也能够帮助科学家研究细胞和组织中的病理变化和与疾病相关的结构异常。
例如，可以观察到病毒的形态和复制过程，深入了解病毒感染的机理。
同时，也可以通过透射电镜观察神经元的超微结构，帮助我们理解神经系统疾病的发病机制。
总之，透射电镜生物制样为生命科学领域提供了研究细胞和组织的有力工具。
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（Cs—透镜色差系数，ΔE/E—成像电子束能量变化率）
电磁透镜的特点：
可变倍率，可变焦距； 景深长，焦长长。
第一节
透射电子显微镜
电子光学系统 透射电子显微镜结构及成像原理 操作要点
Ernst Ruska （1906-1988）
1931年发明电子显微镜
1986年获诺贝尔物理学奖
第一台真正的电子显微镜（1933年Ruska）
× × × × × × × ×
× × × × × × × ×
× × × × × × F × × × × × × × × × ×
× × × × v × × × × × × × × × × × ×
× × × × × × × ×
B
Vy V。
Vx
Vx=V。Cosθ V。 Vy=V。Sinθ
磁透镜——具有轴对称弯曲磁场的装置 构成的电磁透镜
思考题
1. 什么是分辨率？为什么电镜的分辨率比 光镜高？ 2. 透射电镜是如何成像的？（成像原理） 3. 透射电镜图像不清晰的原因有哪些？
第一章
透射电子显微镜
电子光学系统 透射电子显微镜结构及成像原理 操作要点
透射电镜操作要点
1. 2. 3. 高压、电流的稳定（电镜厂家） 排除外界场地磁场、电场、振动等因素（厂商安装） 灯丝对中、光路对中（聚光镜光阑等）（工作人员）
电镜观察人员必须掌握的操作 1. 样品的更换 2. 打开灯丝电流以及灯丝饱和点的调节 3. 样品感兴趣区的寻找、放大倍数的调节（中间镜） 4. 亮度的调节（聚光镜） 5. 物镜光阑的选择与对中 6. 像散的消除 7. 焦距的调节（物镜） 8. CCD照相 9. 数码图片的保存。
成像系统
样品室 物镜 中间镜 投影镜
观察室（荧光屏） 照像机构（CCD）
观察纪录系统
透射电镜成像原理
Specimen Objective lens
Electron Bean
Aperture
非弹性散射； 物镜光阑； 电磁透镜的聚焦放大。
Image plane
透射电镜基本构造
冷、热场电子枪
λ=
12.25
U
加述电压
( KV )
电子波长 (A)
(经相对论校正)
1 2 5 10 20 30 40 80 100 500 1000
0.388 0.224 0.173 0.122 0.0859 0.0698 0.0601 0.0418 0.0370 0.0142 0.00687
B
× × × × × × × ×
电子光学系统 透射电子显微镜结构及成像原理 操作要点
透镜成像原理
A
F B B’
F
o
A’
Z
L1 1 1 1 + = L1 L2 f
f
L2
A’B’ L2 M= = AB L1
A
A’
Ra
Airy斑
0.61λ Ra= M nSinα
r
A B
R r= M
B’
R
A’
δ
A B
分辨率是指能够 区分两个质点圆 心间的最小距离。 Ra δ= M =
-1
场发射 热场发射 ZrO/W<100> 0.1—1 1800 0.6—0.8 100 稳定 不需要 5×108 10-7 3—4 年 较贵 冷场发射 W<310> 0.01—0.1 300 0.3—0.5 20—100 不稳定 需要 5×108 10-8 约 5年 较贵
钨灯丝 W 50 2800 2.3 100 稳定 不需要 5×105 10-3 几个月 20
Vz=Vo.conθ
德国实验物理学家Busch，1926
Vr=Vo.sinθ
A’ B’ L2 M= = AB L1
1 + 1 = L1 L2
