巨噬细胞高糖培养液促进肾小球系膜细胞增殖

度为 12. 5 mol/ L 于 37 ℃,5 %CO2 培养箱中培养 24 h 。取此上清液按照大鼠 T NF2 α E LISA 试剂盒说明 书进行操作 , 采用 curveExpert1. 3 制作标准曲线 , 并求出回归方程 , 结果见表 3 。
表2 巨噬细胞的高糖培养液对肾小球系膜细胞 增殖的影响 ( � x ±s)
[与的因 素更多 , 如何确切的演绎高糖 - 巨噬细胞 - 系膜 细胞病理变化 ,还需要深入研究 。
± 0. 6 ± 0. 6 ± 1. 2 ± 0. 5 ± 2. 9
注 : 与 5. 5 mol/ L 葡萄糖组相比 , 3 P < 0 . 05 , 3 3 P < 0. 01 。
由以上结果可见 ,12. 5 ～ 50 mol/ L 高浓度的 葡萄糖体外作用 24 h 、 48 h 均能刺激大鼠腹腔巨 噬细胞产生 NO 。100 mol/ L 的葡萄糖体外作用 4 h 能使大鼠腹腔巨噬细胞产生 NO 显著增加 ,由于 葡萄糖浓度过高 ,4 h 后抑制大鼠腹腔巨噬细胞产 生 NO 。本文采用 12. 5 mol/ L 的葡萄糖作用巨噬 细胞 24 h 作为工作条件 。 3. 2 大鼠巨噬细胞高糖环境下 ,其培养体系的上 清对系膜细胞增殖的影响 大鼠肾小球 系膜细胞以 5 ×104 个 / mL 的浓 度种入 96 孔细胞培养板于培养箱中培养 , 细胞贴 壁后 ,用不含血清的 DME M 饥饿 24 h , 吸弃上清 , 对照 组 用 低 糖 DMEM 培 养 , 葡 萄 糖 终 浓 度 为 5. 5 mol/ L ; G lucose 组加入葡萄 糖 , 使葡 萄糖终浓 度为 12. 5 mol/ L ; Supernate 组加入巨噬细胞上清 (12. 5 mol/ L 的葡萄糖作用下的巨噬细胞上清 ) 。 于 37 ℃ ,5 %CO2 培养箱中培养 24 h 。结果见表 2 。 结果 :巨噬细胞在 12. 5 mol/ L 葡萄糖环境下培养 的上清有促进系膜细胞增殖的作用 ( P < 0. 01) 。 α 的释放 3. 3 高糖作用下巨噬细胞上清中 TNF2 大鼠巨噬细胞以 2. 5 × 106 个 / mL 的 浓度种 入 24 孔细胞培养板 , 4 h 后加入葡萄糖使其终浓
[3]
量的多少。 2. 3 统计学处理 以 t 检验进行统 计学处理 , 数据以 � x ±s 表 示。 3 结果 3. 1 高浓度葡萄糖对正常大鼠巨噬细胞释放 NO 的影响 大鼠巨噬细胞 以 2. 5 × 106 个/ mL 的 浓度种 入 24 孔细胞培养板 ,4 h 后加入不同浓度的葡萄 糖。 葡 萄糖终 浓度分别 为 5. 5 、 12. 5 、 25 、 50 、 100 mol/ L 于 37 ℃ ,5 %CO2 培养箱中培养。结果见表 1。
1
48 h 26. 0 ± 0. 7 29. 2 ± 1. 1 3 3 34. 0 ± 3. 5 3 33. 5 ± 1. 4 3 3 24. 3 ± 0. 9 3
72 h 26. 3 ± 2. 3 26. 3 ± 0. 9 32. 1 ± 4. 1 29. 8 ± 4. 4 25. 7 ± 1. 0
Glucose/ mm ol L 5. 5 12. 5
1
TNF2 α / pg m L15. 9 ± 1. 5 24. 3 ± 3. 6 3
3
1
注 : 与低糖组相比 , 3 3 P < 0. 01 。
由以上结果可见 ,12. 5 mol/ L 的葡萄糖作用 α 量显 著增加 ( P < 24 h 的巨噬细胞上 清中 T NF2 0. 01) 4 讨论 资料表明 ,巨噬细胞与 DN 的发生 、 发展关系 密切 。Sassy 等发现 , 在 DN 早 期 , 肾小 球有大量 的巨噬细胞浸润 , 同时有 MCP21 的高度表达 [ 4 ] 。
[1]
1. 3 仪器 XSZ 2D2 倒 置显微 镜 , 重庆 光 学仪器 厂 ; CO2 培养 箱 , NAPC05410 , PERCISION SCIENTIFIC ; Mi2 croplate Spectrophotometer , SPECTRA max190 , 美 国 AD 公司 。 1. 4 细胞株 大鼠肾小球系膜细胞株 HBZY21 ,由武汉细胞 生物研究所提供 。 2 方法 2. 1 大鼠巨噬细胞的获取及分泌 NO 的测定 [ 2 ] 大鼠脱颈 椎处死 , 用 75 % 的酒精浸泡 , 腹腔 注射 D2Hanks 缓冲液 1～2 mL , 轻揉 50 次 ,吸出腹 腔液 ,并反复洗 , 得到的腹腔液用 D2Hanks 缓冲液 离心洗 3 次 , 若有红细 胞 , 用 0. 83 %NH4Cl 溶 解。 得到的细胞用 RPMI1640 培 养液 ( 含 10 % 小牛血 清 , 青霉素 100 U/ L ,链霉素 100U/ L) 调整为 2. 5 × 106 个 / mL 的 浓度 , 接 种 ,37 ℃,5 %CO2 的条 件下 孵育 ,2 h 后 , 洗去未贴壁的细胞 , 重新加入培养液 继续培养。 按前述方法获取大鼠腹腔巨噬细胞 , 用含有 10 %小牛血清的 RPMI1640 培养液 ,37 ℃ ,5 %CO2 的培养箱内培养 , 培养上清液测定从巨噬细胞释 放的一氧化氮代谢产物亚硝基的含量 :取上清液