1
f
磁透镜的缺陷—
几何像差
由透镜磁场几何上的缺陷引起的
像差
色差
由电子波长或能量非单一性引起的
磁透镜的缺陷—
球差
几何像差
像差
像 散 像畸变 色差
由电子波长或能量非单一性引起的
单色器 聚光镜球差校正 电制冷100mm2 环境透射电镜(E-TEM) 物镜球差校正 聚光镜 电子枪
鲁斯卡（1939）
照明系统 Illumination System
能谱仪
物镜 中间镜 成像系统 Imaging System
电镜的原位观察 (电、磁、力等)
投影镜
CCD相机
照相系统 能损谱或能量过滤器
1938年Siemens和Halske仪器 样机（Ruska，Borries）
1939年“第一系列”电子显微镜 （100A）
战后第一台Siemens仪器， 1950UM-100型
1954年，著名的Elmiskop Ⅰ （10A）
电镜不同于光镜的特点：
光源 电镜 光镜 电子束 可见光 成像透镜 电磁透镜 玻璃透镜
成像系统
样品室 物镜 中间镜 投影镜
观察室（荧光屏） 照像机构
观察纪录系统
电 子 发 射 量
b
a
灯丝电流
灯丝电流达到饱和点是获得高质量图像的必要条件
各种电子枪的比较
热电子发射 电子枪种类 光源尺寸(µ m) 发射温度(K) 能量发散度(eV) 束流 束流稳定度 闪光处理(flash) 亮度(A· -2· cm str ) 真空度 使用寿命 电子枪费用(US$)
六硼化镧 LaB6 10 1800 1.5 20 较稳定 不需要 5×106 10-5 约1年 1,000
电子枪寿命：日本电子电子枪稳定、寿命长是显著特点之一（枪室的真空度高是原因之一） 200keV = 200,000eV ± 2.3eV; 200,000eV ± 0.3eV
电子光学系统 阴极（灯丝） 电子枪 栅极 照明系统 阳极 聚光镜
JEM-ARM1250超高压透射电子显微镜
第二节 TEM的结构与成像原理
电子光学系统
真空系统
电子学系统
高压发生器
电子学系统
稳压、稳流电路
自动控制线路 前级真空泵（机械泵）
真空系统
油扩散泵/离子泵/分子泵 真空管道及自动阀门系统 真空检测系统
电子光学系统 阴极（灯丝） 电子枪 栅极 照明系统 阳极 聚光镜
生物电子显微镜技术
The Biological Electron Microscopy
透射电子显微镜
扫描电子显微镜
透射电镜及制样设备
扫描电镜及制样设备
当前生物电镜应用的主要方向：
• 生物微结构形态研究 • 生化物质元素分析
• 结构生物学
第一章
透射电子显微镜
球差
最小散焦斑 P
ac
b
Δrs=1/4 Csα （Cs—球差系数， α—磁透镜的孔径半角）
物镜球差校正前光学衍射图(ODM)
光学衍射图是分别在电子束倾斜9mrad和18mrad情况下得到的
球差的校正过程
物镜球差校正后光学衍射图(ODM)
光学衍射图是分别在电子束倾斜9mrad和18mrad情况下得到的
像畸变
枕形畸变像
桶形畸变像
旋转畸变像
桶形畸变像 旋转畸变像 枕形畸变像 理想像 理想像
像散
弱聚焦方向
强聚焦方向
像散散焦斑
z
ΔrA=ΔfA α
ΔfA—由透镜磁场非旋转对称性产生的焦距差；
电磁消像散器原理
s
N N
s
N
N
s
s
s
N
N
s
N
N
s
s
色差
E电子轨迹 E-ΔE电子轨迹
z
色差散焦斑
.α ΔE Δrc=Cs
18%
B’
A’
0.61λ
nSinα
Ra
分辨率的理论极限
德国 Ernst Abbe
Ra δ= M
n=1.4~1.6 。 α= 90
=
0.61λ nSinα
≈
1 2
λ
第一节、电子光学系统
二、电子的波性及波长
h λ= mv
1 Mv2 = eU 2
V=
2eU m
λ=
h
2emu
h=6.62×10-34 J.S e=1.60×10-19 C m=9.11×10-31 Kg