王琼 ,等 : 巨噬细胞高糖培养液促进肾小球系膜细胞增殖 第2期
— 1 17
—
在 DN 早期 , 巨噬细胞在糖尿病肾病的病理环节 中扮演一个什么样的角色 , 是研究糖尿病肾病工 作者关心的问题 。本文通过体外观察高糖作用下 的巨噬细胞上清对系膜细胞的影响 , 试图分析巨 噬细胞在高糖 - 系膜细胞这一病理环节中地位。 巨噬细胞在含 12. 5 mol/ L 葡萄糖培养液中培 养 24 h , 其培养液明显促进系膜细胞的增殖 , 而系 膜细胞的增殖是糖尿病肾病的病理特征之一 。本 文检测到使系膜细胞增 殖的巨噬细 胞培养液中 α 显著增加 。NO 、 α 等巨噬细胞因子 NO 、 T NF2 TNF2 可能就是促使系膜细胞增殖的直接因素 。本文的 结果提示 ,糖尿病早期除了严格控制血糖外 ,采用 α等抗炎治疗 , 也是控制肾病并发症的重 抗T NF2 要措施 , 这一看法得到了 Han SY 的支持 。高糖 环境下巨噬细胞释放因子非常复杂 , 因此要分析 巨噬细胞释放的因子及 其与系膜细 胞增殖的关
。巨噬细胞是机体非特异性免疫的重要
组成部分 ,同时在特异性免疫应答的各个阶段也 起重要作用 。目前 DN 发病机制尚未明 确 , 巨噬 细胞在 DN 中的作用逐渐受到关注 。本文观察了 体外高糖环境下的巨噬细胞上清对系膜细胞的影 响 , 试图探讨糖尿病肾病的发病早期巨噬细胞在 高糖 - 系膜细胞对话中的作用 。 1 材料 1. 1 动物 SD 大鼠 ,180～220 g ,上海斯莱克实验动物责 任有限公司 , 合格证号 :SCXK( 沪 ) 200320003 。 1. 2 试剂 DMEM( GIBCO) , Invitrogen Corporation ;对氨基 苯磺酸 , 中国普桥化工技术研究所 , 批号 :980412 ; N212萘乙二胺盐酸盐 ,浙江永嘉试剂厂 , 上海化学 试剂公司分 装 ,960012 ; Thiazolyl 噻唑蓝 ,Amresco 分装 ,怡成生物 ,0263 ; E LISA KIT,Rat T NF2 α , 晶美 生物工程有限公司 ,lot : 20050915 。
摘要 :目 的 分析高糖环境下巨噬细胞释放的因子在糖尿病肾病病理环节中的意义 。方法 Griess 法检测高糖作 用下的 巨噬细胞上清中 NO 的含量 ; ELISA 法检测条件培养液中 TNF2 α的含量 ;MTT 法检测肾小球系膜细胞的增殖 。结果 12. 5 α量显著增加 ( P < 0. 01 ) 。 ～50 mol/L 高浓度的葡萄糖体外作用 24 h 、 48 h 均能刺激大鼠腹腔巨噬细胞产生 NO ;TNF 2 大鼠 巨噬细胞在含 12. 5 mol/ L 葡萄糖的 DMEM 培养液中培养 24 h ,其上清明显促进系膜细胞增殖的 ( P < 0. 01) 。结论 高糖 环境中巨噬细胞释放 NO ,其上清液中 NF2 α量显著增加 ( P < 0. 01) 等细胞因 子 ,含 有这些因 子的细 胞培养液 明显促 进系 膜细胞增殖 ,提示高糖环境下的巨噬细胞是糖尿病肾病的发病的主要病理环节 。 关键词 : 葡萄糖 ; 巨噬细胞 ; 糖尿病肾病 中图号 :R587. 1 文献标识码 :A 文章编号 :1000 - 5005 (2007) 02 - 0115 - 03
组别 对照组 G l ucose 组 Supernate 组 λ= 490nm) OD (
0. 14 ± 0. 01 0. 15 ± 0. 01 0 . 24 ± 0. 02
3 3
注 : 与对照组相比 , 3 3 P < 0. 01 。
表3 高浓度葡萄糖对大鼠腹腔巨噬细胞释 放 TNF2 α的影响 ( � x ±s ) 组别 低糖组 高糖组
取出细胞培养板 , 先以倒置显微镜下观察 ,再 在每孔中加入 MTT 工作液 (2. 5 mg/ mL) 20 μ L ,于 细胞培养条件下孵育 4 h 后 , 吸弃孔内培养上清 液 , 并每孔加入 150 μ L 二甲亚砜 ( DMSO) 终止反 应 , 微型振荡器震荡 10 min , 使结晶物充分溶解 , 立即在酶标仪上波长 490 nm 处进行光密度定量 检测 ,以测得的光密度值 ( OD) 反应细胞活性和数
糖尿病肾病 (diabetic nephropathy ,DN) 是糖尿 病中最严重的慢性并发症 , 是导致终末期肾功能 衰竭的最常见病因。肾小球系膜细胞 ( glomerular mesangial cells , G MC) 是肾小球中最活跃的反应性 细胞 ,其病理变化在 DN 的发 生和发展中居于中 心地位
南京中医药大学学报 2007 年 3 月第 23 卷第 2 期